SẮC KÝ LỚP MỎNG(Thin layer Chromatography

SẮC KÝ LỚP MỎNG
(Thin layer Chromatography)


Mục tiêu bài học
Cơ chế chính trong SKLM

01
Ứng dụng của SKLM trong
nghành dược

Pha tĩnh và pha động trong

02

05

04
Các bước tiến hành trong SKLM

03

sắc ký lớp mỏng

Trang Thiết bị dùng trong SKLM


01

Định nghĩa & Giới thiệu

a)

o

Định Nghĩa

SKLM là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp phụ làm pha
tĩnh trải thành lớp mỏng trên tấm kính nhựa hay kim loại. Q
trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha động là dung mơi di
chuyển qua pha tĩnh. Do đó, SKLM thuộc sắc ký lỏng – rắn .


b)

o

 

Giới Thiệu

Năm 1938, Izmailoz & Scharaiber dùng bột oxyd nhôm() và bản
mỏng thủy tinh để phân tích dịch chiết alcaloid thực vật.

o

Cơ chế: hấp phụ chiếm phần lớn(có thể là phân bố hoặc kết hợp
cả hai)

o

Pha tĩnh: trương nở theo cả chiều dọc và chiều ngang( chủ yếu
là Silica gel)


o

Phương pháp SKLM

-Định tính.
-Phát hiện thành phần trong hỗn hợp, định tính điểm
chỉ.
-Định lượng (phải có chất chuẩn) hoạt chất thuốc.
-Theo dõi thành phần các chất.
-Phân lập các chất.
-Thử độ tinh khiết


02

Cơ chế tách trong SKLM

Hấp phụ
Phân bố, trao đổi ion

Sàng lọc phân tử

Rây phân tử

Có thể phối hợp đồng thời các cơ chế
trên, tùy thuộc vào tính chất chất

làm pha tĩnh và dung môi của pha
động.


03

Pha tĩnh

Khái niệm

Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng
yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất
và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại.


Silicagel( Kieselgel – gel của acid silicic)

o
o
 

Sử dụng rộng rải nhất.
Kích thước hạt 10 - 60 µm, diện tích bề mặt 200400 /�
.

o
o
o

Hoạt tính hấp phụ do –OH trên bề mặt quyết định.

Hàm ẩm tăng sẽ làm giảm hoạt độ
Hoạt hóa /1 giờ trước khi sử dụng.


Nhơm Oxyd

o
o
o
o

 

Oxyd nhơm trung tính, acid, base
Hoạt tính tùy thuộc lượng nước
Hoạt hóa /1 giờ trước khi sử dụng
Theo Brockman: 5 bậc oxyd nhơm

Bậc hoạt tính

I

II

III

IV

V

%nước

0

3

6

10

15


o

Xác định bậc hoạt tính của nhơm oxyd:
 

-Dựa vào của màu chuẩn
Bậc hoạt tính của oxyd nhơm theo Brockman
Bậc hoạt tính của oxyd nhơm theo Brockman
Chất màu
Chất màu

II
II

III
III

IV
IV

V
V

Giá trị
Aminoazobenzen
Aminoazobenzen

0,59
0,59

0,74
0,74

0,85
0,85

0,95
0,95

Sudan đỏ
Sudan đỏ

0,00
0,00

0,10
0,10

0,33
0,33

0,56
0,56

Sudan
Sudan vàng
vàng

0,01

0,25

0,57

0,78


Kieselguhr

o
o
o
o
o

 

Bột nhẹ, vàng xám chứa 70-95% Si
Chất hấp phụ yếu
Tách các chất phân cực: cetoacid, lacton,...
Chất mang pha tĩnh trong sắc ký phân bố
Kieselguhr-silicagel hay kieselgur-thạch cao(1:1)
Điều chế bằng cách trộn dung dịch CaCl₂ và H ₂O với tỷ lệ đồng phân tử
Thạch cao
Cellulose

Khơng cần chất kết dính, tách các chất thân nước

Polyamid

Tách các phenol

Nhựa trao đổi ion

Silicagel sulfon hóa


Chất hấp phụ đã được tiêu chuẩn hóa:

o
o
o

Chất hấp phụ có chất kết dính: Silicagel G (Gypseum), Kieselguhr G, Oxyd nhôm G trộn sẳn 5% thạch cao.
Chất hấp phụ không chất kết dính: Silicagel H, Oxyd nhơm H
Chất hấp phụ có thêm chất chỉ thị huỳnh quang: Silicagel GF₂₅₄, Silicagel HF₂₅₄,...
- Bản sắc ký tráng sẳn với giá đỡ là tấm thủy tinh, nhôm và polymer

- So sánh với bản mỏng thủ cơng thì bản mỏng trán sẳn có độ ổn định cơ học cao, thao tác đơn giản dễ dàng hơn,
tính đồng nhất cao và hiệu lực tách cũng cao hơn.


Bảng các chất hấp phụ của pha tĩnh


04

Pha động

Khái niệm

Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định
trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp
mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau.
Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng.


Về đặc điểm pha động:

o
o
o
o
o

Thay đổi tùy theo cơ chế tách
Tăng cường sức rửa giải: thường kết hợp 2 dung mơi
Khơng có qui tắc cụ thể để lựa chọn dung mơi

Sắc ký sơ bộ để thăm dị hệ dung mơi
Nên chọn hệ dung môi đơn giản và dung loại tinh khiết


Hướng dẫn lựa chọn pha tĩnh và pha động:

o
o
o
o
o
o
 

Tính chất của mẫu phân tích: độ hịa tan, độ phân cực, số lượng và đặc tính các nhóm chức
Cơ chế sắc ký của pha tĩnh
Dung môi: độ bay hơi, độ nhớt, độ tinh khiết, sự phân lớp
Chất phân tích ion hay phân cực: dung môi phân cực như butanol- nước, thêm acid silicagel
Các chất hấp phụ phân cực khác: độ phân cực pha động quyết định tốc độ di chuyển và
Điều chỉnh sức rửa giải của pha động để : 0,2-0,8 đạt độ phân giải cực trị


Một số nhóm chức có khả năng hấp thụ tăng dần:
CH=CH < OCH < COOR < C=O < CHO < SH < NH < OH < COOH
3

2

Dung môi với sức rửa giải( sức dung môi) tăng dần:

05

Bản mỏng

Trang thiết bị

Bản mỏng dính chắc: Chất hấp phụ
được

trộn

thêm

5-15%

chất

kết

dính(thạch cao, tinh bột, dextrin)

Bản mỏng khơng dính chắc: Rãi bột có hoạt độ thích
hợp lên để bám dính và trải đều với một đũa thép hai
đầu dày khoảng 0.5-1mm hoặc một đũa thủy tinh hai
(cm)

5x20

10x20

20x20

đầu luồng hai đoạn ống cao su(silicagel H, oxyd nhôm
H).


Bình sắc ký

Các loại bình sắc ký như: Bình đáy trịn, vng, hình chữ nhật


06

Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM

1. Chuẩn bị bản mỏng, bình sắc ký
thích hợp, pha động

2. Chấm dung dịch lên bản
mỏng: 1-10µg


3. Khai triển sắc ký

Ví dụ: Sắc ký lớp mỏng được áp dụng cho một phần lá xanh (ở đây là rau chân vịt) qua 7 bước. Carotene tách ra nhanh
chóng và chỉ quan sát được cho đến bước 2. Chlorophyll A và B hiện rõ ở giữa bản sắc kí trong bước cuối cùng và lutein là
hợp chất đầu tiên nhuộm màu vàng lên bản sắc ký.

4. Phát hiện các vết trên bản mỏng

•
•
•

Màu sắc tự nhiên của vết
Phun thuốc thử hiện màu
Soi dưới đèn UV 254 hoặc 365nm: thêm chất huỳnh
quang không tan vào pha tĩnh

•

Dùng máy đo mật độ quang (desitometer): do cường
độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dưới đen UV.
Chất phân tích hấp thụ bức xạ được ghi lại thành pic sắc
ký


Thuốc thử hiện màu


07

 

Thông số đặc trưng của TLC

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số lưu giữ được tính
bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất cần tách và khoảng dịch chuyển của dung mơi.

 

: chất tan hồn tồn khơng di
chuyển, nằm tại điểm xuất phát

 

 

: chất tan di chuyển cùng
với vận tốc của dung môi


Công thức
Khoảng di chuyển của chất
Hệ số lưu giữ (chỉ có giá trị từ 0 đến

cần tách
Vận tốc di chuyển của chất cần

1)

tách
 

Khoảng di chuyển của dung mô i

Vận tốc di chuyển của dung môi