PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT ( TI – PLASMID )

Đề tài:

PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO
THỰC VẬT ( TI – PLASMID )

NHÓM THỰC HIỆN : 05
DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM.

I.

HỌ VÀ TÊN

MSV

LỚP

Lê Thị Hương

571935

K57KED

Bùi Ngọc Thảo

601244

K60QLTP

Vũ Thị Dung

591360

K59CNSTHA

Trần Thị Hằng

591779

K59QLTP

Nguyễn Thị Thanh Duyên

591771

K59CNTPC

Phetmany Buonkimvanh

600961

K60CNSTHA

Peng Sakhovang

600960

K60CNSTHA

Phan Thị Phượng

604919

K60QLTP

MỞ ĐẦU.
Việc sử dụng một khối lượng lớn nhiên liệu hoá thạch giúp chúng ta có
được đời sống tiện nghi và hạnh phúc nhưng cũng dẫn đến sự trả giá đắt như hiện
tượng ấm lên tồn cầu, sự ơ nhiễm và hủy hoại môi trường. Do nhiều điều kiện bất lợi
của môi trường như sự nhiễm vi khuẩn, virus, các loại côn trùng, sự nhiễm mặn, khô
hạn, nhiệt độ cao, … Ngay ở Mỹ, sản lượng nơng nghiệp giảm hơn ¼ so với tối đa
theo lý thuyết. Ngày nay, các loại cây trồng kháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ
cỏ đã được tạo ra bằng việc áp dụng chuyển các gen mong muốn vào thực vật, đã
mang lại những cải thiện quan trọng trong năng suất. Các gen cải thiện sự tăng trưởng
của thực vật trong môi trường axit hoặc kiềm và đất nhiễm mặn đã được cô lập. Cây
trồng chuyển gen là sự thay thế có hiệu quả, vì chúng có thể biểu lộ nhiều loại prtein,


cũng như thực hiện các thay đổi cần thiết để các loại prơtêin đó hoạt động. Hệ thống
cây trồng cũng ít khi chứa các loại vi khuẩn có thể là nguồn bệnh đối với động vật.
Thị trường hóa cây biến đổi gen trong nơng nghiệp. Cho đến năm 1999,
diện tích gieo trồng trên thế giới đạt hơn 40 triệu ha. Trong đó 20% là ngơ, 50% là đậu
tương và 1/3 diện tích bơng là ở Mỹ. Ngồi ra có hơn 70% diện tích cải dầu ở Canada
được trồng với giống biến đổi gen. Khoảng 90% thực vật biến đổi gen chống chịu
thuốc diệt cỏ hoặc sâu bệnh hại. Cần chú ý rằng, ở Mỹ sản phẩm đậu tương có trong
hơn 20.000 loại thực phẩm khác nhau. Điều này cho thấy rằng, công nghệ gen đã ảnh
hưởng đến sản xuất thực phẩm của chúng ta.
Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và mô
động vật và thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm
(microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen. Các phương pháp phức tạp và
hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc
phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn, chuyển gen bằng súng bắn gen.

Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển
gen phù hợp. Nhiều nhà khoa học tin rằng chuyển gien cây trồng là cách hiệu quả hơn và rẻ
tiền hơn để sản xuất vaccine và thuốc hàng loạt.

Lịch sử phát triển công nghệ gen của thực vật chắc chắn có rất nhiều sự
kiện quan trọng. Ở đây là mốc có ý nghĩa đặc biệt nhằm làm rõ sự phát triển rất nhanh
của lĩnh vực này.
Đó là, vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens được sử dụng làm phương
tiện vận chuyển DNA. Bình thường vi khuẩn này tạo nên khối u ở thực vật. Một phần
nhỏ của Ti-plasmid có trong vi khuẩn này, được gọi là T-DNA, được vận chuyển từ
Agrobacterium vào cây hai lá mầm. Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai
(transposon Tn7) được chuyển vào thực vật nhờ A. tumefaciens, tuy nhiên T-DNA vẫn
chưa được thay đổi. Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và đưa
DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng sinh. Ngoài ra, các gen tạo
khối u được cắt ra. DNA ngoại lai cùng với phần còn lại được chuyển vào thực vật và
được biến nạp. Thành công này nhờ nghiên cứu chính xác con đường lây nhiễm của A.
tumefaciens trước đó và khả năng của hệ thống chọn lọc đối với thực vật.
Điều này cho thấy ngay từ những năm 80 của thế kỷ 20 kỹ thuật chuyển gen
gián tiếp thông qua vi khuẩn đã được thực hiện và cụ thể là thông qua Ti-Plasmid. Để
làm rõ hơn vấn đề này nhóm chúng em đã quyết định tìm hiểu về kỹ thuật chuyển gen
gián tiếp thông qua Ti-plasmid.
II.

NỘI DUNG.

I.1. Sơ lược về plasmid:
I.1.1. Khái niệm.


Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, là phân tử DNA kép, có kích

thước từ 1 đến 200kb. Plasmid chỉ sinh sản được trong tế bào vi khuẩn, có khả năng tự
nhân đơi và di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác.
Vector chuyển gen là các phân tử DNA dạng vòng mang đoạn gen cần biến nạp,
có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn kí chủ và sử dụng bộ máy tổng hợp của tế
bào kí chủ để tạo ra nhiều bản sao giống vector ban đầu.
I.1.2. Cấu trúc của một vector chuyển gen:
+Có 1 đoạn AND khởi động (promoter). Đây là một đoạn ADN có liên quan và
cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã. Nó thường có một vị trí bám cho enzym ARN
polymeraza, một điểm khởi đầu phiên mã, và một số vị trí bám khác của các protein
điều khiển / điều hồ q trình phiên mã.
+Có một đoạn ADN kết thúc (terminator). Đây là đoạn ADN cần thiết cho sự kết
thúc của q trình phiên mã và giải phóng phân tử mARN khỏi sợi khuôn ADN. Đoạn
kết này thường có một trật tự tín hiệu polyadenin, như AATTAA hoặc AACCAA, giúp
cho phân tử mARN bền vững hơn.
+ Một đoạn AND chịu trách nhiệm cho quá trình tái bản, thường có nguồn gốc vi
khuẩn. VD: E.coli
+ Một đoạn ADN chứa các trật tự nucleotid đặc trưng cho sự nhận biết của các
enzyme giới hạn, thường ký hiệu là MCS (multi-cloning sites). Nhờ đoạn ADN người
ta có thể dùng enzym giới hạn đặc hiệu để cắt và tái tổ hợp phân tử ADN của véctơ với
đoạn ADN mang gen cần biến nạp
+ Vùng chứa gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter
genes).
I.2.

Ti-plasmid.
Là một vector chuyển gen có kích thước lớn. “Ti” là viết tắt của “Tumour
inducing” tức là gây ra khối u.
• Cấu trúc của Ti-plasmid.
Ti plasmid là một phân tử ADN vòng tương đối lớn, gồm 150.000-200.000 cặp
nucleotit. Ti-plasmid gồm 5 vùng:

 T-DNA (transferred DNA) - một đoạn gen gồm 20.000-30.000 cặp nucleotit có khả
năng thâm nhập vào bộ genom của tế bào chủ. T-ADN có chứa các gen gây ra sự sinh
trưởng vô điều khiển của các tế bào thực vật. Đó là các gen mã hố auxin và cytokinin
gây ra sự sinh sản vơ tổ chức của tế bào bị nhiễm.
 Đoạn vir (virulence) là nơi có các gen sản xuất protein cần cho sự biến dạng của tế bào
thực vật, chịu trách nhiệm chuyển nạp đoạn T-ADN từ plasmid vào trong genom của tế
bào chủ để Ti-plasmid có thể thâm nhập.


 Vùng tái bản: ORI- vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản giúp gên
được nhân lên trong tế bào.
 Vùng tiếp hợp: CON- vùng mã hóa chức năng tiếp hợp.
Ti plasmid được tìm thấy trong tất cả các dịng A.tumefaciens gây độc. Chúng
được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30 độ C.
• Cơ chế hoạt động của vi khuẩn).
Vi khuẩn A. tumefaciens không sản xuất được một số acid amin như octopin,
nopaline. Để tồn tại, nó chuyển gen của nó vào thực vật. Ti - plasmid mang các gen
tổng hợp IAA, các amino acide như octopine hay nopalin để giúp cho vi khuẩn phát
triển. Trong Ti-plasmid octopine, locus tms mã hóa một enzyme liên quan đến hệ
thống cytokinin và sự đột biến ở đây dẫn đến sự tăng sinh rễ từ các khối u hình chóp
đã gây ra ở một số loài (các thể đột biến rễ). Các locus tms 1 và tms 2 liên quan đến sự
tổng hợp không điều hòa của auxin và sự đột biến một trong hai locus gây nên sự tăng
sinh chồi từ các khối u hình chóp ở nhiều loại thực vật (các thể đột biến chồi). Vì vậy,
T-DNA mang các gen (tms 1, tms 2 và tmr) mà sản phẩm của chúng không chịu sự
điều hịa bình thường của các con đường chuyển hóa thực vật liên quan đến sự tổng
hợp phytohormone và điều này gây ra kiểu hình ung thư. Do đó các gen tms 1, tms 2
và tmr được xem là các gen ung thư. Trong quá trinh cộng sinh này, vi khuẩn cũng
chuyển các gen tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi
khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thực vật.
I.3. Quá trình chuyển nạp gen của vi khuẩn.

I.3.1. Thiết kế Ti - plasmid mang gen biến nạp.

Để có thể tiến hành chuyển gen vào tế bào thực vật, đầu tiên ta cần có một
đoạn DNA mã hóa cho một tính chất nổi trội của thực vật ( gen biến nạp) được
lấy từ một tế bào thực vật. Thứ 2, ta cần một vòng plasmid ( vector chuyển
gen), tuy nhiên tại phương pháp này ta sẽ sử dụng Ti – plasmid của vi khuẩn
Agrobacterium làm vector chuyển gen.
T – DNA được cắt ra từ đoạn gen nhờ ezyme đặc hiệu, enzyme cắt giới hạn
A. Ti – plasmid cũng được enzyme cắt giới hạn cắt vùng T - DNA. Sợi đơn của
T-DNA được giải phóng và kết hợp với protein, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai được
tổng hợp bổ sung lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid. Sợi T-DNA tự do được
vận chuyển vào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-protein.


I.3.2. Nhân vòng vector nhờ vi khuẩn E.coli.
E.coli là tế bào chủ căn bản của kĩ thuật chuyển gene. Nó là sinh vật chuẩn để tạo
dòng gen (cloning gens) của bất kỳ sinh vật nào. E. coli được coi là tế bào vật chủ đơn
giản nhất trong công nghệ gen. Vi khuẩn E. coli dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector
chuyển gen như plasmid hay phage qua biến nạp hay tải nạp.
Sau khi chuyển gene của tế bào cho vào thể chuyền plasmid ta cấy vào vi khuẩn
e.coli để nhân lên với số lượng lớn.
Biến nạp plasmids chứa ADN chưa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coli.


I.3.3. Chuyển vector mang gen biến nạp từ E.coli sang A. tumefaciens.
Tế bào vi khuẩn có khả năng hấp thụ DNA tự nhiên, ngay cả DNA của tế bào đã
chết. Dựa trên sự thay đối tính thấm của màng tế bào làm cho DNA có thể xâm nhập
vào trong tế bào.
Vector trans hoặc vector nhị thể được dựa trên các plasmid có thể tái bản ở cả
E.coli và Agrobacterium, và các plasmid này có chứa các trình tự biên của T-DNA.

Các vector này có thể được thiết kế sao cho các trình tự biên cạnh MCS ( Multicloning
site – trình tự tạo dòng) cho phép xen DNA ngoại lai vào và các marker cho phép chọn
lọc trực tiếp các tế bào thực vật đã được biến nạp. Plasmid có thể được thao tác ở trong
E.coli và được chuyển vào qua sự tiếp hợp với các dịng Agrobacterium mang plasmid
có chứa vùng vir nhưng thiếu T-DNA và các trình tự lặp 25 bp. Các plasmid như thế
thường là các thể đột biến mất đoạn đơn giản của Ti-plasmid octopine kiểu dại hoặc
kiểu nopaline . Việc chuyển DNA ngoại lai trên vector tạo dịng vào tế bào thực vật có
thể được thực hiện do hoạt động chức năng của vùng vir.
pBin19 là một vector nhị thể phổ biến dựa trên đơn vị tái bản (replicon) vật chủ
mở rộng của pRK252 . Vì vậy nó có thể tái bản trong cả E.coli và Agrobacterium, cho
phép xen DNA ngoại lai vào vector và sàng lọc trong E. coli trước khi chuyển vào
Agrobacterium. Vector này chứa marker kháng kanamicin (K mr ).
Sự xâm nhập của pBin19 vào A.tumefaciens LBA4404 sử dụng plasmid hỗ trợ
pRK2013 và sau đó loại bỏ plasmid hỗ trợ trong Agrobacterium.


I.3.4. Quá

vi

trình
khuẩn

A.grobacterium chuyển plasmid vào tế bào thực vật.
Khi tế bào trên thân cây bị tổn thương, các tế bào tổn bị thương tiết ra hợp chất
thu hút các tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens. Các tế bào vi khuẩn không
thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển nạp vào chúng một loại plasmid đặc hiệu
gây nên tình trạng khối u. Con người lợi dụng tính chất này của Agrobacterium để
chuyển gen vào tế bào thực vật.
• Quá trình chuyển T- ADN từ plasmid vào gen nhân thực vật.

Đầu tiên là sử dụng enzyme cắt để hình thành một vết đứt tại vị trí vùng bờ
phải của đoạn T- AND. Đoạn gen này sau đó được tách ra khỏi plasmid nhờ sự
hình thành một đoạn đứt thứ hai ( Đoạn đứt này thường không cố định đối với
những plasmid khác nhau).
Trong khi các axid nucleic trống tạo ra trên plasmid được lấp đầy theo
nguyên tắc bổ sung của các axid nucleic thì đoạn T- ADN được tách ra được


bám bởi một protein bám sợi đơn (SSBP). Nhờ phức hợp với SSBP này mà đoạn
gen T- ADN được chuyển vào nhiễm sắc thể của cây chủ.

I.3.5. Chọn lọc các mơ, tế bào được chuyển gen thành cơng.

Có rất nhiều phương pháp để chọn lọc các mô tế bào, nhưng phương pháp
gen chỉ thị thường được sử dụng trong chuyển gen vào tế bào thực vật.


Xác nhận sự biểu hiện của luciferase, cơ chất là luciferin, phản ứng này
phụ thuộc vào ATP. Ánh sáng tạo nên từ phản ứng được định lượng bằng máy.

Xác nhận sự biểu hiện của β-D-glucuronidase, cơ chất nhân tạo là 5bromo-4-chlor-3-indoyl-β-glucuronid (X-GlcA), chất này được thủy phân nhờ
glucuronidase. Bằng sự oxy hóa xuất hiện một chất indigo màu xanh. Người ta
có thể sử dụng các chất khác thay thế X-Glc, mà sản phẩm thuỷ phân là chất
màu phát quang.
I.4.

Ứng dụng của phương pháp chuyển gen trong thực tế.
Hiện nay Mỹ đang là quốc gia đang đứng đầu trong việc đưa cây biến đổi gen
vào sản xuất chiếm tới 59%, ngoài ra còn một số quốc giá khác như Argentina chiếm

20%, Canada 6,7%, Brazi 6%, Trung Quốc 4,6%. Ở châu Á, cây trồng biến đổi gen
chủ yếu là bông, được trồng nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines và Indonesia.


Có 4 loại cây trồng biến đổi gen được thương mại hóa mạnh nhất. Đó là: đậu tương
kháng thuốc diệt cỏ, ngô kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu, bông kháng thuốc diệt cỏ
và kháng sâu và cải dầu kháng thuốc diệt cỏ. Ngoài 4 loại cây trồng biến đổi gen chính
đã được thương mại hóa rộng rãi nói trên, cịn có hàng loạt các cây trồng biến đổi gen
khác như kháng nấm, kháng virus, chín chậm... cũng đã và đang được phổ biến.
Ứng dụng chuyển gen qua nách là mần ở đậu tương.
Đậu tương đầu tiên được chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua A.
tumefaciens lây nhiễm vào nách lá mầm tổn thương trong nuôi cấy in vitro.

Sơ đồ các bước tiến hành và phương pháp phân tích cây chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nói chung và chuyển gen ở cây đậu tương nói
riêng được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được dung hợp vào hệ
gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải
được di truyền cho các thế hệ sau; (iv) trong mỗi thế hệ sản phẩm của gen chuyển phải
được biểu hiện, và (v) sản phẩm của gen chuyển biểu hiện được chức năng sinh học.
Chính vì vậy q trình chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ được thực


hiện bằng hệ thống chọn lọc tế bào và mô chuyển gen, xác định sự có mặt của gen
chuyển trong tế bào cây chủ, kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định
sản phẩm biểu hiện là mRNA và protein và phân tích sự biểu hiện chức năng sinh học
của gen chuyển.
Thành tựu khi chuyển gen vào đậu tương.
Cải thiện protein và amino acid.
Cải thiện thành phần dầu.

Cải thiện một số thành phần khác.
Tăng cường khả năng kháng côn trùng và vi sinh vật.
Tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh.
Tăng cường khả năng kháng thuốc diệt cỏ.
III.

KẾT LUẬN.
Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens (At) được xem là một phương pháp rất có hiệu quả và là phương pháp mà
qua đó kết quả chuyển gen (ở phân tích Southern blot) thường biểu hiện kiểu tích hợp
gen (DNA integration) tương đối đơn giản - phù hợp với mục tiêu của các nhà cơng
nghệ gen. Vì vậy,việc tạo ra các chủng vi khuẩn At mang gen chuyển là yêu cầu rất
cần thiết.
Ưu điểm của phương pháp: kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, khơng địi hỏi thiết
bị đặt tiền.
Nhược điểm của phương pháp: Phương pháp này sử dụng thành công ở nhiều cây
hai là mầm, nhưng chưa hiệu quả chuyển gen ở cây 1 là mầm còn thấp. trong khi nhiều
cầy 1 là mầm là cây lương thực quan trọng như cây lúa, ngơ, lúa mì…
Như vậy, nhờ cơng nghệ chuyển gen, người ta có thể tạo ra các giống cây đem lại
nhiều lợi ích cơ bản và lâu dài, đặc biệt là hạn chế tối đa việc sử dụng phân bón hóa
học trong ngành trồng trọt và giảm thiểu sự ơ nhiễm mơi trường. Ngồi ra, có thể sản
xuất các loại thuốc quý, chữa các bệnh cho người và tạo ra những polyme sinh học
dùng trong bao gói, vận chuyển và thuận tiện tiêu hủy, tạo lợi nhuận đáng kể cho nông
dân và người tiêu dùng, làm sạch môi trường, bảo vệ môi trường và hệ sinh thái bền
vững.

IV.

Tài liệu tham khảo.
1 www.agbiotech.com.vn/vn/?mnu=preview&key=2312

2 Trung tâm kiến thức toàn cầu về cây trồng CNSH Tài liệu phổ biến kiến thức
dạng bỏ túi - Pocket K No.
3 />4 ViệtNamNet-Xử lý tin: Trọng An


5 kỹ thuật chuyển gen vào thực vật và ứng dụng – Thủy Hồng