Phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

MỤC LỤC
Trang
LỜI MỞ ĐẦU 2
I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái niệm thực vật chuyển gen
1.2. Cơ sở khoa học
1.2.1. Nguyên lý chuyển gen vào thực vật
1.2.2. Những lợi ích của cây chuyển gen
1.2.2.1.Tăng sản lượng :
1.2.2.2. Tăng lợi nhuận nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất
1.2.2.3.Cải thiện môi trường
1.2.2.4. Tác dụng trong y học
1.2.3. Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen
1.2.3.1.Những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới
II. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
2.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium
2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium
2.1.2. Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium
2.1.3. Cơ chế tác dụng của Agrobacterium
2.1.4.Qui trình chuyển gen bằng Agrobacterium
2.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium
2.1.5.1. Ưu điểm
2.1.5.2. Nhược điểm
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Ứng dụng
3.1.1. Trong nông nghiệp
3.1.2. Trong y học
3.2. Thành tựu
3.2.1 Trên thế giới
3.2.2. Ở Việt Nam
4.Kết luận

Tài liệu tham khảo
1
LỜI MỞ ĐẦU
Việc sử dụng một khối lượng lớn nhiên liệu hoá thạch giúp chúng ta có được đời sống
tiện nghi và hạnh phúc nhưng cũng dẫn đến sự trả giá đắt như hiện tượng ấm lên toàn cầu, sự ô
nhiễm và hủy hoại môi trường. Do nhiều điều kiện bất lợi của môi trường như sự nhiễm vi
khuẩn, virus, các loại côn trùng, sự nhiễm mặn, khô hạn, nhiệt độ cao, … Ngay ở Mỹ, sản
lượng nông nghiệp giảm hơn ¼ so với tối đa theo lý thuyết. Ngày nay, các loại cây trồng
kháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ cỏ đã được tạo ra bằng việc áp dụng chuyển các
gen mong muốn vào thực vật, đã mang lại những cải thiện quan trọng trong năng suất. Các gen
cải thiện sự tăng trưởng của thực vật trong môi trường axit hoặc kiềm và đất nhiễm mặn đã
được cô lập [9]. Bên cạnh đó vấn đề vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh đang là một vấn đề
nghiêm trọng với sức khỏe của loài người. Cây trồng chuyển gen là hệ thống sản xuất vắc xin
thay thế có hiệu quả, vì chúng có thể biểu lộ nhiều loại prôtêin, cũng như thực hiện các thay
đổi cần thiết để các loại prôtêin đó hoạt động. Hệ thống cây trồng cũng ít khi chứa các loại vi
khuẩn có thể là nguồn bệnh đối với động vật, Và việc sản xuất đại trà các loại vaccin trên cây
trồng cũng dễ hơn [12].
Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và mô động
vật và thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection),
xung điện (electroporation), súng bắn gen. Các phương pháp phức tạp và hiệu quả hơn bao
gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen
gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen. Phương pháp để đưa
gen mới vào tế bào thực vật bằng việc sử dụng Agrobaterium. Phát kiến về việc
Agrobaterium tumefaciens có khả năng chuyển gen vào thực vật đã biến loài này trở thành một
trong những công cụ quan trong nhất của Công nghệ sinh học thực vật. A. tumefaciens là loài
vi khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ máy thực vật
để biểu hiện các gene này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng [8].
Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen
phù hợp. Nhiều nhà khoa học tin rằng chuyển gien cây trồng là cách hiệu quả hơn và rẻ tiền
hơn để sản xuất vaccine và thuốc hàng loạt.

Công nghệ sinh học trên thế giới phát triển với tốc độ chóng mặt, riêng trong nông
nghiệp đã có hơn 60 triệu ha gieo trồng bằng các giống cây biến đổi gen như: ngô, lúa, đậu
tương, bông, hoa hướng dương, khoai tây, đu đủ Cây trồng chuyển gen với năng suất và chất
lượng cao đã đem lại lợi ích khổng lồ cho những quốc gia có nền công nghệ sinh học tiên tiến.
Đồng thời giảm được việc sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học vốn làm suy kiệt tài
nguyên thiên nhiên và phá vỡ cân bằng sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến khí hậu toàn
cầu. Những nghiên cứu hiện nay cho phép tạo ra các loại cây lương thực “thế hệ đầu tiên” có
khả năng chống lại các stress của môi trường như hạn hán, sự thay đổi nhiệt độ đột ngột hay
đất nhiễm mặn Cùng với sự phát triển mạnh mẻ của công nghệ sinh học, chắc chắn vaccine
trong thực vật sẽ là một hướng nghiên cứu đúng đắng và đấy triển vọng nhằm nâng cao giá trị
của cây trồng biến đổi gen trong việc ngăn chặn sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm ở người
và động vật cũng như qui mô mở rộng trên toàn thế giới [22].
2
I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU:
1.1. Khái niệm thực vật chuyển gen
Cây chuyển gen là một thực vật mang một hoặc nhiều gen
được đưa vào nhân toạ thay vì thông qua lai tạo. Những gen được
tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực
vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn.
Thực vật tạo ra được gọi là “chuyển gen” mặc dù trên thực
tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của
chúng bởi quá trình thuần hoá, chọn lọc và lai giống có kiểm soát
trong một thời gian dài [3].
1.2. Cơ sở khoa học
Hiện nay trong việc tạo cây trồng chuyển gen phải qua các bước:
- Chọn lựa và nhân bản đoạn gen kháng nguyên của vi khuẩn và vi rút gây bệnh.
- Thử nghiệm thành công các vectơ biểu hiện gen tái tổ hợp.
- Chuyển thành công gen vào nhiều loài đối tượng thực vật.
- Gia tăng tốc độ và khối lượng protein tái tổ hợp được sản sinh trong cây trồng [22].
1.2.1. Nguyên lý chuyển gen vào thực vật

Kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn
tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ
gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến
đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của các cơ thế chuyển gen.
Thông tin di truyền acid deosyribonucleic (DNA) tồn tại ở 3 dạng chính :
- DNA của cơ thể bậc cao trong đó có các DNA nhân và DNA cơ quan tử.
- DNA của cơ thể vi sinh vật.
- DNA của plasmid.
Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm:
Gen khởi đầu(promoter), gen mã hoá(coding gen), và gen kết thúc (terminator). Các gen mã
hoá có thể đưa được vào mô thực vật nhờ các vectơ plasmid.
Các mẫu vật (các bộ phận của cây hoặc mô dùng để biến nạp) thích hợp nhất cho biến nạp gen
là những mẫu vật đòi hỏi thời gian nuôi cấy trước và sau khi biến nạp ngắn nhất.
- Lựa chọn gen cần được biểu hiện (gen quan tâm) và đưa vào một Best regards,vector thích
hợp
- Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen
- Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các phương pháp
chuyển gen
3
- Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật
- Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật
- Sử dụng vaccine đã thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi dưới dạng thức ăn đã chế biến.
Thiết kế vector biểu hiện:
Điểm quan trọng nhất trong thiết kế vector biểu hiện là promoter, đây phải là promoter
khoẻ, có ái lực mạnh với RNA-polymerase của vật chủ và hoạt động của promoter được điều
hoà một cách dễ dàng. Trong nhiều nghiên cứu gần đây, với mục đích biểu hiện kháng nguyên
vaccine trong các bộ phận ăn được của thực vật, người ta đã thiết kế promoter đặc hiệu mô
thực vật, ví dụ promoter đặc hiệu mô củ hoặc mô hạt thì protein sẽ được sản xuất trong củ
hoặc hạt. Tuỳ thuộc vào mục đích ứng dụng, có thể thiết kế một phương thức biến nạp thích
hợp cho từng genotype khác nhau. Trong những nghiên cứu cơ bản, người ta thường tập trung

tìm hiểu theo cấu trúc và chức năng của các cấu trúc gen biến nạp, khảo sát các promoter và
các cơ chế phân tử ở thực vật để có thể chuyển gen thành công vào các loài khác nhau [22].
1.2.2. Những lợi ích của cây chuyển gen
1.2.2.1.Tăng sản lượng :
Cây chuyển gen có thể tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, do vậy với diện tích đất canh
tác ít hơn vẫn có thể thu được nhiều lương thực hơn.
Ví dụ: ở Mỹ, năm 1999, đã có 66 triệu ruộng ngô tránh được sâu đục thân [9].
1.2.2.2. Tăng lợi nhuận nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất
Thực vật với khả năng tự bảo vệ chống lại côn trùng và cỏ dại có thể giúp giảm liều
lượng và nồng độ của các thuốc trừ sâu sử dụng.
Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước ở những vùng sử dụng
thuốc. Thực vật kháng thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng biện pháp không cày đất đó là một
yếu tố quan trọng trong việc bảo tồn đất đai đã trở nên phổ biến.
Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen ở Canada đã ít phải cày cấy hơn so với khi trồng cây
cải dầu truyền thống [24].
1.2.2.3.Cải thiện môi trường
Một trong những lợi ích to lớn của cây trồng chuyển gen đối với môi trường đó là
chúng giúp làm giảm đáng kể lượng thuốc trừ sậu được sử dụng, với tỷ lệ phụ thuộc vào loại
cây trồng và các đặc điểm mới đưa vào cây trồng đó
Cây chuyển gen còn có lợi ích tiềm tàng đối với môi trường. Chúng giúp bảo tồn các nguồn lợi
tự nhiên, sinh cảnh và động vật, thực vật bản địa. Thêm vào đó, chúng góp phần giảm xói mòn
đất, cải thiện chất lượng nước, cải thiện rừng và nơi cư ngụ của động vật hoang dại [14].
4
1.2.2.4. Tác dụng trong y học
Những cây chuyển gen thế hệ thứ nhất đã làm giảm chi phí sản xuất. Ngày nay, các nhà
khoa học đang hướng dẫn tạo ra những cây chuyển gen thế hệ thứ hai có đặc điểm tăng giá trị
dinh dưỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những
cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Một số ví dụ như: Lúa gạo giầu
vitamin A và sắt, khoai tây tăng hàm lượng tinh bột vacxin ăn được ở ngô và khoai tây,
những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, dầu ăn có lợi cho sức

khoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu [17].
Ưu điểm của vaccine trong thực vật chuyển gen
Dể dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh khối
Tính ổn định cao,dễ bảo quản và sử dựng
Các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ngay ở nhiệt độ phòng do chúng được
sản xuất và được bao bọc bởi các mô thực vật mà cụ thể là chứng được định vị trong lưới nội
chất, thể Golgi hoặc bề mặt tế bào. Nhờ tính ổn định này mà chúng trở nên dể dàng bảo quản
và sử dụng ngay trong thực vật mà không cần giữ lạnh như các vaccine tiêm.
Tính ăn được
Loại vaccine trong thực vật này được chính mô trong thực vật bao bọc, hạn chế được sự
phân huỷ của dịch tiêu hoá ở đường ruột và ổn định, bền vững trong cơ thể. Nên vaccine này
có thể ăn tươi (quả lá) hoặc nấu chín (hạt củ)
Tính an toàn
Vì vaccine được sản xuất trong thực vật là vaccine dưới đơn vị sử dụng gen mã hoá cho
một phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống như vaccine giảm độc lực hay virus
chết như vaccine bất hoạt. Do đó vaccine này không trở lại thành virus gây bệnh cho người và
động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ vaccine. Do
đó, không cần tách chiết và tinh sạch kháng nguyên vaccine.
Vaccine ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống thể dịch hiệu quả hơn vaccine
tiêm
Ta biết rằng hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề mặt nhầy
trong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu. Khi vaccine ăn vào cơ thể theo đường miệng
nó sẽ cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất các kháng thể chống lại vi sinh vật gây
bệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch cũa tế bào, tạo ra các
globulin miển dịch tăng cường khả năng bảo vệ sớm và hiệu quả cho cơ thể. Khi tiêu hía
vaccine ăn được, kháng nguyên được giải phong trong ruột non.
Với những ưu điểm nỗi bật của vaccine thì việc sản xuất vaccine ăn đuợc xem là hệ thống sản
xuất vaccine lý tưởng đơn giản và giá thành thấp [22].
1.2.3. Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen
1.2.3.1.Những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới

Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh
dưỡng vào thực phẩm. Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng
hoang dại. Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển
gen. Nguy cơ những chất độc này tác động tới sinh vật không phải sinh vật cần diệt [2].
5
Các cây chuyển gen được đánh giá cẩn thận về ảnh hưởng tới môi
trường trước khi đưa ra thị trường. Chúng được các nhà chức tránh
đánh giá tuân theo các quy tắc do các chuyên gia môi trường trên
khắp thế giới đưa ra. Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm 1989;
Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm 1992; chính phủ Canada
năm 1994. Có những ảnh hưởng không mong muốn như:
- Ảnh hưởng lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt trong
môi trường đó.
- Cây chuyển gen có tồn tại trong môi trường lâu hơn bình thường hoặc xâm chiếm những nơi
cư ngụ mới .
- Khả năng gen phát tán ngoài ý muốn từ cây chuyển gen sang loài khác [18].
II. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
Các phương pháp biểu hiện gen dựa trên thực vật đã được phát triển từ cuối những năm
1970 đầu 1980. Hiện nay, có thể xếp những phương pháp này vào hai nhóm chính sau:
Chuyển gen ổn định tức là gen quan tâm được bảo tồn qua nhiều thế hệ do gắn vào hệ gen vật
chủ (chuyển gen vào nhân hoặc plastid) và biểu hiện gen tạm thời dựa trên Agrobacterium và
vector virus thực vật, theo nguyên tắc có thể sử dụng bất kỳ phương pháp chuyển gen vào thực
vật nào cũng có thể tạo ra thực vật chứa vaccine ăn được, tuy nhiên hiện nay người ta chỉ mới
tạo thành công vaccine ăn nhờ súng bắn gen và nhờ vi khuẩn Agrobacterium [22].
2.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium
2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium
A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2.5-3.0 x 0.7-0.8mm, dạng
đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn háo khí, nhuộm gram (-) ,khuẩn
lạc tròn và rìa nhẵn.Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, tròn, nhỏ, rìa đều đặn và có màu
xanh da trời nhạt sau đó đậm dần trên môi trường chỉ thị D2M.

Vi khuẩn A. tumefaciens không có khả năng khử arginine,
không phân giải gelatin; có thể phân giải các loại đường, tinh
bột, tryptophan, tạo NH3 và H2S, khử oxydase. Agrobacterium
không thể tạo gây khối u (chuyển T-DNA) ở nhiệt độ trên
29
0
C và khoảng pH baz. Lý do là hệ thống protein vir đặc biệt
là virA rất nhạy cảm với nhiệt độ, chúng bất hoạt ở 29
0
C và
biến tính ở 32
0
C, hiệu suất chuyển gene cao nhất ở 22
0
C và
khoảng pH từ 5.2 - 5.7, điều này được giải thích do thụ thể
nhận biết ký chủ của Agrobacterium (ChvE-VirA)được hoạt
hóa bằng proton của hợp chất phenolic và nó bị bất hoạt trong
6
môi trường baz. Một khi protein Vir A bị bất họat thì tế bào vi khuẩn sẽ mất khả năng hoạt hóa
toàn bộ hệ thống protein vir dẫn đến mất khả năng chuyển gen [9].
2.1.2. Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể
và một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-
plasmid chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị
nhiễm A.tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rỏ nhất
là các khối u được hình thành ở ngay chổ lây nhiểm. sự
hình thành khối u sau đó có thể được tiếp tục mà không
cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng có
được do A.tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-

plasmid xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh [16].
Ti-plasmid
Ti-plasmid là một plasmid lớn 200kb, chúng được duy trì ổn định trong
Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30
0
C. Trên Ti-plasmid có đoạn T- AND có được giới hạn
bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái
tương tự nhau. Đoạn này được gọi là T-AND vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực
vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh khối u. T-DNA của vi khuẩn được chuyển vào tế bào thực
vật và hợp nhất với gen nhân (tế bào thực vật). T-DNA ổn định trong gen nhân.Vị trí hợp
nhất của T-DNA vào DNA thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên.
Vùng vir: là vùng chứa các Gene vir (virulence gene) mã hóa cho các protein thực hiện việc
cắt, chuyển và gắn T-DNA vào genome thực vật.
Vùng CON:vùng mã hóa chức năng tiếp hợp
Vùng ORI :vùng mã hóa chức năng tái bản và
khởi điểm tái bản [16].
A. Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) và
kiểu nopaline
(pTiC58) cho thấy vị trí tương đối và kích
thước của các vùng chức năng chính.
Các vị trí tô đậm chỉ các vùng tương đồng
lớn của 2 plasmid
CON: vùng mã hóa chức năng tiếp hợp
ORI: vùng mã hóa chức năng tái bản và
khởi điểm tái bản
B. Bản đồ của vùng T kiểu nopaline và
octopine cho thấy các vùng chức năng
chính, các vùng tương đồng và các sản
phẩm phiên mã.
Ti-plasmid kiểu octopine và nopaline

7
T-DNA
Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp
auxin, cytokinin, opine là các gen gây khối u (oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA
được giới hạn bằng RB và LB. Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa
cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc
tiêu hóa opine (opine catabolism). Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được
nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA
phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là
vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các
gen nằm trong vùng vir dưới tác động
kích thích của các hợp chất phenol tiết ra
từ vết thương là một loạt các protein đặc
hiệu như virE2, virB, virD, virD2,
virC1 Các protein này nhận biết các vết
thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết
là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra
các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các
đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận
với hệ gen của cây chủ một cách an toàn.
Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-
DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ
bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin,
cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng
của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia
vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine
được vi khuẩn sử dụng như một loại
“thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine trên
Ti-plasmid. vì thế sự thay đổi hình thái
chính của thực vật là chúng tạo ra rất

nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm
bệnh. Trên thực tế Agrobacterium chỉ
gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta
cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA
vào hệ gen các cây hai lá mầm. Gần đây,
nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm
vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có
thể sản xuất opine và có thể khai thác
khả năng biến nạp gen của vi khuẩn
Agrobacterium vào cây một lá mầm [4].
Bản đồ của các dạng Ti-plasmid
A: dạng tự nhiên ban đầu, B: dạng cis, C: dạng trans.
8
Phương thức chuyển T-DNA vào gen của thực vật
2.1.3. Cơ chế tác dụng của Agrobacterium
Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn
đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh
trưởng nội sinh, tạo ra khối u. Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen
ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn.
Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với
thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB.
Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó
gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein
vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-
1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực
vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA.
9
Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn
vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid,
cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA

qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm
nhập vào gen của cây chủ.
Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào gen tế bào thực vật, mà
không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và
gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA
25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các
gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật.
Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen
virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol
như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình
này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn
bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE.
Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB
của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn. Đồng
thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế
bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và
dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn.
Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là
sự tiếp hợp giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được
chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất trong gen tế bào thực vật được
ổn định và di truyền như các gen bình thường khác [4].
Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa
học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các
marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các gen vir.
Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở
nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ
Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền
của các gen chuyển đặc biệt. Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được
biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng,
môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp,

loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật [21].
10
2.1.4. Quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium
11
chuyển gen gián tiếp nhờ vi
khuẩn Agrobacterium
2.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium
2.1.5.1. Ưu điểm
Hiệu suất cao vì Khi xem xét vị trí biểu hiện màu xanh chàm của phản ứng GUS (của
cơ chất với enzym B-Gluconidase), người ta nhận thấy Agrobacterium có xu hướng chuyển
gene vào những vùng mô đang phân sinh mạnh. Đây là lợi thế lớn nhất của phương pháp này
vì mô phân sinh là nơi mà chồi con (đã “bị” chuyển gen) có thể dễ dàng được tạo thành. Khai
thác đặc tính này, trước khi tiến hành hoạt hóa vi khuẩn, người ta còn tiến hành hoạt hóa mẫu
mô thực vật, mô càng tăng sinh mạnh thì hiệu suất chuyển gene càng cao. Đối với các phương
pháp khác như bắn gen hoặc Silicon Carbide…tuy có thể thực hiện trên tất cả các đối tượng
thực vật nhưng gene mục tiêu được chuyển một cách ngẫu nhiên, không định hướng.
Gene mục tiêu ít bị đào thải, nó tồn tại khá bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ
thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein vir (virulent). Ở các phương pháp khác, gene mục tiêu
được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ 2 trình tự IS hai đầu nhưng nó cũng có thể dễ dàng tách ra
ngay sau đó [7].
2.1.5.2. Nhược điểm
Agrobacterium có phổ tấn công có giới hạn, nó có thể gây khối u cho cả cây khỏa tử và
cây hai lá mầm nhưng lại không thể gây khối u cho cây một lá mầm. Lý do cây một lá mầm
thuộc nhóm thực vật tiến hóa hơn (tiến hóa nhất trong giới thực vật), nó tích lũy nhiều cơ chế
kháng bệnh hơn các cây hai lá mầm như vách cellulose tẩm silic làm tăng độ bền; hoặc khi bị
thương, phần mô bị thương có xu hướng hóa gỗ để bảo vệ, chứ không phân chia mạnh để tái
tạo hoặc tiết hợp chất phenol như cây hai lá mầm. Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, người ta
đã tìm được nhiều chủng Agrobacterium có khả năng chuyển gene cho một số cây một lá mầm
như bắp, lúa, cỏ, mía, lan…ứng dụng tạo ra gạo vàng, phong lan phát sáng [6].
Phương pháp này có một số bất lợi: plasmid Ti gắn gen ngẫu nhiên vào hệ gen thực vật,

làm tăng tính không đồng đều về mức độ biểu hiện kháng nguyên trong cây chuyển gen. Ngoài
ra cách gắn gen này có thể phá vỡ biểu hiện gen dẫn đến sinh trưởng bất thường của cây
chuyển gen. Tất cả các dòng Agrobacterium hiện nay đều có nguồn gốc tự nhiên, do đó nó vẫn
mang một số đặc tính của chủng hoang dại [7].
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Ứng dụng
3.1.1. Trong nông nghiệp
Các tính trạng được biến nạp gen ở khoai tây gồm: kháng
nấm, sâu bọ và giun tròn, kháng thuốc diệt cỏ, thay đổi thành
phần tinh bột, chống chịu stress và chống bầm dập củ.
Ngoài ra, khoai tây được trồng bằng củ thay vì hạt, vì vậy
sự tạp nhiễm cây chuyển gen sẽ không truyền cho thế hệ con.
Nguy cơ lưu chuyển gen là có nếu để cây mọc hoang phát triển
trong ruộng từ vụ này sang vụ khác. Khả năng lai xa và nạp gen
giữa khoai tây và các họ hàng hoang dại của nó là rất thấp.
12
Khoai tây kháng côn trùng: Khoai tây mang một gen sản xuất protein kháng sâu tạo cho nó
khả năng tự bảo vệ trước bọ khoai tây Colorado. Giống khoai tây được chuyển gen nhằm
kháng virus xoăn lá khoai tây (PLRV) và virus khoai tây Y (PVY). Loại khoai tây này được
chuyển gen của virus để tự kháng lại virus [10].
Thực hiện việc chuyển nạp hiệu quả ở lúa trong các kiểu gen độc lập, và hiện nay hơn 40
giống đã được chuyển gen thành công. Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn
gốc từ hạt trưởng thành. Kháng hygromycin B là gen chỉ thị chọn lọc thường được dùng cho
lúa. Kỹ thuật chuyển gen ở lúa thông qua Agrobacterium đã có những cải tiến quan trọng và
có hiệu quả. Những giống lúa mới có năng suất cao, giàu dinh dưỡng, kháng sâu bệnh, chịu
đất mặn, gạo cho sản lượng lượng thực cao [5].
Cà chua chín chậm: Là loại thực phẩm chuyển gen đầu
tiên được sản xuất ở các nước phát triển. Giống cà chua này có
thời gian lưu trên quầy bán hàng dài hơn. Nó mang một gen
làm chậm quá trình trình mềm quả tự nhiên khi quả chín. Loại

này giữ được trên cây lâu hơn so với các giống khác, vì vậy có
thể bảo quản tươi lâu hơn. Hơn nữa, thời gian lưu giữ trên quầy
bán hàng dài hơn đã tăng giá trị thương mại sau thu hoạch và
bảo quản, giảm giá thành sản phẩm. Được trồng ở Canada ,
Nhật bản và Mỹ. Tạo ra cà chua với hàm lượng flavonol cao;
cà chua với hàm lượng lycopene cao.Các nhà khoa học Mỹ đã tạo được loại cà chua có thể
sống trên các vùng đất nhiễm mặn mà vẫn cho quả thơm ngon, giữ được lâu ngày không bị
thối [11].
Ngô kháng côn trùng (sâu đục thân): Là loại ngô
chuyển gen sản xuất một loại protein tinh thể (crystal protein)
Protein này cho phép cây ngô có khả năng kháng ổn định đối
với sâu đục thân. Người ta cũng tạo được cây ngô kháng bệnh
sâu bướm
Các đặc tính về chất lượng nhằm nâng cao chất lượng thực
phẩm: ngô với giá trị làm thức ăn gia súc cao hơn.Các cây
trồng có lợi cho môi trường của chúng ta: ngô với các lợi ích
tăng chất phốt pho; cây trồng chịu được các áp lực về môi
trường, chịu được thạch tín. ngô trồng được trên đất nhiễm
phèn (có nhiều tính axit) [18].
3.1.2. Trong y học
Loại khoai tây chuyển đổi gien (GM), chứa vắc-xin ngừa viêm gan B, do những người
ăn sống khoai tây GM đã được tiêm vắc-xin viêm gan B thông thường nên vaccin khoai tây
chỉ tăng cường khả năng miễn dịch của họ.Các nhà khoa học đang phát triển các loại khoai tây
chứa văcxin chống virut papilloma (HPV) [11].
13
Chuyển gen vào khoai tây nhờ vi khuẩn Agrobacterium
Tạo ra dược phẩm: ngô có lợi cho những người mắc bệnh xơ nang; Hạt ngô cũng là đối
tượng quan tâm để sản xuất kháng nguyên vaccine viêm gan B.; ngô với tỷ lệ vitamin E cao
hơn [1].
Gạo chứa vaccine chống dịch tả Nhóm nghiên cứu do giáo sư Hiroshi Kiyono thuộc

khoa nghiên cứu miễn dịch, Trường đại học Tokyo đứng đầu, đã công bố việc phát triển một
loại gạo có chứa vaccine chữa bệnh dịch tả. Các nhà khoa học Nhật Bản vừa tạo ra một loại
lúa chuyển gien chứa vaccine ngừa bệnh sốt mùa hè - một bệnh dị ứng do phấn hoa hoặc bụi
gây ra.Với bản đồ gen lúa, người ta có thể tìm ra những gen điều khiển việc sản xuất các loại
vitamin để tạo ra giống lúa giàu đạm. Việc này giúp cải thiện tình trạng thiếu vitamin A của trẻ
em [23].
Văcxin từ cà chua giúp chống các bệnh về hô hấp :Cà chua có thể được sử dụng để
chứa văcxin phòng ngừa RSV - loại virut tiềm tàng gây ra các bệnh hô hấp thường tấn công trẻ
em. Cà chua đã biểu hiện kháng nguyên vaccine dưới đơn vị virus RSV, đây là virus gây bệnh
đường hô hấp nghiêm trọng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ [13].
3.2. Thành tựu
3.2.1 Trên thế giới:
Những thành công của các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã chứng tỏ việc sản xuất và
đưa sản phẩm vaccine trong thực vật ra thị trường sẽ trở thành hiện thực trong một tương lai
không xa. Những tiến bộ mà các nhà công nghệ sinh học thực vật trên thế giới đã đạt được tập
trung vào một số vấn đề.
14
Gen lấy từ nguồn bệnh người được chuyển vào vi khuẩn gây
nhiễm thực vật
Vi khuẩn được nhiễm vào các mẫu lá khoai
tây
mầm tạo đựơc từ các mẫu lá mang gen bệnh
người
Khi ăn khoai tây gây ra
phản ứng miễn dịch
mầm bệnh
Hầu hết các báo cáo hiện nay về sản xuất vaccine ăn được đều liên quan đến phương
pháp chuyển gen bằng Agrobacterium và promoter phổ biến nhất. Nguyên tắc của phương
pháp này là lợi dụng sự lây nhiễm của Agrobacterium để vận chuyển và phát tán vector virus
vào thực vật, sau đó vector mang gen quan tâm này sẽ tiến hành sao chép, nhân lên và lây

nhiễm cho toàn bộ tế bào.
Sản xuất vaccine đầu tiên từ thực vật được ghi nhận vào năm 1990 khi công trình
nghiên cứu biểu hiện protein kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn. Sau đó nhiều thành công
khác về vaccine thực vật cũng đựơc công bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau
diếp, cà chua, khoai tây…Số lượng nghiên cứu đựơc gia tăng đã chứng tỏ tính ưu việt của thực
vật như một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn về mặt sinh học, sử
dụng và bảo quản dể dàng không cần giữ lạnh [22].
Để tạo vắc-xin trong khoai tây, nhóm nghiên cứu do
Charles Arntzen thuộc ĐH Arizona (Mỹ) đứng đầu đã bổ
sung vào cây khoai tây thông thường một protein của
virus viêm gan B. Khi con người ăn khoai tây này, protein
sẽ giúp hệ miễn dịch nhận ra và tiêu diệt mọi virus viêm
gan B trong tương lai. Theo Arntzen, biến thực phẩm
thành nguồn vắc-xin rẻ tiền rất hữu ích đối với các nước
nghèo vì không phải bỏ ra nhiều chi phí bảo quản lạnh
hoặc mua kim tiêm [11].
Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên ở người được ghi nhận vào năm 1997 bởi nhóm nghiên
cứu của Arntzen và được sự chấp nhận của Cơ quan quản lí dược phẩm và thực phẩm Hoa Kì.
Trong thử nghiệm vaccine dưới đơn vị độc tố E.coli LT-B này, 11 người đã ăn sống 50-100g
khoai tây chuyển gen. Kết quả cho thấy 10/11 người kiểm tra đều tạo kháng thể chống lại LT-
B, lượng kháng thể này tương ứng với kháng thể đo được ở những người niễm E. coli nồng độ
10
6
. Như vậy, protein LT-B này trong các mô thực vật ăn được không bị phân huỷ trong
đường tiêu hoá và có khả năng miễn dịch ở người.
15
Khoai tây chứa vaccine ăn
Hiện nay, Thanavala và đồng tác giả (2005) đang thử nghiệm giai đoạn I và II vaccine
viêm gan B ở khoai tây. Khi ăn 2 đến 3 liều, mỗi liều 100g khoai tây sống tương đương 1mg
kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B.

Trong đó, 33 người được chỉ định ăn khoai tây chuyển gen mà không có tá dược, một
chất làm tăng khả năng phản ứng miễn dịch. Chuẩn độ kháng nguyên kháng virus viêm gan B
trong huyết thanh được đo trong một số lần nhất định mỗi ngày. Kết quả cho thấy đối với
những người ăn khoai tây không chuyển gen các chuẩn độ không tăng, trong 33 người kiểm
tra có phản ứng tạo kháng thể với nồng độ 10 mIU/mL. Đến năm 2000 đã có 5 kháng nguyên
được biểu hiện thành công ở rau quả. Trong đó dưới đơn vị B của nội độc tố kém bền nhiệt ở
E. coli (LT-B), dưới đơn vị B của độc tố tả (CL-B), protein vỏ capsid virus Norwalk và kháng
nguyên bề mặt virus viêm gan B đều được sản xuất ở khoai tây [2].
16
Mô hình phát triển vaccine thực phẩm

Năm 2005, trong một báo cáo mới nhất về vaccine ăn được trong thực vật,
đã có những phân tích sâu sắc về các đối tượng thực vật được sử dụng để sản xuất vaccine, đặc
biệt là viêm gan siêu vi B. 4 tiêu chuẩn đối với hệ thống thực vật đáp ứng mục đích này, đó là:
- Mức độ biểu hiện cao
- Mức độ kháng nguyên đồng đều trong mô thực vật
- Nguyên liệu thực vật phải ăn được
- Kháng nguyên ổn định ở nhiệt độ phòng và có thể bảo quản lâu dài.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, hạt ngô hội tụ 4 tiêu
chuẩn trên của hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, đây cũng
là đối tượng mà nhóm ông quan tâm để sản xuất kháng
nguyên vaccine viêm gan B. Năm 2003, họ đã biểu hiện
thành công dưới đơn vị B của độc tố kém bền nhiệt ở
E.coli (LT-B). Họ thấy rằng phôi mầm của hạt ngô chuyển
gen tập chung lượng kháng nguyên cao nhất, gấp 6 lần so
với bộ phận khác và những nhân này tương ứng với một
liều mg kháng nguyên. Sau đó, năm 2005 nhóm này lại biểu hiện thành công kháng nguyên bề
mặt chính của virus viêm gan B trong hạt ngô. Mức độ biểu hiện gen trong hạt thu được từ cây
chuyển gen thế hệ thứ nhất là 0,2% protein hoà tan tổng số, trong đó kháng nguyên tập trung
tới 20% trong các phôi mầm của hạt.

Nhóm của Streatfield và đồng tác giả (2003) đã có những đóng góp đáng kể trong việc
sản xuất vaccine ăn được. Hiện nay nhóm này đang tham gia vào các dự án vaccine dựa trên
thực vật của công ty ProdiGene, chủ yếu trên cây ngô, một đối tượng nghiên cứu được xem là
lý tưởng cho sản xuất vaccine ăn được. Nhóm đã xây dựng thành công hệ thống sản xuất
17
vaccine viêm gan B ở ngô. có thể sử dụng dưới dạng bánh snack (ngô qua chế biến được
nghiền thành bột) [15].
GS. Parrot giới thiệu một số thành tựu mới nhất của công nghệ sinh học, ứng dụng trên
đậu nành và ngô chuyển gen ở Mỹ. Hai loài thực vật này, sau khi được chuyển gen, đã có khả
năng đề kháng sâu bệnh và cho năng suất cao hơn hẳn.
Nhóm nghiên cứu do giáo sư Hiroshi Kiyono thuộc khoa nghiên cứu miễn dịch,
Trường đại học Tokyo đứng đầu, đã công bố việc phát triển
một loại gạo có chứa vaccine chữa bệnh dịch tả. Tiến bộ
này có thể sẽ giảm bớt khó khăn cho việc phân phối vaccine ở
những quốc gia đang phát triển trong thời gian sắp tới. Các loại
vaccine tiêm thông thường không tạo được phản ứng miễn
nhiễm ở những nơi có màng nhầy trong cơ thể. Do vậy loại
vaccine mới này sẽ có tác dụng tốt trong việc chống lại tác
nhân gây nhiễm thông thường qua màng nhầy, ví dụ virus
dịch tả, E. coli, virus gây suy giảm hệ miễn dịch ở người,
virus cúm và SARS. Các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã có thể tạo ra phản ứng miễn nhiễm ở
chuột, đồng thời tránh phản ứng dị ứng với loại gạo này. Ngoài ra, loại gạo chuyển hoá gen
này có thể được trữ ở nhiệt độ thông thường mà không gặp nguy cơ nhiễm khuẩn. [5].
Mặc dù thế, việc sử dụng loại gạo được biến đổi để tạo nên phản ứng vaccine không có
nghĩa rằng đây là loại vaccine ăn được. Các nhà khoa học
không muốn công chúng nghĩ rằng ăn gạo này sẽ được
chủng ngừa. Thay vào đó, vaccine này sẽ được cung cấp
dưới dạng viên nhộng hoặc viên nén có chứa bột gạo và
được xem là thuốc chứ không phải thực phẩm [12].
Các nhà khoa học Nhật Bản vừa tạo ra một loại lúa chuyển

gien chứa vaccine ngừa bệnh sốt mùa hè - một bệnh dị ứng
do phấn hoa hoặc bụi gây ra.Các cuộc thử nghiệm trên chuột
cho thấy loại vaccine dưới dạng lúa ăn này đã ngăn được phản ứng miễn dịch gây dị ứng. Cụ
18
Với một bát cơm từ lúa chuyển gien,
vừa no bụng lại vừa trị được bệnh.
thể là chuột được ăn lúa chuyển gien nói trên hắt hơi ít hơn khi tiếp xúc với phấn hoa, so với
những con không được ăn lúa (nhóm đối chứng) [19].
ở Viện Công nghệ khoa học thực vật Thụy Sĩ đã thành công trong việc tạo ra giống lúa
“vàng” chứa phong phú beta-caroten (vitamin A) và giống lúa này đã được Quỹ Rockefeller
tài trợ để triển khai ở một số nước đang phát triển. Với giống lúa này người ta hy vọng se cứu
được nhiều người trong số 500 000 người bị mù lòa trên thế giới hàng năm [10].
Loại gạo chữa dị ứng chứa vacxin ăn được:Dị ứng là một vấn
đề sức khoẻ đáng chú ý, ảnh hưởng đến hơn 15% trẻ em và
người lớn ở trên thế giới. Dị ứng có thể xảy ra ở da, bộ máy
hô hấp và ruột, có thể nặng lên vì nhiều loại tác nhân bên
ngoài môi trường khác nhau, như tiếp xúc với phấn hoa, sợi,
hoặc một số loại phân tử nhất định có mặt trong thực phẩm.
Sử dụng các loại thuốc tổng hợp là phương pháp phổ biến nhất để chữa trị dị ứng, Tuy
nhiên ông Hidenori Takagi ở Tsukuba, Nhật Bản và các đồng nghiệp đang tìm kiếm một
phương pháp chữa trị khác, thông qua tìm hiểu: một loại vắc xin ăn được dựa trên lúa
gạo‘’Rice-based edible vaccine’’ nhờ vào việc biểu thị “multiple T cell epitopes”, kích thích
chống lại sự ức chế đối với “Th2-mediated IgE responses ”. Nghiên cứu của họ được đăng trên
số mới nhất của Kỷ yếu trực tuyến của Viện hàn lâm khoa học quốc gia.
Khi thử nghiệm gạo chuyển gen này trên trên chuột, các nhà khoa học thấy rằng các con
chuột ăn loại gạo này thể hiện hàm lượng histamine thấp hơn, và không phát triển hiện tượng
dị ứng do phấn hoa. Loại prôtêin này tồn tại ổn định trong hạt gạo trong vòng 6 tháng, ngay cả
khi tồn trữ trong phòng có nhiệt độ cao [8].
Cà chua có thể được sử dụng để chứa văcxin phòng ngừa RSV - loại virut tiềm tàng gây
ra các bệnh hô hấp thường tấn công trẻ em. RSV khiến cho gần 90.000 người phải nhập viện

và 4.500 trẻ sơ sinh và trẻ em tử vong mỗi năm. Bộ Nông nghiệp Mỹ đang tài trợ cho một
nhóm các nhà khoa học ở Đại học Illinois nhằm nâng cao tính năng di truyền của cà chua.
Văcxin sẽ tạo khả năng bảo vệ màng nhầy bằng cách kích thích các kháng thể kháng lại
các protêin của RSV khi chúng xâm nhập lần đầu vào cơ thể qua đường mũi, họng và miệng.
19
Dự án còn triển khai nhiều năm nữa song các thử nghiệm ban đầu trong PTN đối với chuột
đang có những triển vọng [13].
Korban và đồng tác giả đã biểu hiện kháng nguyên vaccine dưới đơn vị virus RSV ở cà
chua, đây là virus gây bệnh đường hô hấp nghiêm trọng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Các thiết kế
gen (một loại mang promoter CaMV 35 S và một loại mang promoter đặc hiệu quả E-8) chứa
gen mã hoá cho kháng nguyên RVS-F được chuyển vào cà chua thông qua phương pháp
chuyển gen bằng Agrobacterium. Sử dụng promoter đặc hiệu quả cho phép biểu hiện protein
chỉ ở trong quả của tất cả các cây chuyển gen. Protein này tạo đáp ứng miễn dịch khi được thử
nghiệm ở chuột [25].
Các vaccine sản xuất trong thực vật đã nâng cao giá trị cây trồng, nhất là cây chuyển gen
do chúng được trồng và chế biến trên quy mô lớn, đáp ứng nhu cầu thuốc và sinh dược phẩm.
Vaccine ăn được đã mở ra một kỉ nguyên mới của nông nghiệp, được các nhà khoa học gọi là
“biofarming”, trong đó các cây nông nghiệp được cải biến chất lượng (tăng cường giá trị dinh
dưỡng, làm thuốc), trồng trong các khu vực đặc biệt và sử dụng đặc biệt như các “nhà máy”
sản xuất vaccine và các tác nhân kháng khuẩn khác. Như vậy, những vấn đề còn tồn tại trong
sản xuất vaccine ăn được từ thực vật đã mở ra những hướng nghiên cứu quan trọng cho các
nhà khoa học trên con đường tìm kiếm một vaccine giá rẻ, cung cấp đến mọi nơi trên thế giới,
đặc biệt ở những nước đang phát triển. Và rõ ràng lĩnh vực mới đầy tiềm năng này đang bước
vào giai đoạn phát triển sôi động, đòi hỏi sự hợp tác của nhiều nhà khoa học trên thế giới cùng
giải quyết những khó khăn này. Trong đó, việc chuyển giao công nghệ sản xuất vaccine ăn
được đến các nước đang phát triển rất cần thiết vì đây là những quốc gia thực sự cần loại
vaccine này [24].
Đặc biệt là ngô mang gen chống sâu hại được gieo trồng rất rộng rãi và thu được hiệu
quả kinh tế cao hơn rõ rệt. Năm 2006 tại Mỹ 61% diện tích trồng ngô là được trồng bởi các
giống chuyển gen (GMO hay GMC-genetically modified cultures). Ngô GMC ngoài khả năng

chống sâu hại cũng còn có có thêm cả khả năng kháng thuốc trừ cỏ. Ngô kháng sâu hại cũng
nhanh chóng được trồng ở nhiều nước [12].
Từ năm 1994 Công ty Calgene (Mỹ) đã đưa ra thị trường loại cà chua chuyển gen Flavr
Savr. Mùa hè 1996 sốt cà chua chuyển gen Flavr Savr đã bắt đầu được bán ở châu Âu.
20
Trong số các loại cây được biến đổi gen, đỗ tương và ngô được trồng rộng rãi nhất (chiếm
82%), sau đó là bông và khoai tây. Tính năng kháng thuốc trừ cỏ chiếm 74%, kháng sâu bệnh
chiếm 19%, vừa kháng sâu bệnh vừa kháng thuốc trừ cỏ chiếm 7%. Nhìn chung, diện tích
trồng cây biến đổi gen đã tăng lên 25 lần trong vòng 5 năm qua, từ khoảng 4,3 triệu ha năm
1996 lên đến 109 triệu ha năm 2000, gần gấp đôi diện tích nước Anh. Trong đó, khoảng 99
triệu ha thuộc về Mỹ và Argentina. Riêng ở Mỹ, số lượng đỗ tương được biến đổi gen năm
2000 chiếm khoảng 54% tổng số cây đỗ tương trên toàn quốc (năm 1996 chỉ mới chiếm 7%),
bông 61%, ngô 25%. Năm 2000, có 13 quốc gia tham gia canh tác cây trồng biến đổi gen,
trong đó nước Mỹ chiếm tỷ trọng lớn nhất là 68%. Argentina, Canada và Trung Quốc lần lượt
chiếm tỷ trọng là 23%, 7%, và 1%. Các nước còn lại bắt đầu tham gia vào lĩnh vực mới mẻ
này là Australia, Bulgaria, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Nam Phi, Tây Ban Nha và Uruguay.
Ngoài việc chuyển được vào cây trồng gen kháng sâu hại, gen kháng thuốc diệt cỏ người ta
còn chuyển được cả gen đề kháng với một số bệnh do virut, vi khuẩn và nấm gây ra ở cây
trồng. Bên cạnh đó là việc chuyển gen chịu lạnh cho các cây lương thực, thực phẩm trồng ở
các nước ôn đới, đặc biệt là cho thuốc lá và khoai tây, vốn là những cây ít chịu lạnh. Cũng đã
có những thành công trong việc chuyển gen kháng hạn và kháng mặn cho cây trồng. Các nhà
nghiên cứu ở Viện Gần đây một số thực vật chuyển gen còn được dùng để thu hút kim loại
nặng trong đất và làm giải tỏa tình trạng ô nhiễm môi trường bởi kim loại nặng [14].
3.2.2. Ở Việt Nam
Tạo vắc-xin viêm gan B "ăn được" từ trái cà chua
Các nhà khoa học thuộc Phòng Công nghệ Gen - Viện Sinh
học Nhiệt đới TP.HCM hiện đang tiến hành nghiên cứu vắc-
xin ngừa viêm gan B ăn được từ các bộ phận ăn tươi như quả,
lá, thân, củ trong đó có cây cà chua.
Nước ta là vùng lưu hành cao của bệnh viêm gan do siêu

vi B (HBV). Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10 -
15% dân số (trên dưới 10 triệu người). Bệnh lây lan theo hướng đa dạng và phức tạp, có thể
21
dẫn đến xơ gan và ung thư gan. Cách tốt nhất là phòng ngừa và một trong các biện pháp phòng
ngừa quan trọng là chủng ngừa.
Tại Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
Một nhóm nghiên cứu của Phòng Công nghệ Gen, đang tiến hành nghiên cứu vắc-xin ngừa
viêm gan B ăn được từ các bộ phận ăn tươi như quả, lá, thân, củ Trong đó có trái cà chua.
Hiện nay, trên thế giới cũng đã có nhiều công bố khoa học, dùng công nghệ chuyển gien đã mã
hóa protein HBsAg vào nhân và lục lạp tế bào, vào một số cây trồng,
Theo nhóm nghiên cứu, một thành phần quan trọng của HBV là protein HBsAg giúp cho
HBV bám dính vào mảng tế bào và sau đó đi vào tế bào và huyết tương người bệnh. Huyết
tương có chứa HBsAg là nguồn vật liệu quan trọng để sản xuất thuốc chủng ngừa có nguồn
gốc huyết tương. Các nhà khoa học đã chiết tách phần protein tinh khiết đó và nghiên cứu khả
năng đáp ứng miễn dịch ở cơ thể động vật bằng cách tiêm chích protein tinh khiết hoặc ăn trực
tiếp sản phẩm cây chuyển gien.
Qua các kết quả trên, nhóm nghiên cứu của Phòng Công nghệ Gen - Viện Sinh học nhiệt
đới nhận thấy, protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hóa có khả năng tạo đáp
ứng miễn dịch tốt. Điều này mở ra một triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gien này vào các cây trồng
có bộ phận ăn tươi như quả, lá, thân, củ
Với phương pháp chuyển gien bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, kết quả nghiên
cứu của Viện Sinh học nhiệt đới đã nhận được một số loại cây trong đó có cây cà chua mang
gien mã hoá kháng nguyên bề mặt vi-rút viêm gan B [25].
Việt Nam đã đạt được một số thành tựu đáng ghi nhận về nghiên cứu gen, như việc phát
hiện các gen kháng sâu và thuốc diệt cỏ, cùng các gen chỉ thị liên quan đến khả năng chống
bệnh đạo ôn, bạc lá của lúa, nhân gen, chỉ thị phân tử ADN, nghiên cứu di truyền miễn dịch
thực vật, sản xuất vacxin cho gia súc, gia cầm [5].
Do giá lương thực thực phẩm ngày càng cao, cây trồng năng suất còn hạn chế. Vì vậy, để
thúc đẩy sản xuất hàng hoá lớn, cần ứng dụng hài hoà cả kỹ thuật mới (CNSH) và sản xuất
truyền thống của người dân. Bước khởi đầu, phải thông báo rộng rãi kiến thức về cây trồng

biến đổi gen tới các nhà lập pháp, nhà khoa học, bà con nông dân để mọi người hiểu biết về
22
cây trồng mới. Việt Nam đã sản xuất giống lúa chịu hạn, không chỉ trồng được ở vùng trung
du thiếu nước mà cây lúa này sẽ sống được ở cả vùng miền núi khô cạn [14].
4.Kết luận
Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens (At) được xem là một phương pháp rất có hiệu quả và là phương pháp mà qua đó
kết quả chuyển gen (ở phân tích Southern blot) thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA
integration) tương đối đơn giản - phù hợp với mục tiêu của các nhà công nghệ gen. Vì vậy,việc
tạo ra các chủng vi khuẩn At mang gen chuyển là yêu cầu rất cần thiết [20].
Như vậy, nhờ công nghệ chuyển gen, người ta có thể tạo ra các giống cây đem lại nhiều
lợi ích cơ bản và lâu dài, đặc biệt là hạn chế tối đa việc sử dụng phân bón hóa học trong ngành
trồng trọt và giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường. Ngoài ra, có thể sản xuất các loại thuốc quý,
chữa các bệnh cho người và tạo ra những polyme sinh học dùng trong bao gói, vận chuyển và
thuận tiện tiêu hủy, làm sạch môi trường. Từ năm 1996 đến 2002, tổng diện tích trồng thực vật
chuyển gen trên thế giới đã từ 1,7 triệu héc-ta tăng lên 58,7 triệu héc-ta, gấp 35 lần. Các nước
đang phát triển cũng đang hướng mạnh vào loại cây trồng này, họ coi đây là cây trồng xóa đói
nghèo. Trong số các thực vật chuyển gen được trồng trên thế giới, đậu tương, ngô và bông
chiếm tới 77%. Các loại khác đã có dấu hiệu cho một tương lai hứa hẹn. Năm 2002, tổng giá
trị thị trường toàn cầu ước tính khoảng 4,25 tỷ USD, tăng trên 400 triệu USD so với năm 2001.
Như vậy, thực vật chuyển gen là một hướng công nghệ cao của CNSH phục vụ nông nghiệp
đã bắt đầu và đang phát triển mạnh mẽ, tạo lợi nhuận đáng kể cho nông dân và người tiêu
dùng, bảo vệ môi trường và hệ sinh thái bền vững [11].
Những mối quan tâm tới sinh thái và môi trường xuất phát từ cây chuyển gen được đánh
giá trước khi thương mại hoá chúng. Đồng thời cần có sự kiểm soát và các hệ thống nông
nghiệp tốt để phát hiện và giảm thiểu những mối nguy hại có thể xảy ra. Chúng ta cần so sánh
phương pháp chuyển gen, phương pháp truyền thống và các phương pháp nông nghiệp khác để
làm sáng tỏ những mối rủi ro tương đối cũng như những lợi ích của việc áp dụng cây trồng
chuyển gen. Một điểm đặc trưng của kỹ thuật chuyển gen là nó đưa vào một hay nhiều gen đã
23

được xác định rõ. Điều này giúp cho việc thử nghiệm độc tính của các cây trồng chuyển gen
dễ thực hiện hơn so với các cây trồng bình thường [24].
Các gen mã hóa thông tin di truyền có mặt trong tất cả các loại thực phẩm và việc ăn
chúng không gây ra bất kỳ ảnh hưởng xấu nào, không có tác hại di truyền nào. Hiện nay,
những sản phẩm lương thực-thực phẩm do công nghệ sinh học tạo ra đã có mặt trên thị trường.
Những cây trồng được biến đổi gen vẫn giống những cây trồng truyền thống nhưng chúng có
thêm một số đặc điểm được cải thiện. Chúng không những có lợi cho nông dân mà còn cho cả
người tiêu dùng. Người nông dân gặt hái được những vụ mùa bội thu, trong khi người tiêu
dùng quanh năm lại có nhiều loại sản phẩm để lựa chọn. Ngoài ra, những giống mới được tạo
ra bằng công nghệ sinh học còn có tiềm năng bảo vệ môi trường [14].
Mặc dù có sai số, nhưng có một điều rõ ràng rằng, để bảo vệ môi trường của chúng ta,
lương thực đáp ứng nhu cầu trong tương lai chỉ dựa trên quỹ đất hiện có. Do đó, điều quan
trọng là chúng ta phải sử dụng tất cả mọi biện pháp có thể để giải quyết vấn đề cấp thiết này.
Nhìn chung, việc sử dụng các giống cây trồng chuyển gen có thể đem lại lợi nhuận đáng kể
cho các nước đang phát triển. “Thế hệ đầu tiên” của những giống cây này đã chứng minh được
khả năng tăng năng suất cây trồng, giảm giá thành sản phẩm, tăng lợi nhuận nông nghiệp và
góp phần bảo vệ môi trường. Hiện nay, các nghiên cứu đang hướng đến các cây trồng biến đổi
gen “thế hệ thứ hai”, tập trung vào việc tăng chất lượng dinh dưỡng và khả năng chế biến. Các
giống cây trồng này sẽ khẳng định được giá trị của chúng ở những quốc gia có hàng triệu
người dân bị thiếu hụt thực phẩm [25].
24
Tài Liệu tham khảo
Tài liệu Mạng
1. />2. />3. />4. http:// elearning.hueuni.edu.vn/ /htm/c4.htm
5. http:// huyhoang86.info/diendan/chuyen-de-sinh-vat-chuyen-gen/61-lua chuyen gen chua
vacxin.html
6. />7. />8. (Theo agbiotech VietNam)
9.
10. />11. />12.
13. />14. www.agbiotech.com.vn/vn/?mnu=preview&key=2312

15. www.tivituansan.com.au/Details.asp?nID=501
Tài liệu Tiếng việt
16. GS.TS.Nguyễn Quang Thạch, TS. Nguyễn Thị Lý Anh,TS. Nguyễn Thị Phương Thảo
(2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Trường ĐH Nông Nghiệp I
25