BÁO cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học dược TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC
BỘ MƠN VI SINH - KÍ SINH

BÁO CÁO THỰC TẬP
CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC

Nhóm: 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm: 03
1. Lê Minh Tuấn
2. Tơ Thành Trung

Phan Văn Quốc Việt

Thành phố Hồ Chí Minh 2021

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC
BỘ MƠN VI SINH - KÍ SINH

BÁO CÁO THỰC TẬP
CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC

Nhóm: 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm: 03
3. Lê Minh Tuấn
Phan Văn Quốc Việt

4. Tơ Thành Trung

Thành phố Hồ Chí Minh 2021
2


MỤC LỤC
BÀI 1.. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT........................................................................
1
1.1.. Tóm tắt lý thuyết......................................................................................................
1
1.2.. Kết quả.....................................................................................................................
5
1.3..
1.4..

3


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

1.5..

BÀI 1. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

1.1.
1.6..

Tóm tắt lý thuyết

Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các quá trình cơng nghệ do các ưu thế như dễ

ni
cấy ở qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụng được các cơ chất rẻ tiền và khả năng cho
nhiều sản phẩm đa dạng. Phân lập và tuyển chọn giống vi sinh vật từ các nguồn gen tự nhiên
hoặc cải tạo từ việc gây đột biến nhằm tạo ra giống có hoạt tính, có các đặc tính mong muốn
và khả năng cạnh tranh cao. Bên cạnh đó việc chọn lọc giống sẽ khơng có ý nghĩa nếu chủng
khơng được bảo quản để có thể sống sót và ổn định các tính trạng thu được.
1.1.1.
Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng từ tự nhiên hay gây đột biến và
phát
hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn
1.7..

Phân lập vi sinh vật từ tự nhiên

1.8..

Để chọn lọc được giống vi sinh vật thích hợp, bước đầu tiên là chúng ta có thể phân

lập
chúng theo kiểu “săn lùng” từ các nguồn tự nhiên như mô, xác của động vật, thực vật, đất,
chất thải, nước thải hoặc khu trú và định hướng vào các nơi sinh sống tự nhiên của vi sinh
vật như lớp bùn trầm tích dưới ao hồ, các lị mổ, giếng dầu,...
1.9..

Nguyên tắc của phương pháp

• Trước hết chọn và kiểm tra sơ bộ địa điểm lấy mẫu để thu được mẫu vi sinh vật có
đặc
tính mong muốn. Lấy mẫu (ví dụ trong bài thực tập mẫu sẽ được lấy từ đất), thêm 10
ml

PBS, vortex, để lắng và pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp số 10 đến ống số 6.

• Hút 100 pl huyền phù vi sinh vật ở 3 cấp độ cuối (4, 5, 6), trải lên mơi trường thích
hợp
và ủ ở nhiệt độ thích hợp (37 °C trong 24 giờ đối với vi khuẩn, nhiệt độ phòng trong 7
ngày đối với vi nấm, xạ khuẩn)
1.10..

4


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

1.11..

Hình 1.1. Hình minh họa nguyên tắc phân lập vi sinh vật từ mẫu đất

1.12.. Các phương pháp đột biến
1.13.. Các tác nhân gây đột biến chia thành ba nhóm:
-

Những tác nhân vật lý: Tia cực tím, tia X (rơnghen), tia Y hoặc bắn phá bằng hạt
nơtron
hay electron.

-

Những tác nhân hoá học: Các hợp chất chứa nitơ như: Nitrozomethylguanidin,
methyldicloroetylamin, nitrit, hydroxylamin hay ethylametansunfonat.

-

Những tác nhân sinh học: Gây đột biến bằng Transposon. Thông qua tiếp hợp, các
plasmid mang Transposon (yếu tố Tn) đến tế bào cần gây đột biến và có thể chuyển
đến
các vị trí khác trên nhiễm sắc thể hay plasmid và làm gián đoạn các gen tại đó dẫn đến
đột biến.

1.14.. Để phân lập và tăng sinh thể đột biến có thể đạt được bằng một số cách thơng dụng
sau
-

Nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng chứa chất ức chế như kháng sinh, chất
độc
hay thực khuẩn, chỉ những thể đột biến kháng chất ức chế mới mọc được

-

Nuôi cấy trên môi trường thiếu chất tăng trưởng nhưng chứa kháng sinh như
Penicillin
hay các chất khác chỉ để tiêu diệt tế bào đang tăng trưởng, thể đột biến khuyết dưỡng
không mọc trên mơi trường tối thiểu nên sống sót. Sau đó trải lên mơi trường hồn

chỉnh thì mơi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng nên thể đột biến mọc được
1.15..
giống
Thêm
với
chất
mơi

trường
ni
cấy
chất
kháng
chuyển
hóa,
do
có
cấu
trúc
chuyển
q
trình
hóa
trao
thơng
thường
nên
các
chất
kháng
chuyển
hóa
tham
gia
vào
đổi
thường
chất,

nhưng
do
khơng
có
chức
năng
sinh
học
nên
làm
các
tếức
bào
bình
koong
chết
tế
thực
bào.
hiện
được
đầy
đủdẫn
chức
năng
sống
dẫn
tới
tác
dụng

chế
và
Các
biến
thể
mất
đột
khả
biến
mất
khả
năng
sử
dụng
được
các
chất
này
hoặc
do
đột
năng
khơng
điều
sử
dụng
hịa
nên
sản
xuất

vượt
mức
chất
chuyển
hóa
bình
thường
nên
các
chất
kháng
chuyển
hóa
tới
vẫn
tăng
trưởng
bình
thường.

5


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

1.16.. Phát hiện dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn
1.17.. Bảng 1.1. Bảng trình bày một số loại đặc tính của vi sinh vật và phương pháp sàng
lọc

1.18.. 1.19.. Loại hoạt

1.20.. Bản chất các thay

STT

đổi

tính

1.22.. 1.23.. Amylase
1

ngoại bào

1.26.. 1.27.. Protease
2

ngoại bào

1.25..

1.24.. Tạo được amylase
ngoại bào

1.28.. Tạo được protease
ngoại bào

1.30.. 1.31.. Kháng sinh

1.32.. Tạo được kháng sinh

1.34.. 1.35.. Không di

1.36.. Mất tiêm mao hoặc

4

tiêm mao
không hoạt
1.40..
Mất động
hoặc thay dổi bề
mặt
màn nhầy
1.44..
Mất hoặc thay đổi lớp
bên
ngoài lipopolysaccharide
1.48..
Mất 1 hoặc nhiều
enzym
sinh tổng
hợp
1.52..
Mất
enzym phân giải
các
loại đường
1.56.. Thay đổi khả năng
thẩm

thấu, ngăn cản sự xâm nhập
vào tế bào của các loại
thuốc, hoặc phá hủy các
thuốc.
1.60.. Mất điểm tiếp nhân
virus

3

động

1.38.. 1.39.. Không tạo
5

nha bào

1.42.. 1.43.. Khuẩn lạc
6

xù xì

1.46.. 1.47.. Dinh dưỡng
7

1.50.. 1.51.. Lên men
8

đường

1.54.. 1.55.. Kháng thuốc

9

1.58..
10

1.62..
11

1.59.. Kháng virus
1.63.. Nhạy cảm

1.64.. Thay đổi một protein

với nhiệt
độ bình thường

thiết
yếu làm tăng sự nhạy cảm
với nhiệt
độ.các enzym có
1.68..
Mất
khả năng
tham gia tổng hợp sắc tố

1.66..
1.67.. Mất sắc tố
12
1.70..

1.21.. Dấu hiện phát hiện

6

Thủy phân tinh
bột
trong
môi trường nên tinh bột khơng
tạo màu tím với lugol. Xung
quanh khóm khuẩn có vịng
sáng.
1.29..
Thủy
phân
gelatine
trong
mơi
trường nên gelatine không bị
tủa khi tráng lên môi trường
TCA. Xung quanh khóm khuẩn
có1.33..
vịng sáng. Có khả năng ức
chế
sự
tăng
trưởng của các vi sinh vật khác
bằng cách tạo vùng ức chế xung
qunah
cấy lạc mọc dính vào
1.37.. lỗKhuẩn

nhau.

1.41.. Khuẩn lạc bé, xù xì.
1.45..

Khuẩn lạc nhiều
hạt
nhỏ,
không
1.49..đều. Không mọc trên
môi
trường
tổng
hợp tối thiểu.
1.53..
Không tạo ra sự
biến
đổi
màu
trên mơi trường đặc trưng với
chất
chỉ thị màu.
1.57..
Mọc trên mơi
trường
có
thuốc
nồng độ mà bình thường có
thể gây ức chế phát triển của vi
sinh vật.

1.61..
Phát triển trên
mơi
trường
ni
cấy khi có mặt virus ở nồng độ
cao.
1.65..
Phát triển có
nhiệt
độ
thấp
có
thể, khơng phát triển ở nhiệt độ
bình
1.69..thường.
Có màu khác hoặc mất
màu.


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

1.71.. Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chóng xác định được khả năng sinh enzym
phù
hợp với yêu cầu sản xuất qui mơ lớn trong cơng nghiệp hoặc hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm, virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập. Để xác định khả
năng sinh enzym, phương pháp áp dụng là trải vi khuẩn lên môi trường có chứa chất cảm
ứng và sử dụng chỉ thị thích hợp để phát hiện. Phương pháp chủ yếu được sử dụng trong
việc tìm chủng sản xuất các chất kháng sinh thường dùng hai kiểu kỹ thuật:

• Lấy một mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định.
• Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với một chủng kiểm định.
1.72.. Đối với trong bài thực tập thì sẽ sử dụng 4 chủng Bacillus và khảo sát tác dụng với 2
chủng thử nghiệm là Staphylococcus và E. coli.
1.1.2.

Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật

1.73.. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: (thời gian cấy truyền 1 tuần - 1 tháng)
-

Cấy truyền trên môi trường dịch thể.

-

Cấy truyền trên môi trường thạch.

> Ưu điểm: đơn giản, dễ làm.
> Nhược điểm: tốn công sức, môi trường và thời gian: không ổn định.
1.74.. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng: vaselin,
parafin,..
1.75.. (giữ chủng 1- nhiều năm)
- Đơn giản, hiệu quả cao.
-

Môi trường không bị mất nước.

-

Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với cấy truyền vi sinh vật.

1.76.. Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát và trên hạt
-

Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử.

-

Thời gian bảo quản 1- nhiều năm.

1.77.. Phương pháp đông lạnh
-

Phương pháp đơn giản.

-

Vi sinh vật giữ được lâu 6 tháng - 10 năm.

7


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

1.78.. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp
-

Làm cho tế bào mất nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp.

-

Làm giảm hoặc làm ngừng quá trình phân chia của vi sinh vật.

-

Vi sinh vật khơng bị biến đổi về các đặc tính di truyền.

-

Thời gian lưu giữ lâu tới vài chục năm.

-

Được dùng nhiều trong sản xuất.

1.2.

Kết quả

1.2.1.

Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease

1.79.. • Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym
1.80..

1.81..
-4

lỗng 10

1.82..

1.83..

Hình 1.1.

Môi trường phát hiện ở mức pha Môi trường phát hiện ở mức
pha Mơi trường phát hiện ở mức pha
lỗng 10-5
lỗng 10-6

Khuẩn lạc được phân lập trên mơi trường thạch tinh bột tương ứng

từng cấp độ pha loãng

8


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

1.84..

1.85..

Mơi trường phát hiện ở mức pha Môi trường phát hiện ở mức
pha Mơi trường phát hiện ở mức pha
lỗng 10-5
lỗng 10-6

-4

lỗng 10
1.86..

1.87.. Hình 1.2. Khuẩn lạc được phân lập trên mơi trường thạch gelatin tưong ứng từng
cấp độ pha lỗng

1.88.. • Đĩa phân lập Amylase ngoại bào trên thạch tinh bột và Protease ngoại bào trên thạch
1.89..

gelatin

1.90.. Phát hiện Amylase ngoại bào

1.92..

1.91..

1.93..
Hình 1.3. Đĩa thạch tinh bột hiện màu tím than sau khi tráng bề mặt với dung
dịch1.94..
Lugol dùng
để hiện Amylase ngoại bào
phát

9


1.95.. Phát hiện Protease ngoại bào

1.96..
1.97..

Hình 1.4.

Đĩa thạch gelatin bị đục sau khi tráng bề mặt với TCA 50% dùng
để phát hiện Protease

1.98.. ngoại bào
1.2.2.

1.99..
1.100..

Phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh

Mặt trước

Hình 1.1.

Mặt sau

Kiểm tra khả năng sinh kháng sinh của 4 chủng Bacillus B1, B2,
B3, B4 kí hiệu tương ứng
trên cả 2 đĩa là 1, 2, 3, 4 trên đĩa thạch trải Staphylococcus


1.101..
1.102..
1.103..

1.104..
1.105..
1.106..
1.107..
1.108..
1.109..
1.110..
1.111..
1.112..
1.113..
1.114..
1.115..
1.116..
1.1..

1.2..

M

ặt trước

1.117..
1.118..

Mặt
s
a
u

Hình 1.2. Kiểm tra khả năng sinh kháng sinh của 4 chủng Bacillus B1, B2, B3, B4 kí hiệu

tương

1.119.. ứng trên cả 2 đĩa là 1, 2, 3, 4 trên đĩa thạch trải E.coli
1.2.3.

Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào và sinh kháng

sinh
1.120..Bảng 1.1. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
1.121..C
hủng
1.126..1

1.130..2

1.122..Mơ tả khuẩn lạc (*)

1.123..Amylase
(**)
1.127..Khóm trịn, trắng đục, bề mặt 1.128..Âm tính
có
nhẵn bóng, bìa ngun, màu trắng
đục, khóm lồi, có chỏm ở giữa. d
khoảng 5 mm trịn, trắng đục, bề mặt 1.132..Âm tính
1.131..Khóm
nhăn
nheo, bìa răng cưa, khơng nhơ,
khóm dẹt. d khoảng 5mm

1.124..Protease

1.125..(**)
1.129..

1.133..


1.135..Khóm trịn, trắng đục, bề mặt
có
nhẵn bóng, bìa ngun, màu trắng
đục, khóm lồi, có chỏm ở giữa. d
khoảng 3 mm.

1.136..

1.140..4
1.144.. 1.141..Khóm trịn, trắng đục, bề mặt
nhăn

1.142..

1.134..3

1.137..Đường kính
khóm: 3
mm
1.138..Đường kính vịng
phân
giải: 6 mm
1.139..^ Đường kính
1.143..Đường kính

khóm: 2


1.145..1.146..nheo, bìa răng cưa, khơng
nhơ,
khóm dẹt. d khoảng 2mm

1.151..
1.152..

1.147..

1.148..mm
1.149..Đường kính vịng
phân
giải: 4 mm
1.150..^ Đường kính
vùng

*Mơ tả khuẩn lạc gồm: hình thái khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc.
** Ghi nhận đường kính vịng phân giải, hoặc đường kính vùng kháng khuẩn.

1.153.. 1.2.4. Phát hiện khả năng sinh kháng sinh
1.154..
1.155..
1.156..
Bảng 1.1. Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh
1.158..E. coli
1.159..5. aureus
1.157..C

hủng

1.161..Đư
ờng kính
lỗ

1.162..Đườ
ng kính
vịng phân
giải
1.169..

1.163..Đườ 1.164.. 1.165..Đườ
ng kính
Đườn
ng kính
vùng
g
vịng phân
kháng18
kính
giải 44
1.170..
1.172..

1.166..Đườn
g kính
vùng kháng
khuẩn
1.173..

38 mm

1.167..B
24 mm
mm
mm
acillus 1
1.174..B
1.176..
1.177..16
1.179..42
1.180..36 mm
1.168..6
1.171..
22 mm
mm
mm
acillus 2
1.181..B
1.183..
1.184..13
1.186..40
1.187.. 3
mm
6 mm
19 mm
mm
acillus 3
mm
4 mm

1.188..B
1.190..
1.191..6
1.193..36
1.194..30 mm
12 mm
mm
mm
acillus 4
1.195.. Ghi nhận đường kính vùng kháng khuẩn, trong đó đường kính vùng kháng khuẩn = đường kính
vịng phân giải - đường kinh lỗ

1.196.. 1.3. Bàn luận
1.197..
1.198..

Hinh 1.2 thể hiện 3 đĩa môi trường thạch tinh bột tương ứng 3 cấp độ pha loãng khác

nhau và xuất hiện các khóm khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng bởi 2 loại khóm có hình dạng
và kích thước khác nhau sau khi nuôi cấy 24 giờ. Bảng 1.2 thể hiện kết quả phân lập trên
các đĩa thạch tương ứng.
1.199..

Hinh 1.3 thể hiện 3 đĩa môi trường thạch gelatin tương ứng 3 cấp độ pha loãng khác

nhau
và xuất hiện các khóm khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng bởi 2 loại khóm có hình dạng và
kích thước khác nhau sau khi nuôi cấy 24 giờ. Bảng 1.2 thể hiện kết quả phân lập trên các
đĩa thạch tương ứng.

1.200..

Nhóm 3 đã chọn đĩa thạch tinh bột số 4 (Hình 1.2) tương ứng với cấp độ pha lỗng 10 -4

có tổng cộng 63 khóm để khảo sát khả năng sinh enzym Amylase. Khi tráng bề mặt môi
trường thạch tinh bột với dung dịch Lugol, nền mơi trường sẽ có màu tím than do màu
của iod với tinh bột (Hình 1.4), ngồi vịng sáng do các khóm để lại sau khi đã bị rửa trôivà đổ bỏ
cùng với dung dịch Lugol cịn tồn dư trên bề mặt thạch, khơng thấy sự xuất hiện
của vòng sáng đặc trưng xung quanh vị trí các khóm ban đầu (vịng sáng đặc trưng do
tinh bột bị amylase ngoại bào thủy phân nên không tạo màu với iod làm cho xung quanh
vị trí đó khơng có màu tím). Như vậy, khuẩn lạc mọc trên thạch tinh bột khơng có khả
năng sinh ra Amylase ngoại bào.
1.201..

Nhóm 3 đã chọn đĩa thạch gelatin số 4 (Hình 1.3) tương ứng với cấp độ pha lỗng 10 -4

có
tổng cộng 59 khóm để khảo sát khả năng sinh enzym Protease. Sau khi đã nuôi cấy sau
24 giờ, môi trường thạch gelatin mọc lên 2 loại khuẩn lạc, tiếp đó cho TCA 50% vào môi
trường thạch gelatin, nền môi trường sẽ đục vì gelatin bị kết tủa trắng (Hình 1.5) . Trong
đó, vịng sáng bao quanh các khóm trên đĩa là do vi sinh vật có sinh Protease ngoại bào
làm gelatin bị thủy phân nên khơng bị tủa nên đường kính của vịng phân giải gelatin tỷ lệ
với hoạt tính. Quan sát kĩ hơn thì nhóm thấy xung quanh chủng 4 xuất hiện vòng sáng
nhỏ, rõ, bao xung quanh khuẩn lạc, chủng 3 thì vịng sáng to hơn và rõ hơn, chứng tỏ
chủng 3 có hoạt tính enzym cao hơn so với chủng 4. Như vậy, nhìn chung thì khuẩn lạc
mọc trên thạch gelatin có khả năng sinh ra Protease ngoại bào.
1.202..

Trong thí nghiệm phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng

trưởng của nó với vi sinh vật khác, trên đĩa trải E. coli (Hình 1.7), trong 4 lỗ gồm B1-B4
xuất hiện vịng ức chế xung quanh lỗ với kích thước vịng kháng khuẩn lớn nhất là B1,
giảm dần từ B2 xuống B3 và thấp nhất là B4. Lỗ chứng chỉ chứa môi trường và khơng
xuất hiện vịng ức chế xung quanh lỗ, điều đó chứng tỏ mơi trường khơng bị tạp nhiễm từ
mơi trường bên ngồi.
1.203..

Đối với S. aureus (Hình 1.6), lỗ chứng chỉ chứa mơi trường và khơng xuất hiện vịng ức

chế xung quanh lỗ, trong 4 lỗ B1-B4 xuất hiện vịng ức chế xung quanh lỗ trong đó khi
quan sát đường kính vịng kháng khuẩn, khả năng sinh enzym mạnh nhất vẫn là B1 và
giảm dần từ B2 xuống B3 và thấp nhất vẫn là B4. Điều này tương tự với bên đĩa trải
E. coli nên chứng tỏ hoạt tính sinh kháng sinh mạnh nhất là B1, thấp nhất là B4, hai chủng
B2 và B3 ở cả 2 đĩa trải 2 chủng thử nghiệm khác nhau đều có kích thước gần nhau và có
hoạt tính sinh kháng sinh ở mức trung bình.


1.204..

Tuy nhiên, khi so sánh đường kính vịng kháng khuẩn giữa hai đĩa trải 2 chủng thử

nghiệm bao gồm 1 vi khuẩn Gram dương (S.aureus) và 1 vi khuẩn Gram âm (E.coli) thì
có thể thấy vịng kháng khuẩn ở đĩa S.aureus có kích thước lớn hơn rất nhiều so với kíchthước
vịng kháng khuẩn bên đĩa E. coli. Từ đó nhóm có nhận xét là cả 4 chủng Bacillus
B1-B4 dùng để khảo sát có khả năng sinh kháng sinh có phổ kháng khuẩn nghiêng về
Gram dương nhiều hơn và có tác động ít hơn trên vi khuẩn Gram âm. Các vịng kháng
khuẩn bên đĩa trải S.aureus có sự tiếp xúc và chồng lấp ở phần mép ngồi vịng khống
khuẩn với nhau. Tuy nhiên điều này khơng gây ảnh hưởng gì nhiều tới việc nhận định và
bàn luận của nhóm.

1.205..

Vì thời hạn cho phép của bài thực tập nên việc sàng lọc hoạt tính sinh kháng sinh của 4

chủng Bacillus chỉ dừng lại ở việc cung cấp sơ bộ thông tin về hoạt tính của từng chủng
cũng như phổ kháng khuẩn của cả 4 chủng khảo sát lên 2 chủng thử nghiệm. Để có thể
đưa ra thêm nhiều nhận định khách quan và chính xác hơn, Nhóm 3 đề nghị thực hiện
thêm một vài khảo sát như phương pháp Kirby-Bauer, phương pháp E-test để có thể xác
định được mức độ kháng khuẩn và các giá trị MIC mà các chủng B1-B4 có thể mang lại.
Từ đó có thể chọn lọc và cải tạo giống theo chiều hướng tốt hơn.


1.206..BÀI 2. TINH
2.1.

CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

Tóm tắt lý thuyết

2.1.1. Enzym Amylase
1.207..

Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân các liên kết a-1,4-glycosidic bên trong

tinh bột thành các sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp, chẳng hạn như các đơn vị
1.208..

1.210..

glucose, maltose và maltotriose.

1.209..
Hình 2.1.

Hình minh họa quá trình thủy phân liên kết a-1,4-glycosidic của Amylase để tạo
thành các

1.212..
1.213..

1.211.. tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử thấp chẳng hạn glucose
Amylase là một trong những enzym quan trọng nhất và có ý nghĩa to lớn đối với cơng

nghệ sinh học. Chúng có thể được lấy từ một số nguồn, chẳng hạn như thực vật, động vật
và vi sinh vật. Ngày nay, một số lượng lớn các amylase của vi sinh vật được bán trên thị
trường và chúng đã gần như thay thế hồn tồn q trình thủy phân hóa học tinh bột trong
cơng nghiệp chế biến tinh bột.


2.1.2.

Ứng dụng của enzym Amylase

1.214..

Ứng dụng của enzym amylase trong chế biến thực phẩm gia súc

1.215..

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong

khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng nguồn tinh bột,
người ta thường cho thêm enzym amylase vào.
1.216..

Enzym amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho q trình

chuyển hóa tinh bột tốt hơn.
1.217..

Ứng dụng của enzym amylase trong dược phẩm

1.218..

Amylase được sử dụng đế phối hợp với coenzym A, cytocrom c, ATP, carboxylase điều

chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh. Mặt khác amylase phối hợp với enzym
thủy phân đế chữa bệnh thiếu enzym đường tiêu hóa.
1.219..

Trong cơ thể, amylase là hormon tuyến tuỵ ngoại tiết, có tác dụng chống phù nề sau chấn

thương hoặc sau mổ. Điều trị triệu chứng phản ứng viêm kèm nhiễm khuấn đuờng hô hấp
trên hoặc dưới. Các sản phầm chứa enzym alpha- amylase sẽ kiểm soát lượng calo của cơ
thể.
1.220..

Sản phẩm chứa men tiêu hóa dành cho trẻ sơ sinh và trẻ em, kích thích tiêu hóa, chống

suy dinh dưỡng.

1.221..

Sử dụng enzym amylase trong chuẩn đoán bệnh viêm tụy cấp ở trẻ em

1.222..

Ứng dụng của enzym amylase trong công nghiệp dệt

1.223..

Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi khuẩn để tẩy tinh

bột và làm cho vải mềm.
1.224..

Ứng dụng của enzym amylase trong việc tẩy màu giấy

1.225..

Nguyên lý hoạt động của enzym là: chúng bẻ gẫy các mạch tinh bột trên mặt giấy, kéo

theo sự lảm lỏng các phân tử mang màu bám trên đó, tạo thuận lợi cho qúa trình khử
mực.
1.226..

Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất bia


1.227..

Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase: khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang

trạng thái nảy mầm (malt), enzym amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzym này sẽ thủy
phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm.
1.228..

Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất cồn

1.229..

Quá trình sản xuất cồn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và giai đọan rượu

hóa.
Giai đọan đường hóa, người ta bắt buộc phải sử dụng enzym amylase (không thể sử dụng
phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid).
1.230..

Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất HFCS

1.231..

HFCS (High Fructose Com Syrup) là một nhóm bất kì của siro bắp mà trải qua quá trình

enzym để làm tăng hàm lượng fructose và sau đó được pha trộn với siro bắp sạch (100%
glucose) để tạo thành dạng sản phẩm cần thiểt.
1.232..

Ngoài ra, enzym amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường

bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose fructose, sản xuất tương và

nước chấm... ở quy mơ cơng nghiệp.
1.233..

Enzym amylase có thể thu nhận từ các nguồn vi sinh vật (nấm sợi, nấm men hay vi

khuẩn), thực vật (có trong ngũ cốc nảy mầm với hàm lượng cao), động vật (trong tuyến
tụy và tuyến nước bọt).
2.1.3.

Gel alginate

1.234..

Tổng quan về gel alginate

1.235..

Alginate là một polyme anion có nguồn gốc tự nhiên thường thu được từ rong biển nâu,

và đã được nghiên cứu rộng rãi và sử dụng cho nhiều ứng dụng y sinh, do tính tương hợp
sinh học, độc tính thấp, giá thành tương đối thấp.
1.236..

Các phân tử thuốc, từ thuốc hóa dược đến protein đại phân tử, có thể được giải phóng

khỏi gel alginate một cách có kiểm sốt, tùy thuộc vào loại liên kết chéo và phương pháp
liên kết. Ngồi ra, gel alginate có thể được dùng bằng đường uống hoặc tiêm vào cơ thể
và cho phép ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm. Gel alginate cũng có triển vọng
để cấy ghép tế bào trong kỹ thuật mô. Kỹ thuật mô nhằm mục đích cung cấp các mơ và
cơ quan thay thế nhân tạo cho những bệnh nhân bị mất hoặc hỏng cơ quan hoặc mô.

Trong cách tiếp cận này, hydrogel được sử dụng để đưa các tế bào đến vị trí mong muốn,



Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

1.237..

cung cấp khơng gian cho sự hình thành mơ mới và kiểm sốt cấu trúc và chức năng của

mơ được thiết kế.

1.238..

Đặc điểm của gel alginate

1.239..

Sản phẩm khi hịa tan hồn toàn trong nước sẽ tạo thành dạng gel liên kết thành một

chuỗi các polyanion với sự sắp xếp của 2 thành phần: mannuronate và glucuronate có thể
là một chuỗi (M-M-M)-(G-G-G) hoặc có thể đó là (M-G-M-G). Tỉ lệ cao của glucuronate
làm gia tăng sự bền vững của gel.
1.240..

Phương pháp tạo hạt rất đơn giản. Hỗn hợp enzym và alginate được nhỏ xuống dung

dịch
CaCl2 để tạo hạt gel bao bọc lấy enzym.
1.241..

Khi cho hỗn hợp enzym và sodium alginate nhỏ từng giọt xuống dung dịch CaCl 2 sẽ tạo

thành những hạt kết tủa có cấu trúc bền vững (0,5 - 4mm) chứa enzym bên trong. Hạt có
cấu trúc bền vững. Để ổn định hạt gel có thể cho hạt gel trong dung dịch glutaraldehyde.
Tuy nhiên gel này lại không bền trong mơi trường có phosphate
1.242..

Enzym được bao bọc trong một màng khơng thẩm thấu đối với enzym và các chất có

trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu qua một cách dễ
dàng. Điều này cho phép tinh chế enzym từ dịch enzym thơ.
1.243..

Phương trình phản ứng

1.244..

2 Na(Alginate) + Ca2+ —> Ca(Alginate)2 + 2 Na+

2.1.4. Qui trình tinh chế enzym
Thêm 10 ml
dịch chiết khoai
lang

Cho từ từ 20
ml CaCl2 0,7
M, khuấy đều

Úp ngửa 10

Ủ 45 phút, úp
ngửa 5 lần mỗi 5
phút

Alginate trong đệm
CH3COONa 0,2 M
pH 4,8 30 ml

Cho vào becher

Lọc bỏ tủa
Amylase tinh chế

15

Lọc lấy tủa

Thôi enzym
Amylase bằng
cách cho dung
dịch glucose 2%
(20ml)
4 °C trong 12 giờ


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

2.2.

Kết quả

2.2.1.

Hàm lượng protein
1.245..
1.246..Mầu

1.250.. Enz
ym thô
1.254.. Enz
1.258..
ym tinh chế
2.2.2.

Bảng 2.1. Hàm lượng protein của enzym thơ và tinh chế

1.247..
O
1.248.. Thể tích
D280
(ml)
1.251.. 0
1.252..Vthơ = 10
,3621
1.255.. 0
1.256.. Vtinh chế
,4436
= 23

1.249..Hàm lượng

protein
1.253.. 72,4200
1.257..

10,2028

Hoạt tính enzym

1.259..Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD560
1.260..Bảng 2.1. Thơng số đường chuẩn tinh bột dùng để xác định hoạt độ Amylase
1.261..
1.262..
1.263..
1.264..
1.265..
1.266..
0
1
2
3
4
Ống
1.268..
1.269.. 1.270..
1.271..
1.272..
1.273..
1.282..
1.283..

U/ml
1.275..
OD560

1.285..

0
1.276..
0,025

0,2
1.277..
0,218

0,4 1.279..0
0,6
1.278..
0,424
,6093

0,8
1.280..

0,808

1.267..
5

1.274..
1

1.281..
0,9934

1.284..

Đường chuẩn từ dung dịch tinh bột 1% dùng để xác định hoạt độ enzym Amylase

2
1


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

1.286..Hoạt tính enzym

1.288..Mầu
1.294..Enzym
thơ
1.300..Enzym
1.306..tinh chế

1.287.. Bảng 2.2. Hoạt tính enzym thơ và tinh chế
1.289.. 1.290..O 1.291..
Đ 1.292..Hoạt
OD5 D560 ộ pha lỗng
tính tổng
60
thử
enzym (U)
1.295.. 1.296..0

1.297.. 1 1.298..737,600
1,0024 ,2585
00
1.301.. 1.302..0
1.303..
0,9651 ,2547
0

0
1 1.304..161,713
0

1.293..Hoạt tính
riêng
(U/protein)
1.299..10,1850
1.305..15,8500

1.307..Tính: Hiệu suất tinh chế và mức tinh chế
1.308..Xác định hàm lượng protein thơ bằng OD280nmn (n: hệ số pha lỗng)
1.309..^protein thơ = OD280nm x n x Vthô = 0,3621 x 20 x 10 = 74,72 (mg)
ỵ.protern tinh chế ^)^)'280nm x n x Vtinh chế = 0,4436 x 1 x 23 = 10,2028 (mg)
1.310..Định lượng hoạt tính amylase
1.311..Từ phương trình đường chuẩn xác định được lượng tinh bột tương ứng:
1.312..+ AOD280nm thô = 1,0024-0,2585 =0,7439^ Hoạt tính enzym = 0,7376 (U/ml)
1.313..

HTCemzym thơ = Hoạt tính enzym x n x Vthơ = 0,7376 x 100 x 10 = 737,6 (U)

1.314..+ AOD280nm tinh chế = 0,9651- 0,2547 = 0,7104 ^ Hoạt tính enzym = 0,7031 (U/ml)

1.315..

HTCemzym tinh chế = Hoạt tính enzym x n x Vtinh chế = 0,7031 x 10 x 23 = 161,713 (U)

1.316..+ Hoạt tính riêng của enzym tinh chế:
1.317..

HTRemzym tchế = HTCemzym j,ế/ỵProtein ci,ế = 161,713/10,2028 = 15,85(U/protein)
1

1

1.318..+ Hoạt tính riêng của enzym thô:
1.319..

HTRemzym thô = HTCemzym thô / IProteinthô = 737,6 / 72,42 = 10,185 (U/protein)

1.320..+ Hiệu suất cố định:
1.321..

HS = (HTCenzym tinh / HTCemzym thô ) x 100 = (161,713 / 737,6) x 100 = 21,92 %

1.322..+ Mức tinh chế = HTRemzym tinh chế / HTRemzym thô = 15,85 / 10,185 = 1,56
1.323..Nhận xét về hiệu suất tinh chế và mức tinh chế
1.324.. Quá trình tinh chế amylase bằng alginate đạt hiệu suất khá cao 21,92 %,
Sau tinh chế lượng enzym giảm nhiều nhưng hoạt tính chuyên biệt tăng 1,56 lần

2
2

Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

2.3.

Bàn luận

2.3.1.

Tổng lượng protein

1.325..Tổng lượng trong mẫu dịch enzym thô = 72,42 (mg)
1.326..Tổng lượng trong mẫu dịch enzym sau tinh chế là = 10,2028 (mg)

> Như vậy, quá trình tinh chế đã giúp loại đi một lượng các protein, trong đó các các
protein khơng phải là enzym amylase, Nhờ đó mẫu dịch enzym amylase sau tinh chế tinh
khiết hơn so với mẫu dịch enzym thơ ban đầu,
2.3.2.

Tổng hoạt tính của enzym:

1.327..Tổng hoạt tính của enzym thơ là U = 737,6 (U)
1.328..Tổng hoạt tính của enzym sau tinh chế là U = 161,713 (U)

> Như vậy, sau tinh chế thì tổng hoạt tính của dịch enzym bị giảm đi so với dịch thơ,
2.3.3.

Hoạt tính chun biệt của enzym

1.329..Hoạt tính riêng của enzym thơ là 10,185 (U/protein)

1.330..Hoạt tính riêng của enzym tinh chế là 15,85 (U/protein)
1.331..Mức tinh chế là 1,56 lần

> Như vậy, sau tinh chế thì hoạt tính của enzym amylase trong 1 mg protein tăng so với
trước tinh chế
1.332..Quá trình tinh chế amylase bằng alginate đạt hiệu suất khá cao 21,92%,
1.333..Sau tinh chế lượng enzym giảm nhiều nhưng hoạt tính chuyên biệt tăng 1,56 lần
1.334.. ❖ Kết luận: Vậy quá trình tinh chế đã đạt hiệu quả,

2
3


1.335..BÀI 3. CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINAT
3.1.

Tóm tắt lý thuyết

1.336..

Cố định enzym là định vị enzym trên một vùng không gian xác định của

chất

mang

nhưng vẫn giữ hoạt tính của nó, nhằm sử dụng enzym nhiều lần, làm enzym bền hơn
nên bảo quản tốt hơn và dễ dàng tinh chế sản phẩm, hơn nữa là các ứng dụng trong y
học, kỹ thuật sinh hóa, cơng nghiệp và mơi trường. Tuy nhiên, nó có thể làm giảm
hoạt tính enzym so với ban đầu do cản trở về mặt không gian giữa enzym và cơ chất.

Gồm các phương pháp cố định:
-

Các phương pháp cố định enzym thuận nghịch: hấp phụ, liên kết ion, liên kết ái lực,
liên
kết disulíide.

-

Các phương pháp cố định enzym khơng thuận nghịch: gắn enzym bằng liên kết
đồnghóa

trị

với chất mang, bắt giữ enzym vào khuôn gel, tạo vi nang bao, giữ enzym bằng màng
siêu
lọc.
1.337..

Thực hiện cố định enzym Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase) lên

alginat

bằng

phương pháp hấp phụ và bắt giữ vào khuôn gel (enzym không khuyếch tán ra khỏi
mạng lưới khuôn gel được nhưng cơ chất và sản phẩm có thể đi qua). CGTase là
enzym xúc tác phản ứng chuyển hóa tinh bột (và các chất tương tự) thành a-, 0- hay Ycyclodextrin (gồm 6, 7 và 8 đơn vị glucose).
1.338..

Tính hàm lượng và hiệu suất protein cố định bằng phương pháp tạo phức

màu

giữa

protein và thuốc thử Bradford, sau đó đo độ hấp thu ở À = 595 nm. Dựng đường chuẩn
sự thay đổi độ hấp thu của các mẫu thử protein chuẩn theo nồng độ. Từ đó, tính được
lượng protein ban đầu, lượng protein không cố định và lượng protein cố định dựa vào
độ hấp thu của chúng và đường chuẩn.
1.339..

Hoạt tính CGTase cố định được xác định bằng cách tính số Iimol 02
4


cyclodextrin

do

CGTase tạo ra trong 1 phút từ maltosedextrin ở điều kiện xác định. Lượng
cyclodextrin tính trên sự hấp thu và làm mất màu của nó đối với phenolphtalein. Dùng
phương pháp đo độ hấp thu để dựng đường chuẩn độ hấp thu theo nồng độ
cyclodextrin, và từ đường chuẩn có thể xác định lượng cyclodextrin tạo thành trong
mẫu thử xác định hoạt tính enzym.
1.340..

a.

2

5