Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời tính chất xâm nhiễm Epstein-Barr virus và tính chất methyl hóa vượt mức trên gene ức chế khối u ở bệnh nhân ung thư vòm họng Việt Nam

Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

Kỷ yếu khoa học

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI TÍNH CHẤT XÂM NHIỄM
EPSTEIN-BARR VIRUS VÀ TÍNH CHẤT METHYL HĨA VƯỢT MỨC TRÊN GENE
ỨC CHẾ KHỐI U Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG VIỆT NAM
Phan Thị Hiếu Nghĩa*, Bùi Thị Nhã Phương, Nguyễn Văn Yên, Lâm Hồng Ngọc
Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh
*
Tác giả liên hệ:
TĨM TẮT
Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai
nguyên nhân chủ yếu gây nên ung thư vòm họng (UTVH). Mục tiêu chính của nghiên cứu này
là xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán sớm UTVH dựa trên việc phát hiện đồng thời sự xâm
nhiễm của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi đã xây dựng cơ sở dữ liệu cho thực nghiệm phát hiện sớm UTVH dựa trên
hai yếu tố xâm nhiễm EBV và methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u bằng kỹ thuật
PCR và MSP với các cặp mồi được đánh giá tốt về mặt lý thuyết. Về mặt thực nghiệm, chúng
tôi đã xây dựng thành cơng quy trình phát hiện các gene EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2 của
EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của các gene ức chế khối u Ecadherin và Blu trên các mẫu bệnh phẩm. Sự hiện diện các gene mục tiêu của EBV và tính
chất methyl hóa của các gene E-cadherin và Blu có mối tương quan có ý nghĩa với sự hình
thành và phát triển khối u vòm họng (p<0,05). Việc xác định đồng thời sự hiện diện của một
trong các gene EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 và tính chất methyl hóa của một trong hai
gene E-cadherin và Blu là một dấu chứng sinh học tiềm năng cho việc chẩn đoán sớm UTVH
ở người bệnh Việt Nam.
Từ khóa: Epstein-Barr virus, methyl hóa vượt mức, ung thư vòm họng.
STUDYING OF CO-DETECTION OF EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTION AND
TUMOR SUPPRESSOR GENES’ HYPERMETHYLATION IN VIETNAMESE
NASOPHARYNGEAL CANCER PATIENTS
Phan Thi Hieu Nghia*, Bui Thi Nha Phuong, Nguyen Van Yen, Lam Hong Ngoc

Faculty of Biotechnology, Ho Chi Minh city Open University
*
Corresponding Author:
ABSTRACT
Epstein-Barr virus (EBV) and promoter hypermethylation of tumour suppressor genes (TSGs)
are two main causes leading to nasopharyngeal carcinoma (NPC). The main purpose of this
study is early diagnosis establishment for NPC based on co-detection EBV infection and
hypermethylation of TSGs. In this study, we built database for experimental research in order
to detect NPC early relied on two factors including EBV infection and hypermethylation of
TSGs by polymerase chain reaction (PCR) and methylation-specific polymerase chain
reaction (MSP) methods with primers were evaluated well about theory. In experimental
aspect, we successfully established the process to detect EBNA1, EBNA2, LMP1, and LMP2
genes of EBV and hypermethylation of E-cadherin and Blu genes promoter in clinical
samples. The presence of EBV genes and methylation of E-cadherin and Blu genes were
significant associated with NPC (p<0.05). The simultaneous determination on presence about
one of the EBNA1, EBNA2, LMP1, and LMP2 genes and methylation about one of E-cadherin
and Blu genes are potential biomarker for early diagnosis of NPC in Vietnamese patients.
Keywords: Epstein-Barr virus, hypermethylation, nasopharyngeal carcinoma.
nhất trong các bệnh ung thư đầu và cổ. Tỷ lệ
UTVH có sự khác biệt giữa các khu vực địa
lý, trong đó Việt Nam là một trong năm quốc
gia có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do UTVH

GIỚI THIỆU
Ung thư vịm họng (UTVH) là khối u ác tính
xuất phát từ tế bào biểu mơ vịm họng (Lung
et al., 2012). Đây là dạng ung thư phổ biến

94

Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

cao nhất khu vực Đông Nam Á (Mahdavifar
et al., 2016). Cụ thể, theo thống kê của
Globocan vào năm 2012, tỷ lệ mắc bệnh
UTVH là 3,9% và tỷ lệ tử vong do UTVH là
3,0%. Các phương pháp chẩn đoán UTVH
hiện nay chủ yếu dựa vào các triệu chứng
lâm sàng, nội soi vịm họng, xét nghiệm mơ
bệnh học, chẩn đoán huyết thanh EBV… Tuy
nhiên, khi phát hiện UTVH bằng các phương
pháp này thì khối u vịm họng đã phát triển
đến một mức độ nhất định. Do đó, việc xây
dựng một phương pháp tiên lượng, chẩn đoán
sớm UTVH là một yêu cầu cấp thiết nhằm
tầm soát UTVH, đưa ra những biện pháp
điều trị kịp thời, nâng cao hiệu quả điều trị và
tỷ lệ sống sót ở bệnh nhân UTVH.
Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa
vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai
nguyên quan trọng gây bệnh UTVH (Chu et
al., 2008; Thompson et al., 2004; Tsao et al.,
2014). EBV xâm nhiễm, tồn tại, nhân lên và
gây bệnh cho tế bào chủ nhờ vào sự hoạt
động của các gene thuộc họ EBNAs (EBNA1,
EBNA2, EBNA3), LMPs (LMP1, LMP2), …
(Chou et al., 2008; Korcum et al., 2006). Bên
cạnh đó, theo nghiên cứu của Tsai và cộng sự
(2002), EBV cịn có khả năng gây ung thư

gián tiếp qua bất hoạt sự hoạt động một số
gene ức chế khối u của tế bào chủ. Cụ thể,
trong nghiên cứu này, protein LMP1 của
EBV được chứng minh có chức năng hoạt
hóa de novo methyltransferase dẫn đến sự
methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của
Ecadherin, từ đó ức chế biểu hiện gene này.
Trong các gene ức chế khối u, Ecadherin và
Blu được chú ý đến bởi đây là các gene có
chức năng điều tiết các quá trình sinh học cơ
bản của tế bào như sự di chuyển, tăng sinh,
biệt hóa, chết theo chương trình tế bào
(apoptosis) và đóng vai trị quan trọng trong
việc ức chế sự tăng sinh của tế bào khối u ác
tính. Sự methyl hóa bất thường trên các gene
ức chế khối u E-cadherin, Blu đã được chứng
minh là nguyên nhân hình thành, phát triển
và di căn tế bào UTVH (Bossche et al., 2012;
Hutajulu et al., 2011; Richards et al., 2006;
Zhang et al. 2012). Do đó, việc kết hợp phát
hiện sự xâm nhiễm của EBV và tính chất
methyl hóa trên các gene ức chế khối u có ý
nghĩa ứng dụng phát triển thành một dấu
chứng sinh học nhằm tiên lượng cho bệnh
UTVH. Nghiên cứu này được thực hiện với

Kỷ yếu khoa học

mục tiêu thiết lập cơ sở dữ liệu, xây dựng
quy trình phát hiện đồng thời EBV và tính

chất methyl hóa trên các gene ức chế khối u
E-cadherin, Blu trên bệnh UTVH; đánh giá
mối tương quan giữa tính chất nhiễm EBV và
methyl hóa trên các gene E-cadherin và Blu
trong quá trình hình thành bệnh UTVH; từ
đó, hướng đến xây dựng một kỹ thuật chẩn
đốn sớm UTVH.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thu nhận mẫu
Tổng số 50 mẫu gồm 36 mẫu mô sinh thiết
UTVH và 14 mẫu dịch phết lành do Bệnh
viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh cung
cấp năm 2015. Các mẫu này được bảo quản
trong dung dịch PBS ở -20oC.
Tách chiết DNA, biến đổi bisulfite, phản
ứng PCR, MSP
DNA được tách chiết bằng phương pháp
Phenol/Chloroform theo quy trình tách chiết
của Chomczynski và Sacchi (1987) có thay
đổi chỉ số pH của phenol từ 4 thành 8. DNA
sau tách chiết được chia làm 2 phần: 1 phần
dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR
khuếch đại các gene mục tiêu của EBV, phần
còn lại sẽ được xử lý bằng bộ kit biến đổi
bisulfite MethylEdge® của hãng Promega, rồi
tiến hành phản ứng MSP để khảo sát sự
methyl hóa của các gene ức chế khối u. Sản
phẩm PCR, MSP được điện di trên gel
agarose 1,5%.
Phân tích kết quả thực nghiệm

Tần số phát hiện các gene EBNA1, EBNA2,
LMP1, LMP2 và tần số methyl, unmethyl hóa
các gene E-cadherin, Blu được tính tốn và
so sánh bằng phương pháp kiểm định Chi
bình phương (Chi-square test). Sự khác biệt
về tần số các gene giữa các nhóm được xem
là có ý nghĩa với p ≤ 0,05. Bên cạnh đó, các
giá trị tỷ suất chênh (OR), nguy cơ (RR)…
cũng được tính tốn bằng phần mềm
Medcalc®version 16.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khảo sát sự hiện diện các gene EBNA1,
EBNA2, LMP1, LMP2 của EBV
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho các băng
sáng rõ với kích thước 269 bp, 219 bp, 104
bp và 69 bp, tương ứng lần lượt với gene
EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 (hình 1).

95


Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

Kỷ yếu khoa học

Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gene của EBV trên mẫu mô UTVH
Ghi chú: L: thang chuẩn, N: chứng âm, 1 - 10: mẫu mô sinh thiết UTVH.

Bảng 1. Kết quả phân tích thống kê các gene EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2
EBNA1

EBNA2
LMP1
LMP2
PI ≥ 0,25
AUC
0,91
0,93
0,83
0,83
0,92
K
0,77
0,78
0,53
0,53
0,81
Se
88,9%
86,1%
66,7%
66,7%
91,7%
Sp
92,9%
100,0%
100,0%
100,0%
92,9%
OR
104,0

166,1
56,8
56,8
143,0
p
0,0001
0,0007
0,0063
0,0063
< 0,0001
RR
12,4
25,5
19,9
19,9
12,8
p
0,0090
0,0199
0,0322
0,0322
0,0082
Ghi chú: PI ≥ 0,25: ít nhất 1 trong 4 gene EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 được phát hiện.

Giá trị AUC (Accuracy) thể hiện độ chính
xác của phương pháp. Giá trị K (kappa) thể
hiện độ phù hợp của phương pháp chẩn đoán
lâm sàng và phương pháp chẩn đoán phân tử.
Se (Sensitivity): độ nhạy. Sp (Specificity): độ
đặc hiệu. OR (Odds ratio): tỷ suất chênh. RR

(Relative risk): nguy cơ tương đối.
Tần số phát hiện các gene EBNA1, EBNA2,
LMP1, LMP2 trong các mẫu bệnh lần lượt là
88,9%, 86,1%, 66,7% và 66,7%; trên các
mẫu lành, tần số phát hiện các gene này lần
lượt là 7,1%, 0%, 0% và 0%. Trong trường
hợp phát hiện ít nhất 1 trong 4 gene, tần số

phát hiện được nâng lên là 91,7%, do đó làm
tăng độ nhạy so với trường hợp phát hiện đơn
gene. Sự hiện diện 1 trong các gene của EBV
có mối tương quan có ý nghĩa với UTVH
(p<0,05). Các giá trị độ chính xác AUC, độ
phù hợp K trong trường hợp phát hiện đa
gene EBV cao hơn so với đơn gene (bảng 1),
bên cạnh đó, các giá trị này cũng cho phép
khẳng định phương pháp chấn đoán UTVH
dựa trên phát hiện đa gene EBV là hồn tồn
phù hợp với độ chính xác rất cao.
Khảo sát tính chất methyl hóa trên gene
E-cadherin và gene Blu

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm MSP khuếch đại gene E-cadherin, Blu trên các mẫu mô đã
biến đổi bisulfite
Ghi chú: L: thang chuẩn, (N): chứng âm, (1) - (3): mẫu bệnh, (5), (6): mẫu lành.

96


Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

Kỷ yếu khoa học

Kích thước sản phầm của E-cadherin là 204 phương pháp giải trình tự và được phân tích
bp đối với mồi methyl và 211 bp đối với mồi bằng phần mềm Bioedit. Kết quả phân tích
unmethyl.
cho thấy đoạn trình tự khuếch đại trên gene
Đối với Blu, kích thước sản phẩm lần lượt là E-cadherin có 19 vị trí CG, trong đó có 7 vị
231 bp và 235 bp đối với cặp mồi methyl và trí CG bị methyl hóa, 12 vị trí CG khơng bị
unmethyl.
methyl hóa. Đoạn trình tự khuếch đại trên
Tần số methyl hóa của gene E-cadherin trên gene Blu có 12 vị trí CG và cả 12 vị trí CG
mẫu bệnh là 97,2%, trên mẫu lành là 42,9%. này đều bị methyl hóa. Do đó, chúng tơi kết
Đối với gene Blu, tần số methyl hóa trên mẫu luận rằng trình tự promoter trên gene Ebệnh là 100%, trên mẫu lành là 64,3% (hình cadherin methyl hóa khơng hồn tồn, trình
2).
tự promoter trên gene Blu bị methyl hóa hồn
Trạng thái methyl hóa được xác định bằng tồn (kết quả khơng trình bày).
Bảng 2. Kết quả phân tích thống kê trường hợp methyl trên gene E-cadherin và Blu
E-cadherin
Blu
MI ≥ 0,5
AUC

0,77

0,68

0,64

0,61

0,44

0,37

Se

97,2%

100,0%

100,0%

Sp

57,1%

35,7%

28,6%

OR

46,7

42,3

31,3

p

0,0008

0,0139

0,0245

RR

2,3

1,6

1,4

p

0,0082

0,0248

0,0437

Ghi chú: MI ≥ 0,5: có sự methyl hóa trên ít nhất 1 trong 2 gene E-cadherin và Blu.

Sự kết hợp xác định tính chất methyl hóa trên hiệu của phương pháp chẩn đốn UTVH dựa
gene E-cadherin, Blu cho tần số methyl hóa trên xác định tính chất methyl hóa ở trường
là 100% và unmethyl hóa là 94,4% trên mẫu hợp đa gene thấp hơn so với trường hợp đơn
bệnh, cao hơn tần số methyl hóa của từng gene, nhưng độ nhạy của phương pháp chẩn
gene. Tính chất methyl hóa của các gene E- đốn dựa trên đa gene được nâng lên mức

cadherin và Blu có mối tương quan có ý cao nhất (Se = 100%).
nghĩa với UTVH (p<0,05). Bên cạnh đó, các Kết hợp phát hiện yếu tố nhiễm EBV và
giá trị AUC, kappa, độ nhạy, độ đặc hiệu, tính chất methyl hóa trên hai gene ức chế
OR, RR cũng được tính tốn, thể hiện ở bảng khối u
2. Mặc dù các giá trị AUC, kappa và độ đặc
Bảng 3. Kết quả phân tích thống kê kết hợp giá trị PI và MI
PI (PI ≥ 0,25) kết hợp MI (MI ≥ 0,5)
P (%)
N (%)
36 (100,0)
0 (0,0)
Mẫu bệnh (n = 36)
11 (78,6)
3 (21,4)
Mẫu lành (n = 14)
0,0277
p
0,61
AUC
K
0,28
100,0%
Se
21,4%
Sp
22,2
OR
0,0453
p
1,3

RR
0,0794
p

97


Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

Kết quả phân tích thống kê đồng thời giá trị
PI và MI cho tần số phát hiện là 100% trên
mẫu bệnh và 78,6% trên mẫu lành. Kết quả
này cho thấy giữa sự hiện diện các gene mục
tiêu của EBV, tính chất methyl hóa của các
gene E-cadherin, Blu với UTVH có mối liên
hệ chặt chẽ với nhau (p < 0,05). Dù được tiến
hành trên cỡ mẫu nhỏ nhưng nghiên cứu đã
xây dựng được một kỹ thuật chẩn đoán đạt
được độ nhạy cao (Se = 100%). Độ chính xác
AUC ở mức tương đối (AUC = 0,61), do đó
chúng tơi đề nghị tăng cỡ mẫu nhằm tăng độ
tin cậy của dữ liệu. Giá trị độ đặc hiệu Sp =
21,4% cho thấy trong nhiều nguyên nhân dẫn
đến UTVH, yếu tố nhiễm EBV và tính chất
methyl hóa vượt mức trên gene ức chế khối u
E-cadherin và Blu đóng góp 21,4% trong q
trình hình thành bệnh ở các mẫu bệnh khảo
sát. Bên cạnh đó, chỉ số thuộc khoảng mức
độ phù hợp nhẹ (
0,28) cho thấy về

mặt thực nghiệm, việc sử dụng tính chất
nhiễm EBV và methyl hóa trên gene Ecadherin và Blu trong chẩn đoán ở mức hỗ
trợ tương đối. Điều này cũng phù hợp về mặt
lý thuyết khi hiện nay chưa có nhiều công bố
về mối tương quan giữa 2 yếu tố nhiễm EBV
và tính chất methyl hóa trên gene E-cadherin
và Blu trong UTVH. Dù vậy, sự xâm nhiễm
của EBV và tính chất methyl hóa trên các
gene ức chế khối u này đều có ý nghĩa trong
q trình hình thành UTVH và hỗ trợ chẩn
đoán trong lâm sàng.
Phương pháp phát hiện đồng thời sự hiện
diện một trong bốn gene EBNA1, EBNA2,
LMP1, LMP2 và tính chất methyl hóa trên
một trong hai gene E-cadherin và Blu cho tần
số phát hiện, độ nhạy cao hơn so với trường
hợp phát hiện đơn gene. Bên cạnh đó,
phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là
PCR và MSP, đây là phương pháp có tính an
tồn, khơng tổn hại đến bệnh nhân và dễ thực
hiện. Ngoài ra, phương pháp này còn cho

Kỷ yếu khoa học

phép phát hiện đồng thời các dấu hiệu DNA
của EBV và tính chất methyl hóa trên hai
gene ức chế khối u một cách nhanh chóng
với độ chính xác cao trên nhiều loại mẫu, kể
cả xâm lấn và khơng xâm lấn. Do đó, phương
pháp xác định đồng thời tính chất xâm nhiễm

EBV và methyl hóa trên gene ức chế khối u
có thể được ứng dụng trong sàng lọc, chẩn
đoán sớm UTVH và lựa chọn những liệu
phát trị liệu phù hợp đối với những bệnh
nhân mắc UTVH.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Xây dựng thành cơng quy trình phát hiện
đồng thời yếu tố nhiễm EBV và tính chất
methyl hóa trên các gene ức chế khối u ở
bệnh nhân UTVH Việt Nam. Sự hiện diện
các gene mục tiêu của EBV và tính chất
methyl hóa của các gene E-cadherin và Blu
có mối tương quan với sự hình thành và phát
triển khối u vòm họng (p < 0,05). Việc xác
định đồng thời sự hiện diện của một trong
các gene EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2
và tính chất methyl hóa của một trong hai
gene E-cadherin và Blu là một dấu chứng
sinh học tiềm năng cho việc chẩn đoán sớm
UTVH ở người bệnh Việt Nam. Nhằm hướng
tới việc xây dựng một phương pháp chẩn
đốn khơng xâm lấn, nghiên cứu tiếp theo sẽ
được tiến hành trên các mẫu khơng xâm lấn
như dịch phết vịm họng; hoặc trên các mẫu
bệnh phẩm ít xâm lấn như mẫu máu tồn
phần hay huyết thanh. Bên cạnh đó, mở rộng
cỡ mẫu thí nghiệm để tăng độ tin cậy của dữ
liệu.
Lời cảm ơn
Nhóm tác giả chân thành cảm ơn ThS. Lao

Đức Thuận đã tận tình hướng dẫn, góp ý và
chỉnh sửa đề tài. Cảm ơn trường Đại học Mở
TP. HCM đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện
cho việc thực hiện đề tài.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
BOSSCHE, V. J., MALISSEN, B., MANTOVANI, A., BAETSELIER, P. D.,
GINDERACHTER, J. A. V. (2012). Regulation and function of the E-cadherin/catenin
complex in cells of the monocyte- macrophage lineage and DCs, Blood, 119(7), 16231633.
MAHDAVIFAR, N., GHONCHEH, M., MOHAMMADIAN-HAFSHEJANI, A.,
KHOSRAVI, B., SALEHINIYA, H. (2016). Epidemiology and Inequality in the
Incidence and Mortality of Nasopharynx Cancer in Asia, Osong Public Health Res
Perspect, 7(6), 360 - 372.

98


Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017

Kỷ yếu khoa học

TSAO, S. W., YIP, Y. L., TSANG, C. M., PANG, P. S., LAU, V. M., ZHANG, G., LO, K.
W. (2014). Etiological factors of nasopharyngeal carcinoma, Oraloncology, 50(5), 330338.
ZHANG, X., LIU, H., LI, B., HUANG, P., SHAO, J. AND HE, Z. (2012). Tumor suppressor
BLU inhibits proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells by regulation of cell cycle,
c-Jun N-terminal kinase and the cyclin D1 promoter, BMC Cancer, 12, 267.

99