Tài liệu thực tập Vi sinh

KHOA Y – ĐẠI HỌC TRÀ VINH

TÀI LIỆU THỰC TẬP VI SINH
DÀNH CHO Y2

BỘ MÔN VI SINH HỌC

TÀI LIỆU LƯU HÀNH NỘI BỘ - 2020


MỤC LỤC
NỘI QUI PHỊNG THÍ NGHIỆM......................................................................... 2
SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN .................................. 3
CÁCH LẤY VI KHUẨN ĐỂ CẤY VÀ LÀM PHẾT NHUỘM .......................... 5
VÀI ĐIỀU CƠ BẢN CẦN BIẾT KHI LẤY/CẤY CHUYỂN VI KHUẨN ........ 6
BÀI 1: NHUỘM GRAM – KHÁNG SINH ĐỒ .................................................... 7
BÀI 2: CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG .............................................................. 10
BÀI 3: TRỰC KHUẨN GRAM ÂM.................................................................... 14
BÀI 4: LẤY VÀ CHUYỂN BỆNH PHẨM ......................................................... 17
BÀI 5: CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG .............................................. 23
BÀI 6: PHẢN ỨNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN ...................................... 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 27

NGƢỜI BIÊN SOẠN
PGS, TS, BS Võ Thị Chi Mai

1


NỘI QUI PHỊNG THÍ NGHIỆM
 Sinh viên đến thực tập tại phịng thí nghiệm vi sinh phải:

- Cắt móng tay ngắn.
- Cắt tóc ngắn hoặc kẹp tóc thật gọn gàng.
- Trước khi vào phịng thí nghiệm, mặc áo chồng sạch theo qui định của Khoa.
- Đúng giờ. Trễ quá 10 phút, xem như vắng không phép. Vắng học phải được sự cho
phép của người quản lý lab hoặc điều phối viên.
-

Khơng tự ý chuyển nhóm học, nếu có việc bận cần chuyển nhóm với sinh viên khác
để tránh quá tải sinh viên – dụng cụ.

 Khi đến thực tập, sinh viên chịu trách nhiệm về các dụng cụ đã sử dụng buổi học. Hễ bị mất
hay làm hư hỏng thì phải mua trả lại.
 Các đồ dùng mang theo:
- Vở thực tập, bút viết, khăn giấy.
 Để tránh sự lây nhiễm nguy hiểm:
- Không để cặp-ba lô lên bàn thực tập.
- Không ăn uống trong giờ học. Không đùa giỡn trong phịng thí nghiệm.
- Đặt đồ dùng đúng chỗ qui định (thí dụ: pipette để vào bình đựng thuốc sát trùng; lam
kính đã dùng để vào thố đựng nước sát trùng; vòng cấy, kim cấy cắm trong giá; các lọ
thuốc nhuộm để ngay đúng các vị trí trong giá nhuộm).
- Phải đốt vịng/kim cấy trước và sau khi dùng. Khơng bao giờ để vòng/kim cấy chưa
đốt lên mặt bàn.
- Phải cẩn thận khi cầm lam kính đã làm phết vì vi khuẩn ở đây có thể cịn sống.
- Khơng được mang dụng cụ ra khỏi phịng thí nghiệm.
- Nếu đánh rơi vãi bất cứ vật gì nhiễm trùng phải lập tức đổ dung dịch sát trùng lên. Nếu
bị tai nạn phải báo ngay cho cán bộ phụ trách.
- Giữ gìn phịng thí nghiệm sạch sẽ.
- Khơng được: vẽ, viết lên tường/lên bàn, nhổ lên sàn, nhổ vào bồn rửa, vứt rác bừa bãi.
- Phải theo đúng chỉ dẫn của giảng viên.
 Sau mỗi buổi thực tập, sinh viên phải kiểm tra dụng cụ, cất kính hiển vi, phun cồn 70o khử

khuẩn mặt bàn thực tập. Rửa tay bằng nước xà phòng.
 Sinh viên phải đọc kỹ bài thực tập trước mỗi buổi thực tập để khỏi mất thì giờ và thu được kết
quả tốt.
 Vắng một buổi thực tập sinh viên khơng được thi cuối khóa.
PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH

2


SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN
I. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC
1. Cách tìm vi trường:
 Nhỏ một giọt dầu soi kính lên tiêu bản, đặt lam kính lên giá để vật.
 Xoay vật kính dầu (vật kính 100X) về đúng nấc.
 Nhẹ nhàng hạ vật kính xuống sao cho vật kính xuống sát tiêu bản và nhúng vào trong giọt dầu.
Tránh hạ vật kính xuống quá thấp làm vỡ tiêu bản.
 Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp:
- Nâng kính tụ quang lên hết mức.
- Mở hết chắn sáng.
- Bỏ lọc sáng (nếu có).
 Nhìn vào thị kính, dùng tay xoay ốc sơ cấp (ốc lớn) cho tới khi thấy được vi trường thì dừng
ngay.
 Chuyển sang điều chỉnh bằng ốc thứ cấp (ốc nhỏ) cho tới khi hình ảnh rõ nét.
2. Cách quan sát tiêu bản:
 Mắt nhìn vào thị kính.
 Một tay điều chỉnh ốc thứ cấp để cho hình ảnh ln rõ nét.
 Một tay điều chỉnh hai ốc chỉnh biên độ để di chuyển vị trí quan sát.
 Cần quan sát một mẫu vật trên tiêu bản một cách tuần tự theo đường zig-zag.
 Nhận xét chi tiết quan sát được:
- Chọn nơi vi khuẩn khơng q dày.

- Xác định hình thể của vi khuẩn.
- Cách bắt màu nhuộm.
- Cách sắp xếp của vi khuẩn.
- Đối với tiêu bản nhuộm từ bệnh phẩm, cần chú ý đến các tế bào khác ngoài vi khuẩn:
bạch cầu đa nhân, bạch cầu đơn nhân, tế bào biểu mơ...
Vi khuẩn nằm trong hay ngồi các tế bào? tế bào còn nguyên vẹn hay bị biến dạng?
3. Giữ gìn và bảo quản kính hiển vi:
Sau khi sử dụng:
- Nâng vật kính lên để tách vật kính ra khỏi tiêu bản. Lấy tiêu bản ra khỏi giá để vật.
- Xoay vật kính dầu tới vị trí dễ lau nhất. Dùng giấy lau kính đặc biệt do phịng thí
nghiệm phát lau sạch dầu ở vật kính đã nhúng dầu. Lưu ý: không sử dụng bất kỳ một
loại giấy nào khác để lau vật kính dầu.
- Xoay vật kính 10x vào nấc và điều chỉnh cho đến khi vật kính này xuống mức thấp
nhất.
- Điều chỉnh các ốc chỉnh biên độ về vị trí giữa.
- Cầm kính hiển vi bằng hai tay: một tay cầm thân kính, một tay đỡ bệ kính, và đem cất
vào đúng vị trí trong tủ kính.

3


4


CÁCH LẤY VI KHUẨN ĐỂ CẤY VÀ LÀM PHẾT NHUỘM

Hình 1: Cách cầm và mở ống nghiệm
- Cầm ống nghiệm có vi khuẩn ở tay trái; giữ ống nằm ngang hoặc nghiêng 450.
Tay phải cầm vòng cấy như cầm bút. Hơ đầu vịng cấy nóng đỏ trên ngọn đèn cồn.
- Mở nút gòn/nắp ống nghiệm bằng cách cặp vào giữa ngón út và lịng bàn tay phải.

- Sát trùng miệng ống nghiệm đã mở nút bằng cách xoay trên ngọn lửa. Đưa vòng cấy vào, lấy
ra một lượng nhỏ vi khuẩn để cấy hoặc làm phết nhuộm.
- Hơ nóng lại đầu ống nghiệm rồi đậy lại và đặt lên giá ống nghiệm.
- Sau khi làm phết, đốt đầu vòng cấy để diệt hết vi khuẩn cịn sót lại. Đặt thẳng đứng vịng cấy
đã vơ trùng vào giá.

5


Hình 2: Cách lấy vi khuẩn từ canh thang

VÀI ĐIỀU CƠ BẢN CẦN BIẾT KHI LẤY/CẤY CHUYỂN VI KHUẨN

1. Kim cấy và vòng cấy:
- Kim cấy và vòng cấy làm bằng sợi dây kim loại chrome/platin.
- Phải đốt vòng/kim cấy trước và sau khi lấy vi khuẩn. Phải để vòng/kim cấy đứng thẳng
trong ngọn lửa đèn cồn, từ phần nguội kéo dần ra phần nóng của ngọn lửa.

2. Các ống mơi trường:
- Phải hơ nóng miệng ống sau khi mở và trước khi đậy nút ống nghiệm. Nút phải được kẹp
ở ngón tay út, tránh chạm vào vật khác. Khi mở nút ống nghiệm, nghiêng đi một góc khoảng
450 để tránh các vi khuẩn từ mơi trường bên ngồi rơi thẳng vào ống nghiệm.
- Việc lấy vi khuẩn từ ống môi trường luôn thực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.
3. Đĩa Petri: Môi trường thạch cấy đựng trong đĩa Petri. Khi cấy chỉ hé nắp, không được mở
toang hết nắp đĩa Petri.

6


BÀI 1: NHUỘM GRAM – KHÁNG SINH ĐỒ

I. Mục tiêu:
1) Nhuộm Gram: Thực hiện được kỹ thuật. Lý giải được kết quả.
2) Chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn: Quán triệt tầm quan trọng của việc rửa tay.
3) Kháng sinh đồ: Thực hiện kỹ thuật định tính và đo được sự nhạy cảm kháng sinh.
II. CHUẨN BỊ TIÊU BẢN VI KHUẨN ĐỂ NHUỘM
1. Chuẩn bị lam kính:
Miếng lam kính dùng để phết vi khuẩn phải sạch và khô. Hơ qua ngọn đèn cồn và để nguội. Tránh
chạm các ngón tay vào mặt kính.
2. Cách gắn vi khuẩn vào miếng lam:
- Vẽ trên lam kính một vịng trịn đường kính 2 cm.
- Lấy một vịng cấy vi khuẩn từ mơi trường lỏng rồi trải mỏng trong diện tích của vịng đã vẽ. Nếu
lấy vi khuẩn từ mơi trường đặc thì phải nhỏ 1 giọt nước lên lam trước khi cho vi khuẩn vào và trải
đều.
- Để khơ ở ngồi khơng khí.
- Cố định phết vi khuẩn bằng cách hơ qua ngọn lửa.
III. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM
Đây là phương pháp nhuộm cơ bản trong vi khuẩn học. Nhuộm Gram còn gọi là phương pháp nhuộm
kép vì cách nhuộm này dùng 2 loại phẩm nhuộm tương phản màu sắc, đó là tím Gentian và đỏ
Safranin. Giúp phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm.
1. Nguyên tắc:
Dùng cồn ethanol tẩy màu hợp chất “Tím Gentian – Iode”. Vi khuẩn Gram dương khơng bị mất màu
tím. Vi khuẩn Gram âm bị cồn tẩy màu nên bắt màu nhuộm thứ nhì là đỏ Safranin.
2. Vật liệu:
2.1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli.
2.2. Lam kính
2.3. Bộ thuốc nhuộm Gram gồm:
* Tím gentian
* Lugol
* Ethanol 950

* Đỏ Safranin
3. Kỹ thuật: Làm phết vi khuẩn theo hướng dẫn trên.
- Phủ phẩm tím Gentian lên phết vi khuẩn 30 giây.
- Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa.
- Phủ dung dịch Lugol lên phết vi khuẩn 30 giây.
- Rửa nước.
- Tẩy ethanol 10 giây.
- Rửa nước.
- Phủ Safranin lên phết vi khuẩn 30 giây.
- Rửa nước. Thấm khô lam tiêu bản.
- Nhỏ một giọt dầu soi lên phết nhuộm. Quan sát qua kinh hiển vi với vật kính dầu. Ghi
nhận kết quả quan sát vi thể. Sau khi xem, cho lam tiêu bản vào thố đựng nước sát trùng.
IV. CHỨNG MINH SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN
1. Vật liệu:
Đĩa thạch dinh dưỡng (Nutrient agar, NA); bút lông.
2. Kỹ thuật:
Ghi tên nhóm, tổ, ngày tháng ở mặt ngồi đáy đĩa thạch.
2.1. Mở nắp 1 đĩa NA. Đặt ở trên bậu cửa sổ / mặt bàn / bồn rửa, trong vòng 15 phút.
7


2.2. Ở 1 đĩa NA khác, vạch 1 đường bên ngồi mặt đáy đĩa để chia đơi thành 2 phần A và B.
Ấn nhẹ 1 ngón tay lên mặt thạch: phần A là dấu ngón trước khi rửa tay; phần B là dấu của cùng ngón
ấy sau khi rửa tay.
2.3. Đậy nắp đĩa NA. Đặt ngược đĩa thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ủ 370C. 24 giờ
sau đọc kết quả.
3. Đọc kết quả:
Quan sát vi khuẩn mọc trên NA bằng mắt trần. Đếm số khúm vi khuẩn mọc. Ghi kết quả đĩa NA đặt
trong khơng khí và đĩa NA cấy dấu ngón tay.
Các lồi vi khuẩn thường tạo nên loại khuẩn lạc khác nhau về:

- Hình dạng: bờ viền, bề mặt.
- Kích thước: đường kính (mm).
- Màu sắc; độ trong/đục.
Sự khác nhau có thể tượng trưng cho những lồi vi khuẩn khác nhau.
Kết luận: có bao nhiêu loài vi khuẩn hiện diện trên đĩa thạch?
V. KHÁNG SINH ĐỒ
Kháng sinh đồ là phương pháp tìm độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh.
Có 2 phương pháp chính:
- Định tính: phương pháp đĩa giấy tẩm kháng sinh khuếch tán trên thạch theo Kirby-Bauer.
- Định lượng: tìm nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn (MIC, minimum
inhibitory concentration).
Kháng sinh đồ theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch
1. Nguyên tắc:
Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch ngăn chặn sự phát
triển của vi khuẩn. Vịng vơ khuẩn (khơng có vi khuẩn mọc) thể hiện vi khuẩn bị ức chế bởi thuốc
kháng sinh.
Kích thước đường kính vịng vơ khuẩn khác nhau tùy thuộc loại vi khuẩn và loại kháng sinh, phản
ánh 3 mức độ: nhạy cảm, trung gian, đề kháng. Trường hợp không có vịng ức chế, vi khuẩn kháng
lại thuốc kháng sinh.
2. Vật liệu:
2.1. Đĩa kháng sinh: Là những đĩa giấy đường kính 6mm được tẩm một hàm lượng dung
dịch kháng sinh theo tiêu chuẩn. Đĩa kháng sinh được cất giữ trong các ống có chứa chất chống ẩm,
ở nhiệt độ từ 2 – 80C. Khi chuẩn bị dùng thì lấy ra để ổn định ở nhiệt độ phịng khoảng 30 phút.
Có rất nhiều loại kháng sinh. Các tiêu chí lựa chọn kháng sinh thử nghiệm được hướng dẫn chi tiết.
Các tiêu chí chính là:
- Chọn kháng sinh đại diện cho nhóm có cùng hoạt phổ.
- Tùy thuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm.
- Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn.
- Tùy theo chiến lược và chính sách sử dụng kháng sinh từng vùng miền.
2.2. Môi trường:

Thường dùng môi trường Muller Hinton Agar (MHA). Chỉnh pH của môi trường từ 7,2 đến 7,4. Môi
trường được chế vào đĩa Petri với bề dày của thạch là 4 mm.
2.3. Dung dịch chuẩn độ đục:
Kích thước mầm cấy phải đạt được là từ 1x108 CFU/mL đến 2x108 CFU/mL (Colony Forming Unit).
Ta có thể dùng quang phổ kế hoặc so sánh độ đục của ống vi khuẩn với độ đục 0,5 của ống McFarland
để chuẩn hóa kích thước mầm cấy. Dung dịch chuẩn độ đục McFarland là dung dịch muối BaSO4.
2.4. Chuẩn bị mầm cấy:
Vi khuẩn thử nghiệm là Staphylococcus aureus hoặc Escherichia coli đã được thuần khiết. Chọn 3 –
4 khúm cấy vào ống có chứa 2 – 5 ml môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) hoặc BHI (Brain Heart
Infusion). Chỉnh độ đục của ống vi khuẩn. Dùng ngay trong vòng 15 phút sau khi chuẩn độ đục.
2.5. Vật liệu khác: que gịn vơ khuẩn, kẹp nhỏ, thố nước sát trùng.
8


3. Kỹ thuật:
3.1. Dùng que gòn tẩm canh cấy khuẩn, ép que lên thành trong ống nghiệm cho ráo.
3.2. Hé nắp đĩa thạch MHA, trải đều vi khuẩn lên mặt thạch bằng cách vừa đánh nhẹ vừa xoay
que gòn lên khắp mặt thạch 3 lần. Để đảm bảo trải đều vi khuẩn, xoay đĩa thạch mỗi lần 600, đánh và
xoay que gòn khắp mặt thạch từ trái qua, từ trên xuống. Bước cuối là kéo que gịn vịng theo rìa mặt
thạch. Bỏ que gòn vào thố nước sát trùng.
3.3. Chờ mặt thạch khô (khoảng 10 phút).
3.4. Hơ kẹp qua lửa, để nguội rồi gắp một đĩa kháng sinh, đặt nhẹ lên mặt thạch. Các đĩa
kháng sinh phải cách mép hộp thạch khoảng 1,5 cm và cách nhau khoảng 2 cm. Ấn nhẹ cho đĩa kháng
sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch. Không chạm kẹp vào thạch.
3.5. Đậy nắp và đem đĩa MHA ủ ở 350C trong 18-24 giờ.
3.6. Thực hành:
- Nhóm làm kháng sinh đồ với S aureus: đặt đĩa kháng sinh Penicillin, Cefoxitin, Imipenem,
Amikacin, Azithromycin, Cotrim.
- Nhóm làm kháng sinh đồ với E coli: đặt Ampicillin, Amoxicillin-clavulanate, Imipenem,
Ceftriaxone, Amikacin, Cotrim (= trimethoprim-sulfamethoxazole).

4. Đọc kết quả kháng sinh đồ:
4.1. Xung quanh đĩa kháng sinh khơng có vịng vơ khuẩn. Kết luận: Vi khuẩn đề kháng với
loại kháng sinh đó.
4.2. Xung quanh đĩa kháng sinh có một vịng vơ khuẩn, là nơi dưới tác động của kháng sinh
vi khuẩn không mọc được. Trong trường hợp này, ta đo đường kính vịng vơ khuẩn rồi so sánh với
đường kính chuẩn theo bảng hướng dẫn. Có 3 mức độ ảnh hưởng của kháng sinh đối với vi khuẩn
thử nghiệm:
 Nhạy cảm (S, susceptible); Trung gian (I, intermediate); Đề kháng (R, resitant).

4.3. Bảng hướng dẫn theo Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm của Mỹ (CLSI, Clinical
and Laboratory Standards Institute 2017):
- Đối với Staphylococcus aureus:
Tên kháng sinh
S
Penicillin 10 IU
≥ 29 mm
Cefoxitin 30 mcg
≥ 22
Ciprofloxacin 5mcg
≥ 21
Azithromycin 15 mcg
≥ 18
Amikacin 30 mcg
≥ 17
Cotrim 1,25/23,75 mcg
≥ 16

I
16-20
14-17

15-16
11-15

R
≤ 28 mm
≤ 21
≤ 15
≤ 13
≤ 14
≤ 10

- Đối với Escherichia coli:
Tên kháng sinh
Ampicillin 10 mcg
Amox-clav 20/10 mcg
Imipenem 10 mcg
Ceftriaxone 30 mcg
Amikacin 30 mcg
Cotrim 1,25/23,75 mcg

I
14-16
14-17
20-22
20-22
15-16
11-15

R
≤ 13 mm

≤ 13
≤ 19
≤ 19
≤ 14
≤ 10

S
≥ 17 mm
≥ 18
≥ 23
≥ 23
≥ 17
≥ 16

9


BÀI 2: CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG
Mục tiêu học tập:
1) Phân biệt được tụ cầu khuẩn và liên cầu khuẩn.
2) Định danh được tụ cầu vàng và tụ cầu không sinh coagulase thường gặp.
3) Phân biệt được liên cầu A, liên cầu B, phế cầu.

CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP
1.1. STAPHYLOCOCCI (Tụ cầu khuẩn)
 Vi thể: Staphylococci hình cầu, đường kính khoảng 1m, nhuộm màu Gram dương, xếp thành
đám giống hình chùm nho.
 Tăng trưởng: Mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh dưỡng
(NA: Nutrient Agar), canh thang dinh dưỡng (NB: Nutrient Broth).
 Môi trường Mannitol Salt Agar (MSA) là môi trường chọn lọc của Staphylococci vì có chứa

7,5% NaCl ức chế các vi khuẩn thường trú khác.
 Chủng Staphylococci gồm có ít nhất 30 lồi, trong đó có 4 lồi thường gặp trên lâm sàng là: S
aureus, S epidermidis, S saprophyticus, S haemolyticus.
1.2. STREPTOCOCCI (Liên cầu khuẩn)
 Vi thể: Streptococci có hình cầu hay hơi bầu dục, nhuộm màu Gram dương, xếp thành chuỗi
dài ngắn khác nhau. Ngồi ra vi khuẩn có thể đứng l hay thành đôi một.
 Tăng trưởng: Streptococci mọc trên các môi trường giàu chất dinh dưỡng như thạch máu cừu
(BA: blood agar), thạch nâu (CA: chocolate agar), canh tim óc hầm (BHI: Brain Heart Infusion)
trong điều kiện khí trường có 5 - 10% CO2.
 Tiêu huyết β, hoặc α, hoặc .
1.3. Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus, phế cầu khuẩn)
 Vi thể: Gram dương, hình mũi giáo, xếp thành đơi một, có khi xếp thành chuỗi ngắn.
 Tăng trưởng: Điều kiện nuôi cấy tương tự các Streptococci. Gây tiêu huyết  trên thạch máu
cừu. Dễ bị ly giải bởi các chất hoạt động bề mặt như muối mật. Nhạy cảm với optochin (Taxo
P).

10


Mahon et al., 2013

THỰC HÀNH
1. THỬ NGHIỆM CATALASE
1.1 Nguyên tắc
Enzyme catalase biến hydrogen peroxide thành nước và khí oxy.Thử nghiệm này giúp phân biệt
Staphylococci với Streptococci.
catalase

H2O2

2H2O + O2

1.2 Cách tiến hành
 Trên lame: Lấy vài khúm vi khuẩn đặt trên lame, sau đó nhỏ H2O2 3% lên vi khuẩn.
 Đọc kết quả: Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H 2O2 tiếp xúc với
vi khuẩn thử nghiệm catalase dương tính, cầu khuẩn này là Staphylococci. Nếu khơng có
sủi bọt  thử nghiệm catalase âm tính, cầu khuẩn này là Streptococci.
 Lưu ý: Vì hồng cầu có thể làm thử nghiệm catalase dương giả, do đó khi lấy vi khuẩn trên
thạch máu nên tránh tiếp xúc với môi trường.
2. THỬ NGHIỆM COAGULASE
2.1 Nguyên tắc
Enzyme coagulase hiện diện dưới hai dạng: dạng liên kết (clumping factor) và dạng tự do (free
coagulase), khi tiếp xúc huyết tương gây hiện tượng đông huyết tương. Đây là thử nghiệm quan
trọng để phân biệt Staphylococcus aureus với các loài Staphylococci khác.
2.2 Cách tiến hành
 Trên lame: tìm coagulase liên kết.
11








Nhỏ một giọt nước cất vô trùng trên lame, lấy vài khúm vi khuẩn trộn với giọt nước để tạo
huyền dịch vi khuẩn. Sau đó nhỏ một giọt huyết tương bên cạnh rồi trộn lẫn huyết tương và
vi khuẩn.
Đọc kết quả: trong vòng 10 giây, nếu xuất hiện những hạt lợn cợn  thử nghiệm coagulase
dương tính.

Lưu ý:
Nếu để lâu trên 10 giây, phản ứng dương tính giả có thể xảy ra.
Làm thử nghiệm với vi khuẩn mọc ở môi trường có nồng độ muối cao như MSA có thể
cho phản ứng dương tính giả.
Thử nghiệm coagulase trên lame âm tính đều phải tiến hành tìm coagulase tự do.

 Trong ống nghiệm: tìm coagulase tự do.
 Lấy hai ống nghiệm có chứa 0,5 mL canh cấy S aureus và S epidermidis. Nhỏ lần lượt 0,5
mL huyết tương người/thỏ (pha loãng 1:5) vào hai ống nghiệm trên, trộn lẫn huyết tương
và vi khuẩn. Đem ủ cách thủy 35oC/4 giờ.
 Đọc kết quả: Sau 1-4 giờ nếu có hiện tượng đơng huyết tương  thử nghiệm coagulase
dương tính.
- Staphylococcus aureus: làm đơng đặc huyết tương.
- Staphylococcus epidermidis: không làm đông đặc huyết tương.
Lưu ý: Nếu sau 4 giờ không thấy huyết tương đơng phải ủ tiếp ở nhiệt độ phịng thí nghiệm
và đọc kết quả sau 18 giờ.
3. THỬ NGHIỆM LÊN MEN MANNITOL
3.1 Nguyên tắc
S aureus có khả năng lên men đường mannitol. Trên môi trường MSA (Mannitol Salt Agar), acid
sinh ra sẽ làm đổi màu chất chỉ thị phenol red từ đỏ sang vàng.
3.2 Cách tiến hành
 Lấy vi khuẩn S aureus từ ống NA, vạch zig-zag lên mặt nghiêng ống thạch MSA thứ nhất. Chú
ý không làm rách mặt thạch.
 Lấy vi khuẩn S epidermidis từ ống NA, vạch zig-zag lên mặt nghiêng ống thạch MSA thứ nhì.
Khơng làm rách mặt thạch.
 Đem ủ 35oC/18 – 24 giờ.
3.3 Đọc kết quả
 Ống MSA 1 chuyển sang màu vàng  S aureus lên men đường mannitol.
 Ống MSA 2 vẫn giữ màu đỏ  S epidermidis không lên men đường mannitol.
4. THỬ NGHIỆM PHÂN LOẠI TIÊU HUYẾT CỦA STREPTOCOCCI

4.1 Cách tiến hành: Dùng vòng cấy lấy vi khuẩn Streptococci vạch 3 chiều lên hộp thạch máu,
đem ủ 35oC/24 giờ trong bình nến.
4.2 Đọc kết quả
 Tiêu huyết : hồng cầu bị ly giải hồn tồn, tạo nên vịng tiêu huyết sáng, trong, bao quanh
khúm vi khuẩn trên thạch máu.
 Tiêu huyết : hồng cầu bị ly giải khơng hồn tồn, tạo nên vòng tiêu huyết mờ, hơi ánh lên
màu xanh.
 Tiêu huyết : hồng cầu không bị ly giải nên không có vịng tiêu huyết.
5. THỬ NGHIỆM NHẠY CẢM VỚI BACITRACIN (TAXO A)
5.1 Nguyên tắc
Streptococcus tiêu huyết  nhóm A (Streptococcus pyogenes) nhạy cảm với bacitracin. Thử nghiệm
này phân biệt nhóm A với Streptococcus tiêu huyết  thuộc các nhóm khác.
12


5.2 Cách tiến hành
Dùng que gịn vơ trùng lấy vi khuẩn Streptococcus tiêu huyết  trong canh cấy trải đều lên mặt
thạch máu. Chờ mặt thạch khơ, đặt lên đó đĩa Taxo A là đĩa giấy tẩm 0,04 đơn vị bacitracin. Ủ
35oC/18-24 giờ trong bình nến.
5.3 Đọc kết quả
Xung quanh đĩa giấy tẩm kháng sinh bacitracin có vịng vơ khuẩn  thử nghiệm Taxo A dương
tính. Kết luận vi khuẩn là Streptococcus pyogenes.
6. THỬ NGHIỆM CAMP (Christie, Atkins và Munch – Peterson)
6.1 Nguyên tắc
Streptococci tiêu huyết  nhóm B (Streptococcus agalactiae) tiết ra yếu tố CAMP có tác dụng hiệp
đồng tiêu huyết với -lysin của S aureus.
6.2 Cách tiến hành
 Cấy một đường thẳng dịng vi khuẩn S aureus có sinh -lysin.
 Sau đó vạch một đường cấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết  (khơng phải nhóm A) thẳng
góc với đường cấy S aureus nhưng cách 1-2 mm.

 Ủ 35oC/18 giờ. Hoặc 35oC/6 giờ trong bình nến.
6.3 Đọc kết quả
Nếu thấy vùng tiêu huyết của S aureus ở nơi tiếp cận Streptococci rộng hơn, sáng hơn, có dạng cánh
cung/vảy cá  thử nghiệm CAMP dương tính. Đó là do yếu tố CAMP của Streptococcus agalactiae
làm gia tăng vùng tiêu huyết của S aureus.
7. THỬ NGHIỆM NHẠY CẢM OPTOCHIN (TAXO P)
7.1 Nguyên tắc
Pneumococcus nhạy cảm với optochin, thử nghiệm này được áp dụng để phân biệt Pneumococcus
với các Streptococci tiêu huyết  khác (ví dụ Streptococcus viridans).
7.2 Cách tiến hành
Dùng que gòn lấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết  trong canh cấy trải đều lên mặt thạch máu.
Chờ mặt thạch khô, đặt đĩa Taxo P là đĩa giấy tẩm 5 g optochin. Ủ 35oC/18 giờ trong bình nến.
7.3 Đọc kết quả
Xung quanh đĩa optochin xuất hiện vịng vơ khuẩn với đường kính  14 mm  thử nghiệm Taxo
P dương tính. Kết luận: Streptococcus pneumoniae.
Lưu ý: Nếu đường kính vịng vơ khuẩn < 14 mm cần tiến hành làm thử nghiệm tan trong muối mật
để xác định Pneumococcus.

13


BÀI 3: TRỰC KHUẨN GRAM ÂM
Mục tiêu học tập:
1) Liệt kê được tính chất dùng phân biệt Họ Vi khuẩn đường ruột với những trực khuẩn
Gram âm khác.
2) Nhận định được khúm lên men hoặc không lên men lactose trên thạch phân lập Mac
Conkey.
3) Thực hiện được thử nghiệm oxidase, xác định tính di động, khả năng lên men đường,
đọc phản ứng IMViC của trực khuẩn Gram âm.

VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROBACTERIACEAE)
A. ĐẠI CƢƠNG
I. TÍNH CHẤT:
Đây là những vi khuẩn tìm thấy trong ruột người và động vật, có ở trong đất và cây cối. Một số là
ký sinh, số khác là hoại sinh. Vi khuẩn đường ruột có tính chất chung sau:
- Trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi.
- Đa số di động nhờ tiên mao (flagella) xung quanh thân, một số không di động (Shigella,
Klebsiella).
- Lên men đường glucose (sinh hơi hoặc không).
- Khử nitrate thành nitrite.
- Không sản xuất enzyme oxidase.
Những vi khuẩn đường ruột thường gây bệnh cho người là:

-

1. Các nhóm E coli gây tiêu chảy:
EPEC (enteropathogenic E coli): chủ yếu gây bệnh ở tr em.
ETEC (enterotoxigenic E coli): gây bệnh do tiết độc tố ruột loại dễ bị hủy bởi nhiệt (LT) và
loại bền với nhiệt (ST).
EIEC (enteroinvasive E coli): gây bệnh do xâm lấn tế bào.
EHEC (enterohemorrhagic E coli): gây bệnh do tiết độc tố verotoxin.
EAEC (enteroadherent E coli): có khả năng bám dính bề mặt niêm mạc ruột.

-

2. Shigella: Gây bệnh lỵ trực khuẩn, có bốn nhóm:
Nhóm A: S dysenteriae: tiết độc tố shiga.
Nhóm B: S flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga-like toxin).
Nhóm C: S boydii: khơng tiết độc tố.
Nhóm D: S sonnei: tiết độc tố giống shiga.

-

3. Salmonella: Có trên 2200 týp huyết thanh khác nhau. Việc xác định týp dựa vào công thức
kháng nguyên O, H và K. Hiện nay, dựa vào nghiên cứu DNA, người ta chia Salmonella làm 2 lồi:
Salmonella enterica và Salmonella bongori.
Salmonella enterica có 6 phụ lồi (subspecies). Phụ lồi I, cịn gọi là Salmonella enterica subsp.
enterica, có 3 tác nhân gây bệnh quan trọng:

-

Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi gây sốt thương hàn.
Salmonella enterica subsp. enterica serotype Choleraesuis gây nhiễm khuẩn huyết và áp-xe
khu trú ở các cơ quan nội tạng.
Salmonella enterica subsp. enterica serotype Paratyphi gây sốt phó thương hàn.

-

4. Yersinia:
Y pestis: gây bệnh dịch hạch.
Y enterocolitica: nhiễm khuẩn tiêu hóa, triệu chứng giống Shigella.
Y pseudotuberculosis: nhiễm khuẩn huyết, viêm hạch màng treo ruột.

-

14


II. CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG CHO TRỰC KHUẨN GRAM ÂM
1. Môi trƣờng vận chuyển: Dùng để chuyên chở bệnh phẩm, chứa rất ít chất dinh dưỡng

(chỉ có muối đệm) chỉ đủ để vi khuẩn sống nhưng không phát triển. Loại thường dùng là CaryBlair.
2. Môi trƣờng phân lập:
- Môi trường không ngăn chận: không chứa bất cứ chất ức chế nào. Ví dụ: thạch máu (BA),
thạch dinh dưỡng (NA), canh thang BHI.
- Mơi trường phân biệt có chọn lọc: tùy theo thành phần ức chế có trong mơi trường, được
phân biệt thành:
 Môi trường phân biệt - chọn lọc ít. Ví dụ: thạch MC (MacConkey), thạch EMB (Eosin
Methylene Blue).
 Mơi trường phân biệt - chọn lọc vừa. Ví dụ: thạch SS (Salmonella-Shigella), thạch
Deoxycholate-Citrate, Hektoen Enteric.
 Môi trường phân biệt - chọn lọc cao. Ví dụ: thạch Brilliant Green Bile Lactose…
3. Môi trƣờng phong phú: Dùng để tăng sinh loại vi khuẩn cần tìm. Ví dụ: canh GN (Gram
negative), canh Selenite F…
4. Mơi trƣờng xác định tính chất sinh hóa cơ bản của vi khuẩn:
Một số môi trường được sử dụng gồm: KIA (Kligler’s iron agar), TSI (triple sugar iron agar), SIM,
MR-VP, citrate, …
Phản ứng định danh đơn giản trực khuẩn Gram âm: IMViC = Indole, MR, VP, Citrate.
Kết quả cấy trực khuẩn Gram âm vào KIA, TSI
Kligler s iron agar (KIA) là mơi trường có 2 đường: glucose và lactose. Mơi trường cịn chứa đỏ
phenol làm chất chỉ thị pH để xem có sự lên men hay khơng, và sulfate sắt để tìm H2S làm đen
mơi trường. Nồng độ glucose bằng 1/10 nồng độ lactose. Nồng độ acid rất thấp được sinh ra bởi
glucose, do đó, ở phần thạch nghiêng (slant) sẽ bị oxid hóa mau chóng, và nếu lactose khơng được
lên men thì thạch nghiêng sẽ trở lại tính kiềm (đỏ). Trái lại, dưới trương lực oxygen thấp của phần
thạch đứng (butt), tác dụng acid được duy trì và khơng trở lại tính kiềm.
Do đó, một ống có phần thạch đứng acid (vàng) và phần thạch nghiêng kiềm (đỏ) là dấu hiệu chỉ
có sự lên men glucose mà thơi. Nếu lactose được sử dụng thì cả hai phần thạch đứng và nghiêng
đều vàng cả.
Sự sản xuất gas từ glucose được ghi nhận bởi bọt khí, hay đơi khi bởi sự bể nát cột thạch.
Pseudomonas và những lồi khơng lên men đường mọc được trên mặt thạch nhưng không làm biến
màu ống môi trường.

Môi trường TSI (Triple Sugar Iron) chỉ khác KIA ở chỗ có thêm đường saccharose (sucrose).
Sucrose có nồng độ như lactose, nghĩa là gấp 10 glucose; sự sử dụng sucrose cũng giống lactose,
được ghi nhận bởi sự acid hóa ở phần thạch đứng và thạch nghiêng. Mơi trường này giúp ta tìm ra
những vi khuẩn lên men lactose chậm (nhiều ngày), vì người ta thấy rằng đa số vi khuẩn đường
ruột lên men lactose chậm đều lên men sucrose sau một ngày.
Thử nghiệm tìm H2S, indole, di động
Môi trường sử dụng là ống SIM, là 1 loại thạch mềm (bán lỏng, semisolid).
- Sinh hydrogen sulfite (H2S): vi khuẩn nào khử được sulfite thì sử dụng hợp chất chứa lưu
huỳnh (thiosulfate) tạo ra H2S. Chất này phản ứng với ion sắt trong môi trường thành kết tủa FeS
màu đen.
- Sinh indole: vi khuẩn có enzyme tryptophanase khử tryptophan trong peptone của mơi
trường tạo ra sản phẩm có gốc indole. Sản phẩm này kết hợp nhân benzene của thuốc thử thành
phức chất quinone màu đỏ.
- Tính di động: vi khuẩn di động làm đục hết mơi trường; lồi không di động chỉ mọc theo
đường kim cấy.
15


Phản ứng MR (methyl red)
Phân biệt mức độ lên men đường glucose của vi khuẩn.
- Vi khuẩn lên men glucose mạnh tạo nên sản phẩm cuối cùng là phức hợp acid bền, làm
môi trường chuyển sang pH acid < 4,4 khiến cho thuốc thử methyl red có màu đỏ. Kết luận: MR
dương tính.
- Vi khuẩn lên men glucose yếu thì tính acid khơng đủ làm đỏ thuốc thử; khi pH > 6 methyl
red có màu vàng. Kết luận: MR âm tính.
Phản ứng VP (Voges-Proskauer)
Giúp phát hiện sản phẩm trung gian acetoin tạo ra trong quá trình lên men glucose.
Với thuốc thử cho vào, acetoin bị oxid hóa thành diacetyl rồi kết hợp với thuốc thử thành phức
hợp màu đỏ: phản ứng dương tính.
Phản ứng VP âm tính nếu chỉ có màu thuốc thử.

Thử nghiệm citrate
Giúp nhận biết khả năng vi khuẩn sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất. Vi khuẩn sử dung
citrate thì cũng sử dụng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Mơi trường ni có chứa
sodium citrate và muối ammonium.
Cả 2 khả năng đều làm kiềm hóa môi trường, biến chất chỉ thị màu bromothymol blue từ xanh lục
thành xanh dương. Phản ứng citrate dương tính: màu xanh dương.
Phản ứng âm tính: mơi trường khơng đổi màu xanh lục vì vi khuẩn khơng mọc.

B. THỰC HÀNH
1.

Nhuộm Gram 1 trực khuẩn đường ruột mọc trên đĩa thạch MC.

2.

Thực hiện phản ứng oxidase.

a. Nguyên tắc: thử nghiệm cytochrome oxidase dùng một số thuốc nhuộm như pphenylenediamine dihydrochloride để làm chất tiếp nhận electron thay thế oxygen. Ở thế khử,
thuốc nhuộm khơng màu, tuy nhiên, khi có sự hiện diện của cytochrome oxidase và oxygen khí
trời thì p-phenylenediamine bị oxid hóa và thành lập indophenol blue.
b. Cách làm: dùng vịng cấy lấy 1 khúm vi khuẩn rồi trải lên 1 đĩa giấy oxidase đã tẩm
dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%.
c. Đọc kết quả:
Phản ứng dương: đĩa giấy có màu tím đen trong khoảng 10 - 20 giây.
Phản ứng âm: khơng có sự đổi màu.
3.

Lý giải phản ứng ống thạch KIA, ống SIM.

4. Đọc phản ứng dãy sinh hóa cơ bản của E coli, Shigella sonnei, Proteus mirabilis hoặc Salmonella

enteritidis, Pseudomonas aeruginosa.
5. Cho biết chất ức chế trong thành phần môi trường phân biệt-chọn lọc thường dùng: MC, EMB,
SS.

16


BÀI 4: LẤY VÀ CHUYỂN BỆNH PHẨM
Mục tiêu:
1/ Mô tả kỹ thuật thích đáng để thu thập các loại bệnh phẩm khác nhau.
2/ Ghi nhớ những bệnh phẩm không dùng ni cấy kỵ khí.
3/ Biết cách bảo quản và chuyển các loại bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm.
4/ Thực hiện đúng đắn các kỹ thuật đơn giản lấy và gởi bệnh phẩm máu, đàm, mủ, phân, nước tiểu
đến xét nghiệm vi sinh.

MỞ ĐẦU

Phẩm chất của bệnh phẩm quyết định thông tin chẩn đoán.
Hậu quả của việc thu thập và chuyển bệnh phẩm không đúng cách:
 không phân lập được tác nhân gây bệnh
 phân lập vi khuẩn tạp nhiễm hoặc vi khuẩn thường trú
cho thuốc không đúng.

HƢỚNG DẪN LẤY BỆNH PHẨM









Lấy bệnh phẩm lúc bệnh ở giai đoạn cấp tính và trước khi cho kháng sinh là tốt nhất.
Cẩn thận không làm nhiễm bề mặt vật chứa và phiếu xét nghiệm.
Vật chứa phải thích hợp, đã tiệt trùng, có nút/nắp đậy, khơng được rị rỉ.
Tránh tạp nhiễm vi khuẩn thường trú. Dùng dụng cụ và kỹ thuật vô khuẩn để khơng
đưa vi sinh vật bên ngồi vào cơ quan khi làm những thủ thuật can thiệp.
Vùng da lành: lau sạch trước với cồn 70o vùng da rộng, sau đó bơi povidone iodine
khoảng 3cm tập trung ở chỗ chích rút bệnh phẩm (máu, ổ áp xe). Chờ khô thuốc sát
trùng mới lấy bệnh phẩm. Lau lại với cồn sau khi lấy bệnh phẩm.
Lấy đủ chất thử.
Ghi nhãn lọ bệnh phẩm: họ tên, tuổi bệnh nhân; số nhập viện; ngày giờ lấy chất thử;
khoa gửi bệnh phẩm.
Ghi phiếu xét nghiệm: như trên + loại chất thử; chẩn đoán; yêu cầu xét nghiệm; tên bác
sĩ yêu cầu.

CHỌN LỰA CHẤT THỬ

Vết phỏng, Loét do nằm lâu, Loét do dãn tĩnh mạch, Ap xe quanh hậu môn, Tổn thương
hoại tử, Tổn thương nha chu: tốt nhất là mẫu mô/mẫu sinh thiết, dịch hút, nếu dùng que
gịn phải thấm đẫm dịch tiết/mủ.

Khơng ni cấy: chất tiết mở thông đại tràng, sản dịch, chất nôn, đầu ống thơng Foley.
Khơng ni cấy kỵ khí: phết ngốy mũi hầu, họng
dịch súc rửa phế quản-phế nang (không bảo vệ)
chất hút qua nội khí quản hay mở thơng khí quản
đàm ho khạc
phết niệu đạo
nước tiểu do tiểu bình thường hoặc đặt ống thông
phân hay bệnh phẩm trong trực tràng

sản dịch, phết âm hộ, phết cổ tử cung
dịch tuyến tiền liệt, tinh dịch.
Chọn vị trí thích hợp để lấy bệnh phẩm cấy kỵ khí. Tốt nhất là mẫu mơ/mẫu sinh thiết, đặt
trong mơi trường chun chở kỵ khí. Hoặc dùng ống tiêm rút dịch, cho vào ống nghiệm
chân không hay môi trường chun chở kỵ khí. Nếu dùng que gịn phải thấm đẫm dịch
tiết/mủ rồi cắm ngay vào môi trường chuyên chở kỵ khí.

17


HƢỚNG DẪN LẤY BỆNH PHẨM

1. Máu :
a. Thời gian và số lần:
Sốt thường theo sau nhiễm khuẩn huyết 30 – 90 phút, vì thế thời gian lấy máu tốt nhất là
lúc xuất hiện cơn lạnh run; hoặc ngay sau khi bắt đầu tăng thân nhiệt. Riêng đối với những
trường hợp sốt liên tục (như viêm nội tâm mạc, viêm nội mạch, nhiễm trùng khơng kiểm sốt
được, giai đoạn sớm của sốt thương hàn, nhiễm brucella) thì thời điểm lấy máu khơng quan
trọng.
Cấy máu một lần hiếm khi là đủ. Ít nhất nên cấy máu 2 lần để loại trừ hay xác định chẩn
đoán nhiễm khuẩn huyết. Cấy máu nhiều hơn 3 lần không cung cấp thêm nhiều thông tin hơn.
Nếu đủ điều kiện mỗi lần lấy máu nên cấy hiếu khí và kỵ khí.
+ Nhiễm khuẩn huyết cấp tính: 2-3 lần ở những vị trí khác nhau.
+ Viêm nội tâm mạc cấp tính: 3 lần cách nhau 1-2 giờ ở những vị trí khác nhau.
+ Viêm nội tâm mạc bán cấp: như viêm nội tâm mạc cấp tính. Nếu sau 24 giờ 3 mẫu đầu
âm tính thì cấy thêm 3 mẫu khác.
+ Viêm nội tâm mạc đã dùng kháng sinh trước khi nhập viện 1–2 tuần: 2 mẫu máu mỗi
ngày trong 3 ngày.
b. Lượng máu: tỉ lệ máu/mơi trưịng 1/5 – 1/10.
 Tr nhỏ và tr em 1-5 mL

 Người lớn 10-30 mL
Có thể dùng canh cấy tự chế 50 mL mỗi chai (tryptic soy broth hay brain heart infusion,
thêm 0,025% Sodium Polyanethol Sulfonate) hoặc chai cấy máu bán sẵn.
Lưu ý: SPS có thể ức chế vài cầu khuẩn như meningococcus, gonococcus,…
Chai cấy máu bán trên thị trường như Bactec, Bact/Alert ngồi mơi trường ni cấy bổ
dưỡng cịn chứa chất hấp phụ kháng sinh đã dùng.
c. Cách lấy máu:
Sát trùng da chỗ lấy máu đúng cách. Sát trùng nắp cao su chai cấy máu. Chờ khơ. Chích
lấy máu tĩnh mạch hay động mạch.
2. Hệ thần kinh trung ƣơng:
a. Dịch não tủy:
Do bác sĩ chuyên khoa chọc hút giữa đốt sống lưng L3- L4 hoặc L4-L5. Đảm bảo thao tác
vô trùng. Rút 5 mL dịch não tủy cho vào 3-4 lọ và gởi lọ đục nhất đến xét nghiệm vi sinh
ngay. Các lọ kia để thử sinh hóa và tế bào. Nếu được lượng dịch không đủ, bác sĩ điều trị
phải cân nhắc theo thứ tự ưu tiên của xét nghiệm. Xử lý mẫu quá ít thường dẫn đến kết quả
âm giả và điều này có hại hơn là chọc hút lại cho có đủ thể tích.
 1mL để cấy vi khuẩn, virus.  2 mL để cấy vi nấm và vi khuẩn lao.
b. Áp xe não, mô sinh thiết:
Lấy mẫu khi phẫu thuật. Phải có cấy kỵ khí.
3. Đƣờng tiêu hóa:
a. Phân:
Lấy khoảng 1mL phân hay cỡ hạt bắp vào lọ khơ, sạch hay lọ vơ trùng có nắp đậy. Chọn
chỗ phân dính cả đàm nhầy lẫn máu, nếu có.
Trường hợp không gửi ngay được: < 1 giờ, giữ ở nhiệt độ phòng. < 24 giờ, giữ ở 4oC. Nếu
lâu hơn, cho phân vào môi trường chuyên chở để ở nhiệt độ phịng.
Khơng gửi cấy phân nếu bệnh nhân đã nằm viện trên 3 ngày và khơng có chẩn đốn viêm
dạ dày-ruột.
Nên nghĩ đến viêm ruột do Clostridium difficile khi bệnh nhân nội trú tiêu lỏng hoặc phân
mềm > 5 lần trong 24 giờ.
b. Ngốy trực tràng:

Cho đầu que gịn vào qua khỏi cơ thắt hậu môn 1 cm, xoay que gịn để lấy mẫu ở các khe
hậu mơn. Khơng dùng ngốy trực tràng để soi tươi tìm vi khuẩn dịch tả.
18


c. Hút dịch dạ dày.
- Nước súc rửa dạ dày để tìm vi khuẩn lao:
Làm thủ thuật sáng sớm sau khi thức dậy.
Luồn ống thông dạ dày đã bôi trơn qua miệng hay mũi xuống tới dạ dày và rửa với 25– 50
mL nước cất vô trùng để lạnh.
- Hút tá tràng tìm Giardia, ấu trùng giun đũa và ấu trùng giun lươn.
e. Sinh thiết thực quản (Candida, CMV, HSV), dạ dày (H. pylori), tá tràng, ruột non (Giardia,
Cryptosporidium, Microsporidium), trực tràng (E. histolytica, B. coli, HSV).
4. Sinh dục nữ:
Chủ yếu để định bệnh lây qua đường tình dục, như N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis,
…, liên cầu nhóm B, nấm Candida. Nếu nghĩ nhiễm khuẩn không do những tác nhân trên thì
cần phải cấy kỵ khí.
a. Dịch ối:
Hút qua thủ thuật chọc ối / mổ lấy thai / ống thông tử cung.
b. Nang Bartholin: sát trùng da và hút qua ống tuyến.
c. Cổ ngồi:
Khơng dùng chất bơi trơn khi đặt mỏ vịt.
Lau sạch chất tiết và chất nhày.
Xoay que gịn vơ trùng để lấy chất tiết từ cổ trong.
Nếu không thấy chất tiết thì đưa que qua ống cổ trong tử cung.
d. Nội mạc:
Lấy chất hút qua cổ tử cung hay sinh thiết nội mạc bằng đường nội soi. Gửi cấy kỵ khí.
e. Âm đạo:
Dùng mỏ vịt khơng bơi trơn hoặc dùng nước cất vô trùng rửa sạch chất tiết, dùng 2 que vơ
trùng lấy chất tiết ở niêm mạc vịm âm đạo để cấy và soi.

f. Niệu đạo:
Chỉ lấy bệnh phẩm sau khi bệnh nhân đi tiểu trên 1.
5. Sinh dục nam:
a. Mào tinh hoàn: dùng kim và ống tiêm để chọc hút.
b. Tuyến tiền liệt:
Rửa quy đầu với xà bông và nước.
Xoa tuyến qua đường trực tràng.
Lấy chất tiết bằng ống nghiệm hoặc que gịn vơ trùng.
Đồng thời lấy nước tiểu ngay trước và sau khi xoa tuyến.
c. Niệu đạo:
Lấy bệnh phẩm sau khi bệnh nhân đi tiểu 2 giờ hay hơn.
Đưa que lấy bệnh phẫm niệu-sinh dục vào trong niệu đạo 2-4 cm.
Xoay và giữ trong 2 giây rồi rút ra.
d. Tổn thương sinh dục: sang thương dương vật và âm hộ
Rửa sạch bề mặt bằng nước muối sinh lý.
Cạo sang thương cho đến khi xuất hiện thanh dịch.
Dùng gạc lau dịch và chất cặn.
An nền sang thương cho đến khi dịch trong chảy ra. Hút dịch với kim cỡ 25-27.
Dùng que vô trùng chà mạnh nền sang thương (tìm Herpesvirus, Haemophilus ducreyi).
6. Mắt: có thể do bác sĩ chuyên khoa lấy mẫu.
a. Lưu ý: Lấy mẫu tìm virus và Chlamydia trước khi bơi tê tại chỗ. Tìm Chlamydia, dùng que
alginate calcium. Tìm virus, dùng que gịn/đầu Dacron (khơng dùng que có cán bằng gỗ). Cấy
lên mơi trường thích hợp và làm phết tại giừơng rồi gửi ngay đến phòng xét nghiệm.
b. Kết mạc:
Lấy mẫu cả bên lành để phân biệt vi khuẩn gây bệnh với vi khuẩn thường trú.
19


Dùng 2 que đã thấm nước muối sinh lý vô trùng lăn trên 2 kết mạc.
Cấy ngay lập tức lên thạch máu / thạch nâu. Làm phết trên lam.

c. Cạo kết mạc:
Bôi gây tê tại chỗ. Dùng dao bay Kimura vô trùng. Cấy và làm phết.
d. Cạo giác mạc:
Thực hiện như làm phết kết mạc. Bôi tê tại chỗ. Giữ mí mắt mở.
Cạo nhiều chỗ loét. Cấy ngay và làm phết nhuộm.
e. Dịch nội nhãn: dùng kim hút. Cấy ngay và làm phết nhuộm.
7. Đƣờng hơ hấp:
Liên hệ với phịng xét nghiệm trước khi thu thập bệnh phẩm vì cần cách xử lý và mơi trường
đặc biệt nếu để tìm Corynebacterium diphtheriae, Arcanobacterium haemolyticum, Bordetella
pertussis, Neisseria gonorrhoeae, Legionella, Chlamydia, Mycoplasma.
7a. Đƣờng hô hấp dƣới:
7a1. Đàm khạc: dặn bệnh nhân súc miệng với nước. Hướng dẫn bệnh nhân nghiệm pháp hít
thở 3 thì: hít sâu-thở chậm; hít sâu-thở mạnh; hít sâu-ho. Nếu cần, giúp long đàm bằng cách
vỗ lưng bệnh nhân. Trường hợp bệnh nhi/người không tự ho được, phải hút đàm.
Bệnh phẩm tốt: mỗi quang trường < 10 tế bào vảy,  25 bạch cầu đa nhân trung tính, đọc
ở vật kính x10 (tương đương độ phóng đại x100).
7a2. Đàm gây ho: chải sạch niêm mạc miệng, lưỡi, lợi; súc kỹ với nước.
Hít khoảng 25 mL nước muối ưu trương (3-10%) qua khí dung kế.
7a3. Hút từ thủ thuật mở thơng khí quản / ống nội khí quản.
7a4. Bệnh phẩm từ nội soi phế quản: do bác sĩ chuyên khoa lấy.
Rửa, chải phế quản. Súc rửa phế quản-phế nang. Sinh thiết qua phế quản.
Súc rửa phế quản-phế nang:
+ Bơm vào từng lượt 5-20 mL nứơc muối khơng chứa chất kìm khuẩn.
+ Hút nước muối vào vật chứa trước khi bơm lượt khác. Giữ các lượt nước muối ở cùng vị
trí chung trong một lọ.
Chải phế quản: Bác sĩ điều trị luồn ống thơng 2 nịng (nịng ngồi đậy bằng nút Carbowax)
vào ống nội soi phế quản. Bàn chải được đưa qua khỏi đầu nòng trong để gom chất tiết (0,0010,01 mL) từ tiểu phế quản xa. Cho bàn chải vào vật chứa có 1 mL nước muối vơ trùng / dung
dịch lactate Ringer.
Sinh thiết qua phế quản: lấy bệnh phẩm bằng kìm qua kênh sinh thiết của ống nội soi phế
quản. Cho bệnh phẩm vào lọ có một ít nước muối sinh lý.

7a5. Chất hút ở phổi: dùng kim và ống tiêm dưới hướng dẫn của kỹ thuật chụp cắt lớp.
7a6. Sinh thiết phổi: lấy lúc mổ khoảng 1-3 cm2 mơ, đựng trong lọ vơ trùng khơng có formalin.
Tìm nấm ở phổi tốt nhất bằng mô sinh thiết / chất hút. Hoặc thu thập 3 mẫu đàm 3-5 mL vào
sáng sớm.
7b. Đƣờng hô hấp trên:
- Miệng: lấy hết chất tiết và cặn bã trên bề mặt sang thương bỏ đi; dùng que gịn thứ nhì
chà mạnh trên sang thương, tránh chỗ mơ lành.
- Phết mũi: que gịn thấm nước muối sinh lý lấy chất nhày trong lỗ mũi (đưa vào 2 cm).
Tìm người lành mang MRSA và streptococci.
- Súc mũi: cấy virus. Ngửa cổ bệnh nhân. Nhỏ nước muối sinh lý vào mỗi lỗ mũi. Hút lấy
nước rửa.
- Ngoáy mũi-hầu: tìm N. meningitidis và B. pertussis. Đưa que alginate calcium vào trong
vùng hầu sau qua đường mũi. Xoay que 5 giây. Cấy ngay lập tức/ cho vào môi trường
chuyên chở.
- Hút mũi-hầu: tìm Streptococcus nhóm A, N. meningitidis, C. diphtheriae và B. pertussis.
- Chất hút xoang: rút bằng ống tiêm chất hút từ xoang hàm, trán, nơi khác.
- Dịch chọc màng nhĩ: để chẩn đoán nhiễm khuẩn tai giữa chỉ khi nào điều trị thất bại.
+ Lau sạch tai ngoài với chất tẩy nhẹ.
20


+ Dùng ống tiêm hút chất thử qua trống tai.
+ Nếu trống vỡ, lấy chất tiết bằng que vô trùng qua mỏ vịt.
- Họng: tìm Streptococcus nhóm A, N. gonorrhoeae, A. haemolyticum. Đè lưỡi. Lấy mẫu
bằng que gòn ở vùng hầu sau, hạch hạnh nhân và vùng viêm loét. Tránh má, lưỡi, tiểu thiệt
và môi.
8.

Các dịch vô trùng khác: như dịch ổ bụng, nước báng, mật, khớp, màng ngoài tim, màng
bụng, màng phổi và bao khớp.

Tìm vi khuẩn: 1-5 mL. Tìm vi khuẩn lao, vi nấm: > 10 mL.

9.

Da và mô mềm:
- Phỏng: sinh thiết mô sâu và lấy nhiều chỗ.
- Vết thương nông: dùng kim lấy chất hút ở chỗ sâu nhất của sang thương tốt hơn que gòn.
- Nấm da: rửa sạch vùng nhiễm bằng nước vô trùng. Cạo bề mặt da ở bờ sang thương. Không
rút máu.
- Loét / nốt nổi cục:
+ Sát trùng da, bỏ cặn bã.  Nạo đáy chỗ loét hay nốt nổi cục.

10. Vết thƣơng sâu:
- Vết cắn / chấn thương: hút mủ vết thương.
- Xương: lấy bệnh phẩm khi mổ.
- Vết thương sâu / Ap xe: dùng kim hút phần sâu nhất của sang thương, tránh tạp nhiễm bề mặt
vết thương.
11. Nƣớc tiểu:
+ Rửa lỗ tiểu với xà phòng và nước. Lấy nước tiểu giữa dòng lần tiểu đầu tiên sáng sớm.
+ Rút nước tiểu trên xương mu.
+ Nội soi bàng quang:
 Bệnh nhân uống nhiều nước đến khi bàng quang đầy.
 Rửa sạch lỗ tiểu với xà phòng và nước.
 Luồn ống nội soi bàng quang.
 Lấy 5-10 mL nước tiểu. Ghi nhãn “nước tiểu lấy qua ống thông”.
 Dùng nước muối sinh lý kích thích bàng quang. Hút nước rửa và ghi nhãn “nước rửa
bàng quang”.
 Đưa ống thông đến giữa 2 niệu đạo hay đến 2 bể thận.
 Mở khóa ống nội soi. Bỏ đi 5-10 mL đầu tiên. Lấy 4 mẫu kế tiếp ở 2 bên (5-10 mL mỗi
mẫu). Ghi nhãn: nước tiểu thận trái / thận phải 1, 2, 3, 4.

12. Những chất thử khác:
12a. Ống thông tĩnh mạch: lấy 5 cm đầu xa của ống thông.
12b. Nha khoa: viêm họng Vincent, viêm quanh chóp, viêm nha chu, viêm lợi.
+ Lau sạch bờ lợi và bề mặt răng trên lợi.
+ Lấy chất thử ở sang thương dưới lợi bằng dụng cụ nạo cao răng.

CHUYỂN BỆNH PHẨM
Tốt nhất là gởi bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm ngay lập tức.
Hoặc càng sớm càng tốt.
Nếu không gửi ngay được, giữ bệnh phẩm ở 2-8oC. Ngoại trừ:
 chai cấy máu, để ở 35-37oC.
 bệnh phẩm tìm Neisseria, tìm vi khuẩn kỵ khí: để ở nhiệt độ phịng.
 dịch não tủy tìm vi khuẩn: để ở nhiệt độ phòng.
 phân: cấy vi khuẩn, cho vào mơi trưịng chun chở.
tìm ký sinh trùng, cho vào chất bảo quản.
21


Môi trƣờng chuyên chở
Không cần chất bảo quản

Giữ ở 4oC

Giữ ở nhiệt độ phịng

Mơ tử thiết, Rửa phế quản, Dịch não tủy tìm vi khuẩn, Dịch
Thơng tĩnh mạch, Dịch não tủy khớp
tìm virus, Sinh thiết phổi, Dịch
màng tim, Đàm, Nước tiểu
thơng / giữa dịng

Cấy trực tiếp lên mơi
trường

Cạo giác mạc, Cấy máu,
Bordetella spp., Bệnh phẩm tìm
lậu cầu, Dịch kính

Mơi trường chuyên chở
Sinh thiết vết phỏng, Bệnh
Stuart’s, Amies, Cary-Blair phẩm tai ngồi, Bệnh phẩm tìm
Campylobacter spp., Shigella
spp., Vibrio spp., Yersinia spp.

Tủy xương, Que cổ tử cung,
Que kết mạc, Que tai trong,
Bệnh phẩm cơ quan sinh dục,
Que mũi-hầu, Bệnh phẩm hô
hấp trên, Bệnh phẩm tìm
Bordetella
spp.,
Corynebacterium
spp.,
Neisseria spp., Salmonella spp.

Chun chở kỵ khí

Dịch bụng, Dịch ối, túi cùng,
Mật, Tổn thương sâu, Mô phẫu
thuật, Chất hút ở phổi, xoang,

nội khí quản, Nước tiểu rút trên
xương mu, Bệnh phẩm tìm
Actinomyces spp.

22


BÀI 5: CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG
Mục tiêu:
1/ Phân biệt được các hóa chất dùng thanh khử trùng theo cơng dụng.
2/ Biết sử dụng hóa chất và cơ chế tác động của chúng để thanh trùng phù hợp.
3/ Biết cách sử dụng lị hấp ướt, tủ an tồn sinh học và tia cực tím.
I. ĐỊNH NGHĨA THUẬT NGỮ
Sự thanh trùng / phƣơng pháp khử trùng / kỹ thuật vô khuẩn: chỉ chung việc áp dụng
các biện pháp tiệt trùng và tẩy uế để chống lại tình trạng nhiễm trùng hay nguy cơ lây nhiễm.
Sự tiệt trùng (sterilization): tiến trình tiêu diệt hay loại bỏ mọi dạng sống của vi sinh vật
trong một chất liệu hay trên một đồ vật.
Sự tẩy uế (disinfection): tiến trình làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh đến mức chúng
khơng cịn nguy hại.
Chất sát trùng (antiseptic): tác nhân hóa học dùng ngồi da để diệt vi sinh vật hay ức chế
sự tăng trưởng của chúng mà không gây hại mô sống.
Chất tẩy uế (disinfectant): tác nhân hóa học dùng diệt trùng trên đồ vật. Hầu hết chất tẩy uế
không diệt được nha bào.
Chất làm sạch (sanitizer): tác nhân hóa học đặc biệt dùng rửa sạch dụng cụ nhà bếp để làm
giảm số lượng vi khuẩn sao cho đáp ứng các tiêu chuẩn y tế cơng cộng. Q trình làm sạch có thể
đơn giản đề cập đến việc rửa thật kỹ chỉ với xà phòng hay chất tẩy.
Chất kìm khuẩn (bacteriostatic agent): tác nhân ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn.
Chất diệt mầm bệnh (germicide): tác nhân giết vi sinh vật nhanh chóng; có chất giết được
một số vi sinh vật này nhưng chỉ ức chế tăng trưởng số vi sinh vật khác.
Chất diệt khuẩn (bactericide): tác nhân giết các vi khuẩn. Hầu hết không giết được

nha bào.
Chất diệt virus (viricide): tác nhân bất hoạt virus.
Chất diệt vi nấm (fungicide): tác nhân giết vi nấm.
Chất diệt nha bào (sporocide): tác nhân giết được nha bào của vi khuẩn và bào tử
vi nấm.
II. TÁC ĐỘNG BẤT LỢI CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG LÊN VI SINH VẬT
Các yếu tố môi trường tác động sự tăng trưởng của vi sinh vật gồm 3 loại: vật lý, hóa học,
sinh học.
1. Qui luật tác động:
Về mặt tử suất, vi sinh vật bị xử lý bởi những tác nhân kháng trùng đều tuân theo cùng những
qui luật làm giảm thiểu số lượng của chúng bởi các yếu tố tự nhiên. Quan sát ảnh hưởng của nhiệt,
ở một nhiệt độ nào đó, nếu 20% dân số vi khuẩn chết trong phút đầu tiên thì sẽ có 20% dân số
sống sót chết vào phút thứ nhì. Chúng ta rút ra qui luật thứ nhất “Một tỉ lệ nhất định vi sinh vật
chết trong một khoảng thời gian nhất định”.
Tổng số vi sinh vật hiện diện lúc bắt đầu việc tẩy uế có ảnh hưởng đến thời gian cần thiết để
loại bỏ chúng. Qui luật thứ nhì “Số lƣợng vi sinh vật càng ít, thời gian cần thiết để đạt tính vơ
trùng càng ngắn”. Vận dụng qui luật này, chúng ta thường phải rửa sạch sẽ đồ vật trước khi đưa
tiệt trùng.
Những tác nhân kháng trùng ảnh hưởng một cách khác biệt trên các loài vi sinh vật khác
nhau. Hơn nữa, ảnh hưởng này còn khác biệt ở những giai đoạn tăng trưởng khác nhau của cùng
một loài vi sinh vật. Giai đoạn nhạy cảm nhất của hầu hết vi sinh vật chính là thời kỳ tăng trưởng
lũy thừa. Từ thực tế này, chúng ta xác định qui luật thứ ba “Vi sinh vật nhạy cảm khác nhau đối
với các yếu tố kiểm soát tăng trƣởng của chúng”.
23


2. Cơ chế tác động:
Tác động bất lợi của các yếu tố môi trường thường gây tổn hại các cấu trúc quan trọng cho
sự sống của tế bào, dẫn đến phá hủy chức năng hoạt động làm cho tế bào chết. Chỉ những tế bào
vi sinh vật có thể thay đổi sinh lý hay di truyền để thích nghi thì mới sống sót được.

Các tác hại được thể hiện như sau:
1/ Phá hủy thành tế bào.
2/ Thay đổi tính thấm của màng tế bào.
3/ Thay đổi tính keo của nguyên sinh chất (biến tính protein).
4/ Kìm hãm hoạt tính enzyme.
5/ Phá hủy các quá trình sinh tổng hợp.
III. CÁC PHƢƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG
1. Các phƣơng pháp hóa học:
Hóa chất tiệt trùng thông thường nhất là ethylene oxide, được dùng dưới dạng khí để tiệt
trùng đồ vật dễ bị hủy bởi nhiệt. Formol và hơi hydrogen peroxide vẫn được dùng tiệt trùng màng
lọc khơng khí của tủ an tồn sinh học. Gluteraldehyde, diệt nha bào trong vòng 3-10 giờ, dùng cho
những y cụ như dụng cụ nội soi vì khơng ăn mịn thấu kính, kim loại, hay cao su. Peracetic acid,
hiệu quả đối với chất hữu cơ, cũng được dùng tiệt trùng bề mặt dụng cụ phẫu thuật. Việc sử dụng
gluteraldehyde hay peracetic acid được gọi là quá trình tiệt trùng lạnh.
Chúng giết vi sinh vật bằng cách làm biến tính protein và acid nucleic. Chúng diệt được tất
cả vi sinh vật và nha bào. Nhóm hóa chất này dùng để tiệt trùng dụng cụ không chịu nhiệt. Sau khi
tiệt trùng, cần loại bỏ cho hết hóa chất trước khi sử dụng.
2. Các phƣơng pháp vật lý:
Gồm: thiêu đốt, nhiệt ẩm, nhiệt khơ, lọc, bức
xạ ion hóa (gamma).
Sức nóng khơng những là một tác nhân diệt
trùng phổ biến và hiệu quả nhất mà cịn r tiền và
dễ kiểm sốt nhất. Sức nóng diệt trùng bằng cách
làm biến tính các enzyme của vi sinh vật. Khi sử
dụng phương tiện này chúng ta phải lưu ý đến nhiệt
độ thấp nhất và thời gian tối thiểu giết tất cả vi sinh
vật. Trong kỹ nghệ đóng hộp người ta cịn tính cả
giá trị D tức là số phút mà 90% dân số vi khuẩn bị
giết chết ở nhiệt độ cho sẵn.
-Thiêu đốt là biện pháp thường dùng nhất để

xử lý chất thải nhiễm trùng. Vật liệu nguy hiểm bị
thiêu thành tro ở nhiệt độ
870-980oC. Tuy nhiên hạn chế của biện pháp này
là sự hiện diện của kim loại nặng trong tro và khí
độc thải ra.

Hình 1: Lò hấp ướt

-Nhiệt ẩm (hơi nước dưới áp suất) dùng tiệt trùng rác nguy hiểm và đồ vật chịu nhiệt. Dụng
cụ của phương pháp này là lò hấp ướt (Hình 1).
Hơi nước bão hịa dưới áp suất 1 atmosphere, tức 15 psi (pounds per square inch) khiến cho
các enzymee và protein cấu trúc bị biến tính khơng hồi phục. Môi trường cấy, chất lỏng, dụng cụ
thường được hấp trong 15-20 phút ở 1210C (2500F). Chất thải nhiễm trùng được hấp ở 1320C
(2700F) trong 30 - 60 phút. Nhiệt ẩm là phương pháp vật lý tiệt trùng đơn giản nhất và nhanh nhất.
-Trong khi đó, sức nóng khơ giết vi sinh vật do tác dụng oxid hóa. Sức nóng khơ cần thời
gian tiếp xúc lâu hơn (1 giờ rưỡi-2 giờ) và nhiệt độ cao hơn (160-1800C). Lò sấy dùng cho mục
đích này để tiệt trùng thủy tinh, chất dầu, bột.
24