Phân tích đặc điểm sinh học phân tử gen NP, gen m và gen NS của một số chủng virus cúm a h5n1 mới xuất hiện năm 2011 tại việt nam

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử gen NP,
gen M và gen NS của một số chủng virus
cúm A/H5N1 mới xuất hiện năm 2011 tại
Việt Nam


Phạm Thị Duyên

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: PGS.TS. Lê Thanh Hoà
Năm bảo vệ: 2012


Abstract: Thu nhận các phân đoạn gen NP, M, NS và giải trình trình tự 3 phân
đoạn gen này của một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ bệnh phẩm gây
bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam năm 2011. Phân tích, so sánh sự biến đổi trình tự
nucleotid của 3 phân đoạn gen NP, M, NS và trình tự amino acid suy diễn của các
chủng được phân lập với một số chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới có trong Ngân hàng gen. Phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng virus
nghiên cứu nói trên với các chủng trên thế giới dựa trên cấu trúc 3 phân đoạn gen
NP, M, NS.

Keywords: Sinh vật học; Vi sinh vật học; Virus cúm


Content
MỞ ĐẦU
Virus cúm A/H5N1 thuộc nhóm virus cúm A, họ Orthomyxoviridae, bộ

Mononegavirales, có đặc tính thích ứng đa vật chủ, lưu hành chủ yếu ở quần thể chim
hoang dã, nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp phổ biến và gây ra dịch cúm A/H5N1 ở gia
cầm từ năm 2003 đến nay.
Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có cấu trúc đặc trưng của hệ gen virus cúm A, gồm 8
phân đoạn gen riêng biệt mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus.


Bên cạnh các đột biến gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) tạo ra các chủng
virus mới có thể có tính kháng nguyên khác so với chủng ban đầu, sự xuất hiện đột biến và
trao đổi chéo các phân đoạn gen NP, M và NS giữa các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu
hành, có sự liên quan đến độc lực và khả năng gây bệnh của chủng virus mới.
Công tác nghiên cứu giám sát chặt chẽ sự tiến hoá hệ gen cũng như các gen cấu trúc
của virus cúm A/H5N1 là điều hết sức cần thiết hiện nay. Qua đó, cho phép dự báo dịch tễ
học virus A/H5N1 ở mức độ sinh học phân tử giúp định hướng sử dụng vacxin phù hợp,
tìm hiểu các vùng gen ổn định và đa biến giúp cho chiến lược phát triển vacxin thế hệ mới
(đặc biệt là vaccine tái tổ hợp sử dụng kĩ thuật di truyền ngược (reverse genetics-based
vaccine)) đặc hiệu với chủng A/H5N1 đương nhiễm.
Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“Phân tích đặc điểm sinh học phân tử gen NP, gen M và gen NS của một số
chủng virus cúm A/H5N1 mới xuất hiện năm 2011 tại Việt Nam”.
Với các mục tiêu sau:
1- Thu nhận các phân đoạn gen NP, M, NS và giải trình trình tự 3 phân đoạn gen này
của một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ bệnh phẩm gây bệnh cúm gia cầm ở Việt
Nam năm 2011.
2- Phân tích, so sánh sự biến đổi trình tự nucleotid của 3 phân đoạn gen NP, M, NS
và trình tự amino acid suy diễn
3- Phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng virus nghiên cứu nói trên với các
chủng trên thế giới dựa trên cấu trúc 3 phân đoạn gen NP, M, NS.
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1
1.1.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới
Năm 1996, virus cúm A/H5N1 gây dịch cúm gia cầm ở Quảng Đông (Trung Quốc).
Một năm sau (1997) dịch cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện ở Hồng Kông, đã có 6 người tử
vong trong tổng số 18 người xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 trong vụ dịch này, và là
lần đầu tiên virus cúm chim lây truyền trực tiếp sang người [75].
Đặc biệt, virus cúm A/H5N1 có khả năng gây bệnh được trên người, với hàng trăm
người nhiễm và tử vong trong các vụ dịch cúm gia cầm xảy ra ở các quốc gia trên thế giới
[77], [80]. Virus cúm A/H5N1 được coi là virus có độc lực cao nhất cho đến nay [2], [70].
Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng sinh học cho thấy chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu


hành, có khả năng dễ dàng thích ứng lây nhiễm từ gia cầm sang người và giữa người với
người. Các trường hợp người nhiễm virus cúm A/H5N1 được xác định là do tiếp xúc trực
tiếp với gia cầm bệnh, hoặc do các yếu tố sinh học cá thể hay gia hệ có liên quan đến khả
năng tăng tính cảm thụ với virus [7], [41], [80].
1.1.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát lần đầu tiên vào tháng 12/2003, chỉ trong hai
tháng dịch đã nhanh chóng lây lan ở 52/64 tỉnh/thành trong cả nước, đã có 3 người nhiễm
và cả 3 đều bị tử vong (100%) trong vụ dịch này [53].
Cho đến nay, dịch bệnh liên tục tái bùng phát nhiều đợt hàng năm ở nhiều địa
phương trong cả nước, và gần đây trong các tháng đầu năm 2012 dịch tái bùng phát trở lại
ở các tỉnh: Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Sóc Trăng với 2 trường hợp tử
vong trên người trong 2 tháng đầu năm 2012 [79].
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1
1.2.1. Phân loại và danh pháp virus cúm A/H5N1
- Vị trí phân loại của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 thuộc nhóm virus cúm A, họ Orthomyxoviridae, bộ
Mononegavirales [6], virus có đặc tính thích ứng đa vật chủ, lưu hành chủ yếu ở quần thể
chim hoang dã, gây bệnh đường hô hấp phổ biến và gây ra dịch cúm ở gia cầm từ năm

2003 đến nay [21].
- Kí hiệu và danh pháp virus cúm A/H5N1
Các phân nhóm virus trong nhóm virus cu
́
m A đư ợc kí hiệu theo kiểu hình phân type
(serotype) kháng nguyên HA và NA , viết tắt là A/HxNy. Phân type virus cu
́
m A /H5N1
thuộc nho
́
m virus cu
́
m A , kiểu hình phân nho
́
m kha
́
ng nguyên HA la
̀
H 5 và NA là N 1, viết
tắt là A/H5N1 [6], [49].
1.2.2. Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào vật chủ
Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của
virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm
[49], [54].
1.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN CỦA VIRUS CÚM
A/H5N1
1.3.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus cúm A/H5N1


(A) (B)

- Hình thái: Virus cúm A/H5N1 cũng như nhóm virus cúm A tồn tại dưới dạng các
hạt virus (virions). Hạt virus (virion) có cấu trúc hình khối đa diện, đường kính khoảng 80
– 120 nm, đôi khi là dạng hình khối kéo dài thành hình sợi đường kính 20 nm và dài từ 200
- 300 nm (Hình 1.4). Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu dalton [49].
- Cấu tạo hạt virus cúm A/H5N1:
Cấu tạo hạt virus cúm A/H5N1: Hạt virus cúm A/H5N1 có cấu tạo đơn giản, bao
gồm: vỏ capsid và lõi là RNA sợi đơn âm (Hình 1.4).







Hình 1.4. Ảnh chụp và mô hình tiểu phần virus cúm A [2].
(A: Ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử truyền qua. B: Mô hình
cấu tạo hạt virus cúm A, Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân
tử kháng nguyên NA, Capsid: vỏ virus, Lipid envelope: lớp màng bao lipid, RNA: hệ gen
virus).

1.3.2. Đặc điểm sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/H5N1

Hình 1.5. Mô hình cấu
trúc hệ gen virus cúm A/H5N1 [77]


(A: Các phân đoạn gen của virus cúm A. B: Cấu trúc một phân đoạn gen (RNP) của virus
cúm A. PB1, PB2, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzym polymerase của virus).

1.3.3. Hiện tƣợng cắt - ghép mRNA ở virus cúm A/H5N1
- Đặc điểm cắt – ghép mRNA xảy ra ở phân đoạn 7 (gen M)
Phân tử mRNA phân đoạn 7 của virus cúm A được cắt - ghép có biến đổi để tạo ra
một số mRNA khác nhau: mRNA M2, mRNA M3 và cả mRNA4 trong một vài trường hợp
(Hình 1.6) [60], [64].











Hình 1.6. Mô hình minh họa hiện tượng cắt – ghép mRNA phân đoạn gen 7 (gen M) ở
virus cúm A/H5N1 [34].

Như vậy, gen M của hệ gen virus cúm A/H5N1 mã hóa cho ít nhất 2 protein là:
protein nền M1 và protein nội màng - kênh ion M2, bởi các khung đọc mở khác nhau.
Protein M1 gồm 252 aa được mã hóa từ một mRNA của phân đoạn M không cắt - ghép.
Protein M2 gồm 97 aa được mã hóa từ mRNA M2 đã cắt - ghép từ mRNA phân đoạn MA
nguyên thuỷ.
- Đặc điểm cắt – ghép mRNA xảy ra ở phân đoạn 8 (gen NS)
Phân đoạn gen 8 (gen NS) là phân đoạn có kích thước nhỏ nhất trong genome của
virus cúm A, mã hoá 2 loại protein là protein NS1 và protein NS2 từ các mRNA riêng biệt,
được tạo thành do quá trình cắt - ghép từ cùng một mRNA (Hình 1.8).












Hình 1.8. Mô hình minh họa hiện tượng cắt – ghép mRNA phân đoạn gen 8 (gen NS) ở
virus cúm A [34].

1.4. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CÁC PROTEIN NP, M VÀ NS CỦA VIRUS
CÚM A/H5N1
1.4.1. Protein NP (Nucleoprotein)
Protein NP (nucleoprotein) là một loại protein được photphoryl hóa, biểu hiện đặc
tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus liên kết với mỗi phân đoạn
RNA dạng xoắn anpha, tạo thành dạng cấu trúc ribonucleoprotein [51].

Protein NP có phân tử lượng tính toán khoảng 56x10
3
Da (trên thực tế là 50-
56x10
3
Da) với khoảng 1000 phân tử /virion [45], [49].
1.4.2. Protein đệm M (matrix protein)
Protein đệm M là một trong các hợp phần chính cấu tạo của hạt virus cúm A/H5N1,
gồm 2 loại: protein nền M1 và protein nội màng M2, được tạo ra bởi 2 khung đọc mở khác
nhau của cùng 1 phân đoạn RNA.
- Protein nền M1
Là thành phần chính của virus, phân tử lượng tính toán của M1 là 28x10
3
Da (quan
sát thực tế: 25x10
3
) có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào
quá trình “nảy chồi” của virus. Với 3000 phân tử/virion, các protein nền này sẽ lót phần
bên trong màng bao lipid của virion [11], [45], [49].
- Protein nội màng – kênh ion M2
Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là
11x10
3
Da (trên thực tế là 15x10
3
Da).
1.4.3. Protein phi cấu trúc NS (non structural protein)
Protein NS1 và NS2 là hai phi cấu trúc (non structural protein) của virus cúm A được
tạo ra bởi hiện tượng cắt – ghép (splicing) từ mRNA của phân đoạn gen 8 (gen NS) [54],
[75] có vai trò bảo vệ hệ gen của virus, nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng [49].

Cụ thể:
- Protein NS1:
Protein NS1 được tổng hợp từ mRNA phân đoạn 8 không cắt ghép [61] trọng lượng
phân tử theo tính toán là 27x10
3
Da (trên thực tế là 25x10
3
Da) [75]. NS1 có cấu trúc bậc 2
đối xứng hai bên gồm 6 nếp gấp xoắn anpha. Cấu trúc không gian 3 chiều mới của nó


không giống như bất kì cấu trúc nào khác hiện tại trong cơ sở dữ liệu đặc tính protein. Mỗi
chuỗi đối xứng chứa 73 aa và có khối lượng chuỗi polypeptide là 18 kDa (Hình 1.11-A)
[2], [59].

1.5. Tầm quan trọng của nghiên cứu đặc tính và biến đổi di truyền các gen NP, M và
NS của virus cúm A/H5N1
Bên cạnh các đột biến xảy ra trên các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) của
virus cúm A/H5N1, tạo ra hiện tượng ”lệch kháng nguyên” hình thành nên các clade virus
mới. Các đột biến xảy ra trên các gen NP, M và NS cùng với hiện tượng cắt – ghép gen,
xảy ra ở các gen này trong hệ gen virus cúm A/H5N1, đều có liên quan đến độc tính và khả
năng gây bệnh của virus.
Điều đặc biệt nguy hiểm là thông qua những đột biến này cùng với sự trao đổi chéo
các phân đoạn gen trong hệ gen, giữa các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành sẽ tạo
ra các chủng virus mới. Các chủng virus này sẽ có thể thu nhận và tăng cường khả năng
gắn vào tế bào của người bị virus xâm nhiễm. Bên cạnh đó, rất có thể những biến đổi này
cũng là bước chuẩn bị cho việc phân hóa dòng virus hiện tại thành những dòng virus khác.
Bởi vì đã từng có tiền lệ cho thấy, virus A/H5N1 phân hóa thành những dòng virus khác
nhau như ở Trung Quốc từ 1997 tới năm 2001 có tới 6 dòng virus A/H5N1 lưu hành trên
thủy cầm (đó là các dòng A, D, C, D, E và Xo). Thế nhưng đến năm 2002, xuất hiện 8

dòng virus mới là V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ được xác định. Cho đến nay phân type
H5N1 type Z tồn tại và tiếp tục lưu hành cũng như gây dịch trên người và gia cầm và gần
đây là type G, còn các type khác thì không thấy xuất hiện.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu phân tích và tìm hiểu các đặc tính di truyền ở các phân
đoạn gen M, NP và NS của virus cúm A/H5N1, góp phần đánh giá khả năng biến đổi và
thích nghi lây nhiễm từ gia cầm sang người, cũng như những biến đổi di truyền liên quan
đến gia tăng độc lực và khả năng kháng thuốc của các chủng virus mới. Bên cạnh đó, kết
quả nghiên cứu cũng góp phần bổ sung dữ liệu di truyền giám sát dịch tễ học phân tử virus
cúm A/H5N1, làm cơ sở để nghiên cứu sản xuất vaccine thế hệ mới phòng chống dịch cúm
A/H5N1 đang có diễn biến ngày càng trở nên phức tạp hiện nay.



CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm
Thu thập các mẫu bệnh phẩm là dịch nhày biểu mô (swab) niêm mạc hầu-họng-khí
phế quản của vịt nhiễm bệnh tại các địa phương có dịch năm 2011. Mẫu được vô hoạt bằng
nhiệt độ cao (đun sôi trong vài phút) và bảo quản -70
o
C theo tiêu chuẩn an toàn sinh học.
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị
2.1.3. Hóa chất
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp thu nhận mẫu và xử lý bệnh phẩm virus cúm A/H5N1.
- Phương pháp tách RNA tổng số, phương pháp thực hiện RT-PCR
- Phương pháp dòng hoá sản phẩm trong vector tách dòng.
- Phương pháp giải trình trình tự và truy cập Ngân hàng gen thu nhận chuỗi gen,
phương pháp phân tích và xử lý chuỗi gen.

- Phương pháp so sánh đối chiếu kết quả bằng chương trinh tin-sinh học.
- Phương pháp xác định hệ số tương đồng và nguồn gốc phả hệ












CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN



2 1 M
3.1. THU NHẬN, GIẢI MÃ GEN NP, GEN M VÀ GEN NS CỦA VIRUS CÚM
A/H5N1 CHỦNG Dk-VN-QT800 VÀ Dk-VN- QT1603
3.1.1. Tách RNA tổng số và thực hiện phản ứng RT-PCR

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra RNA tổng số của Dk-VN-QT800 và Dk-VNQT-1603
(M: thang DNA chuẩn; giếng 1: RNA tổng số của Dk-VN-QT800;
giếng 2: RNA tổng số của Dk-VN-QT1603).
Kết quả hình 3.1 cho thấy, ở cả hai giếng tra mẫu RNA tổng số của Dk-VN-QT800
(giếng số 1) và Dk-VN-QT1603 (giếng số 2) đều cho kết quả là vệt sáng trắng, chứng tỏ
RNA tổng số được tách chiết có chất lượng tốt.
Sau khi thu được RNA tổng số sẽ được dùng làm khuôn thực hiện phản ứng RT-
PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen NP, gen M và gen NS của virus cúm A/H5N1. Sử dụng
bộ kit RT-PCR one- step của hãng Qiagen để thu nhận gen NP, gen M và gen NS. Tất cả
các thành phần (mồi, khuôn, thành phần phản ứng) được cho vào cùng một lúc và thực
hiện liên tục cả hai giai đoạn: giai đoạn chuyển đổi (RT) RNA thành cDNA và giai đoạn
nhân gen (PCR).
3.1.2. Thực hiện RT-PCR, thu nhận và giải trình tự gen NP
Kết quả sản phẩm RT-PCR của mỗi chủng trong nghiên cứu là một băng đơn nhất,
chứng tỏ các trình tự mồi thiết kế, tiến trình thực hiện phản ứng RT-PCR, chu trình nhiệt
phù hợp. Sản phẩm RT-PCR chứa toàn bộ gen NP của 2 chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-
QT1603 được thu nhận, tinh sạch sản phẩm RT-PCR và tiến hành dòng hóa vào vector
tách dòng để thu nhận DNA tái tổ hợp, giải trình tự và lưu giữ gen trong plasmid. Hình
3.2B thể hiện kết quả tách DNA plasmid tái tổ hợp của gen NP tương ứng sau khi cắt bằng
enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra đoạn DNA chèn vào. Có hai băng DNA hiển thị trên
thạch agarose, một băng có kích thước khoảng 3,9 kb tương ứng với kích thước của vector
pCR
®
2.1-TOPO và một băng có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với đoạn DNA từ sản


2 kb
1,56 kb
2 kb
1,56 kb

3,9 kb
M 1 2
A
M 1 2 3 4
B
2 kb
1,027 kb
1,027 kb
3,9 kb
2 kb
M 1 2
M 1 2
A
B
M 1 2 3 4
phẩm RT-PCR cần tách dòng. DNA plasmid tái tổ hợp được giải trình tự và thu nhận chuỗi
gen NP của 2 chủng nghiên cứu. Toàn bộ gen NP gồm 1497 nucleotide mã hóa cho 498
amino acid (hình 3.3, phụ lục 1.A)






Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp gen NP
(A): Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trên thạch agarose 1%, M: thang DNA
chuẩn, Giếng 1 và giếng 2: sản phẩm RT-PCR chủng Dk-VN-QT800 và chủng Dk-VN-
QT1603; (B): DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI, M: thang DNA chuẩn,
giếng 1, giếng 2: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 chủng Dk-VN-QT800; giếng
3, giếng 4: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 của chủng Dk-VN-QT1603 .

3.1.3. Thực hiện RT-PCR, thu nhận và giải trình tự gen M








2 kb
0,9kb
2 kb
M 1 2 3 4
0,9kb
3,9kb
B
A
M 1 2


Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp gen M
(A): Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trên thạch agarose 1%, M: thang DNA chuẩn,
giếng 1 và giếng 2: sản phẩm RT-PCR chủng Dk-VN-QT8000 và chủng Dk-VN-QT1603

có kích thước khoảng 1 kb; (B): DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI, M: chỉ thị
phân tử DNA, giếng 1, giếng 2: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 của chủng Dk-
VN-QT8000, giếng 3, giếng 4: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 của chủng Dk-
VN-QT1603.

Hình 3.4B là kết quả điện di DNA plasmid tái tổ hợp của clone tương ứng sau khi cắt
bằng enzym giới hạn EcoRI để kiểm tra đoạn DNA chèn vào. Kết quả ở hình 3.3B cho thấy,
có hai băng DNA hiển thị trên thạch agarose, một băng có kích thước khoảng 3,9 kb tương
ứng với kích thước của vector pCR
®
2.1-TOPO và một băng có kích thước khoảng 1 kb
tương ứng với đoạn DNA từ sản phẩm RT-PCR cần tách dòng.
Tiến hành giải trình tự DNA plasmid của clone tương ứng với mỗi chủng. Sau khi
giải trình tự đã thu được chuỗi DNA của gen M gồm 2 gen M1 (759 bp) và M2 (294 bp)
3.1.4. Thực hiện RT-PCR, thu nhận và giải trình tự gen NS
Phân đoạn 8 mã hóa gen NS của virus cúm A/H5N1 chủng Dk-VN-QT800 và Dk-
VN-QT1603 được nhân lên bằng phản ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số sử dụng
cặp mồi NSF1-NSR1 (Bảng 2.1) với chu trình nhiệt tương ứng trình bày ở hình 2.2.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR được thể hiện ở hình 3.6A, đó là một
băng DNA đặc hiệu có độ dài khoảng 0,9 kb tương ứng với kích thước của phân đoạn gen
NS cần nhân lên.

* 20 * 40 * 60 *
ATGGATTCCAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGACTGCTTCCTTTGGCATGTCCGCAAACGATTTGCAGACCAA
M D S N T V S S F Q V D C F L W H V R K R F A D Q>
>
M D S N T V S S F Q
>

80 * 100 * 120 * 140 *
GAACTGGGTGATGCCCCATTCCTTGACCGGCTTCGCCGAGATCAGAAGTCCCTAAGAGGAAGAGGCAACACTCTT
E L G D A P F L D R L R R D Q K S L R G R G N T L>
>


160 * 180 * 200 * 220
GGTCTGGACATCGAAACAGCTACTCGTGCGGGGAAACAGATAGTGGAGCGGATTCTGGATGAGGAATCTGATGAG
G L D I E T A T R A G K Q I V E R I L D E E S D E>
>


* 240 * 260 * 280 * 300
GCACTTAAAATGCCGACTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGATTGGTTCATGCTC
A L K M P T S R Y L T D M T L E E M S R D W F M L>
>

* 320 * 340 * 360 *
ATGCCCAAGCAGAAAGTGGTGGGTTCCCTTTGCATCAAAATGGACCAGGCAATGATGGATAAAACCGTCATATTG
M P K Q K V V G S L C I K M D Q A M M D K T V I L>
>

380 * 400 * 420 * 440 *
AAAGCAAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGATTAGAAACCCTAATACTGCTTAGAGCTTTCACAGAAGAAGGAGCA
K A N F S V I F D R L E T L I L L R A F T E E G A>
>


460 * 480 * 500 * 520
ATCGTGGGAGAAATCTCACCATTACCTTCTCTTTCAGGACATACTAGGGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGCGTC
I V G E I S P L P S L S G H T R E D V K N A I G V>
>
D I L G R M S K M Q L A S>
>


* 540 * 560 * 580 * 600
CTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTAGGATCTCTGAAACTATACAGAGATTCGCTTGGAGAAGC
L I G G L E W N D N T V R I S E T I Q R F A W R S>
>
S S E D L N G M I T Q L G S L K L Y R D S L G E A>
>

* 620 * 640 * 660 *
AGTGATGAGGGTGGGAGACTTCCACTCCCTCCAAATCAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTGAGTCAGAGGTT
S D E G G R L P L P P N Q K R K M A R T I E S E V >
>

V M R V G D F H S L Q I R N G K W R E Q L S Q R F>
>

680 * 700 * 720 * 740 *

TGAAGAAATAAGGTGGCTGATTGAAGAAGTACGACATAGATTGAAAATTACAGAAAACAGCTTCGAACAGATAAC
*>
>

E E I R W L I E E V R H R L K I T E N S F E Q I T>

760 * 780 * 800 * 820
GTTCATGCAAGCCTTACAACTACTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAGCCTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATG
F M Q A L Q L L L E V E Q E I R A F S F Q L I *>
>
* 840
ATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT : 849


TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-2011-NS1(678BP)
TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-2011-NS1(678BP)
TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-2011-NS1(678BP)
TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-2011-NS1(678BP)
TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-2011 NS1(678BP)
TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-2011-NS1(678BP)
TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-2011-NS1(678BP)
DK-VN-QT800-NS2
DK-VN-QT800-NS2
TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NS1(678BP)
DK-VN-QT800-NS2
DK-VN-QT800-NS2
DK-VN-QT800-NS2
DK-VN-QT800-NS2
TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NS1(678BP)

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp gen NS
(A): Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trên thạch agarose 1%, M: Chỉ thị phân tử
DNA chuẩn, giếng 1 và giếng 2: sản phẩm RT-PCR của chủng Dk-VN-QT8000 và chủng
Dk-VN-QT1603 có kích thước khoảng 0,89 kb; (B): DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng
enzym EcoRI, M: Chỉ thị phân tử DNA chuẩn, giếng 1, giếng 2: DNA plasmid tái tổ hợp
clone 1 và clone 2 của chủng Dk-VN-QT8000, giếng 3, giếng 4: DNA plasmid tái tổ hợp
clone 1 và clone 2 của chủng Dk-VN-QT1603.
DNA plasmid tái tổ hợp sau đó được giải trình tự và thu nhận được chuỗi DNA của
phân đoạn 8 chứa 2 gen NS1 gồm 678 bp và NS2 gồm 366 bp (Hình 3.7, phụ lục 1.C).

Hình 3.7. Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen NS chủng Dk-VN-
QT800 (dòng trên là trình tự nucleotide, dòng dưới là trình tự amino acid tương ứng biểu
thị bằng chữ cái (1 chữ cái) ký hiệu của chúng).

Nhận xét:
- Từ mẫu bệnh phẩm của vịt mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 ở Quảng Trị năm 2011,
chúng tôi đã thu nhận và giải trình tự 3 phân đoạn của hệ gen, bao gồm 5 gen: NP, M1,
M2, NS1 và NS2.


- Độ dài của các gen trong nghiên cứu có trình tự như sau: NP: 1497 nucleotide,
M1: 759 nucleotide, M2: 294 nucleotide, NS1: 678 nucleotide và NS2 là 366 nucleotide.
- Trên cơ sở trình tự các gen đã thu nhận được, tiến hành so sánh, phân tích kết quả
và khả năng biến đổi thành phần gen của các chủng trong nghiên cứu với một số chủng của
Việt Nam và thế giới đăng ký trong Ngân hàng gen để xem xét về mối quan hệ phả hệ.
3.2. PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ
HỆ CỦA CHỦNG Dk-VN-QT800 VÀ Dk-VN-QT1603 VỚI CÁC CHỦNG CỦA VIỆT
NAM VÀ THẾ GIỚI
3.2.1. Phân tích gen NP
3.2.1.1. Phân tích trình tự nucleotide và amino acid

Kết quả giải trình tự nucleotide và so sánh với các chủng cho thấy, gen NP của hai
chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 có 186 vị trí nucleotide sai khác với các chủng
so sánh, dẫn tới 27 amino acid sai khác với các chủng so sánh (Phụ lục 2.A).
Bảng 3.2 liệt kê những vị trí sai khác lớn giữa 2 chủng nghiên cứu với 20 chủng
được so sánh.
- Trong đó có 27 vị trí sai khác lớn giữa 2 chủng nghiên cứu với các chủng lựa
chọn so sánh, cụ thể: (G ↔ A) tại các vị trí 222, 225, 237, 294, 486, 531, 810, 846, 1194,
1212, 1242, 1308, 1377, 1452, 1455; (C↔T) tại các vị trí 363, 396, 513, 822, 939, 1035,
1110, 1191, 1230, 1254; (C↔A) tại vị trí 349, 1257. Đặc biệt 2 chủng trong nghiên cứu có
4 nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 486, 531,
846, 1035.
- Đối với chủng Dk-VN-QT800, có 8 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn so với các
chủng so sánh còn lại, cụ thể (A↔G) tại vị trí 647, 898, 1200,1248, (T↔C) tại vị trí 861,
921, 1280, 1404.
- Chủng Dk-VN-QT1603 có 5 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn của so với các
chủng so sánh còn lại, cụ thể (T↔C) tại vị trí 177, 809, 1036, (A↔G) tại các vị trí 746,
1011.
Những sai khác về nucleotide nêu trên dẫn đến thay đổi về amino acid ở 6 vị trí
(Bảng 3.2). Trong đó chỉ 03 vị trí sai khác hoàn toàn giữa chủng Dk-VN-QT800 với các
chủng so sánh, cụ thể: (K↔R) tại vị trí 216, (R↔G) tại vị trí 300, (V↔A) tại vị trí 427.


Tương tự cũng có 3 vị trí có sai khác hoàn toàn giữa chủng Dk-VN-QT1603 với các chủng
so sánh, đó là: (E↔G) tại vị trí 249, (A↔V) tại vị trí 270, (L↔F) tại vị trí 346.
Như vậy, gen NP của hai chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 có một số sai
khác lớn về thành phần nucleotide, tuy nhiên những sai khác về nucleotide này không làm
thay đổi nhiều về thành phần amino acid của chuỗi polypeptide NP.


2.1.2. Phân tích sự đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid

Bảng 3.3. Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen NP giữa một
số chủng chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.

TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
1

99
98

98
98
95
98
96
95
95
95
98
94
96
96
95
97
96
96
97
95
96
2
98

98
98
98
95
99
97
95
95

95
98
95
96
96
95
97
96
96
97
95
96
3
99
99

99
98
96
99
97
95
95
96
98
95
97
97
95
97

97
97
97
95
97
4
99
99
99

99
96
99
97
95
95
96
98
95
97
97
95
97
97
97
97
95
97
5
99

99
99
100

95
99
97
95
95
95
98
95
97
97
95
97
96
96
97
95
97
6
98
98
98
98
98

96
96

99
99
98
96
95
96
96
97
96
97
97
96
96
97
7
99
99
99
100
100
98

97
96
96
96
99
95
97
97

96
97
97
97
98
95
97
8
99
99
99
100
100
98
100

96
96
96
98
96
98
98
96
99
98
98
98
96
98

9
98
98
98
99
99
99
99
99

100
98
96
95
96
96
97
96
97
97
96
96
97
10
98
98
98
99
99
99

99
99
100

98
96
95
96
96
97
96
97
97
96
96
97
11
98
98
98
99
99
98
99
99
98
98

96
96

96
96
97
97
97
97
96
96
98
12
98
98
98
99
99
98
99
99
98
98
98

95
98
98
96
98
97
97
98

95
97
13
98
98
98
99
99
98
99
99
98
98
98
99

96
96
96
96
97
97
95
95
97
14
99
99
99
100

100
98
100
100
99
99
99
99
99

99
96
99
98
98
98
96
98
15
99
99
99
100
100
98
100
100
99
99
99

99
99
100

97
99
98
98
98
96
98
16
98
98
99
99
99
98
99
99
98
98
98
99
99
99
99

97
97

97
96
96
98
17
99
99
99
100
100
98
100
100
99
99
99
99
99
100
100
99

98
98
98
96
98
18
99
99

99
99
99
98
99
99
98
98
98
99
99
99
99
99
99

99
97
97
99
19
98
98
99
99
99
98
99
99
98

98
98
99
99
99
99
99
99
99

97
97
99
20
98
98
99
99
99
98
99
99
98
98
98
98
98
99
99
98

99
99
98

97
97
21
98
98
98
98
98
97
98
98
97
97
97
98
98
98
98
98
98
98
98
98

97
22

99
99
99
99
99
98
99
99
98
98
98
99
99
98
99
99
99
99
99
99
98




Ghi chú : 1. Dk-VN-QT-801-2011; 2. Dk-VN-QT1603-2011: 3. Md-VN-LBM113-2012; 4. Md-VN-LBM132-2012; 5. EVM-Hunan-3-
2011: 6. Eurasian-eagle-owl-KP-Q13
3.2.2. Phân tích gen M
3.2.2.1. Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Bảng 3.6. Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen M1 giữa các

chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.

TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
1

99
99
99

99
96
99
96
96
96
96
97
97
98
97
98
99
97
97
98
97
97
2
99

98
98
99
96
98
96
96
96
96

97
97
98
97
98
99
97
97
97
96
97
3
99
98

99
98
96
98
96
96
96
96
97
97
98
97
98
99
97

97
98
97
97
4
99
98
100

99
96
99
96
96
96
96
97
97
98
97
98
99
97
97
98
97
97
5
100
99

99
99

96
98
96
96
96
96
97
97
98
97
98
99
97
97
97
97
97
6
100
99
99
99
100

96
99
99

99
98
98
97
98
97
98
97
97
97
98
96
97
7
99
98
98
98
99
99

96
96
96
96
97
97
98
97
98

99
97
97
97
96
97
8
99
98
99
99
99
99
98

98
98
99
98
97
98
97
98
97
97
97
98
96
97
9

99
98
99
99
99
99
98
99

99
98
98
97
97
97
97
97
97
97
98
96
97
10
100
99
99
99
100
100
99

99
99

98
98
97
98
97
98
97
97
97
98
96
97
11
100
99
99
99
100
100
99
99
99
100

98
97
98

97
98
97
97
97
98
96
97
12
100
99
99
99
100
100
99
99
99
100
100

97
98
98
98
98
98
98
98
97

98
13
99
98
100
100
99
99
98
99
99
99
99
99

98
98
98
98
98
98
98
98
98
14
100
99
99
99
100

100
99
99
99
100
100
100
99

99
100
99
98
99
98
98
99
15
100
99
99
99
100
100
99
99
99
100
100
100

99
100

99
98
98
98
98
97
98
16
100
99
99
99
100
100
99
99
99
100
100
100
99
100
100

99
98
99

99
98
99
17
100
99
99
99
100
100
99
99
99
100
100
100
99
100
100
100

98
98
98
97
98
18
100
99
99

99
100
100
99
99
99
100
100
100
99
100
100
100
100

99
98
98
99
19
100
99
99
99
100
100
99
99
99
100

100
100
99
100
100
100
100
100

98
98
99
20
100
99
99
99
100
100
99
99
99
100
100
100
99
100
100
100
100

100
100

98
99
21
100
99
99
99
100
100
99
99
99
100
100
100
99
100
100
100
100
100
100
100

98

22
99
98
99
99
99
99
98
99
99
99
99
99
99
99
99
99
99
99
99
99
99


Ghi chú : 1. Dk-VN-QT-801-2011; 2. Dk-VN-QT1603-2011: 3. Md-VN-LBM113-2012; 4. Md-VN-LBM132-2012; 5. EVM-Hunan-3-
2011: 6. Eurasian-eagle-owl-KP-Q133:
7. A-Hubei-1-2010: 8. Ck-Jiangsu-k0402-2010: 9. Dk-Hokkaido-WZ83-2010: 10. Dk-Hokkaido-WZ101-2010: 11. Water-Hunan-2009:
12 Great-crested-grebe-Qinghai-2009.:
13. Water-Hebei-2009: 14. Water-Xinjiang-2009: 15. Ck-Hunan-2008: 16. Black-crowned-heron-HK-659-2008: 17. Grey-heron-HK-
1046-2008: 18. Little-egret-HK-8863-2007:

19. A-VN-HN31388M1-2007: 20. A-VN-UT31239-2007: 21. Md-Vietnam-1455-2006: 22. Dk-VN-208-2005.


DK-VN-QT800-2011
DK-VN-QT1603-2011
EVM-Hunan-3-2011-JX576787-M1
A-Hubei-1-2010-CY098761
Md-VN-LBM113-2012-AB742258
Md-VN-LBM132-2012-AB742266-M1
Grey-heron-HK-1046-2008-CY036248
Water-Xinjiang-2009-CY098833
Ck-Hunan-2008-GU182162
Black-crowned-heron-HK-659-2008-CY036232
Dk-VN-208-2005-EU930941
Water-Hebei-2009-CY098777
Md-VN-1455-2006-CY029538
A-VN-HN31388-2007-HM114588
A-VN-UT31239-2007-HM114556
Little-egret-HK-8863-2007-CY036208
Water-Hunan-7-2009-
CY098856-M1
Ck-Jiangsu-k0402-2010-JQ638675
Great-crested-grebe-Qinghai-2009-CY06332
Eurasian-eagle-owl-HK-Q133-2011-JN808066
Dk-Hokkaido-WZ83-2010-AB612904
Dk-Hokkaido-WZ101-2010-AB612912
82
99
62
94

97
80
65
63
94
99
98
88
97
65
35
67
38
26
76
0.002
M1
Nucleotide
Clade 2.3.4
Clade 2.3.2
Clade 2.3.2
Clade 2.3.2.1
Clade 2.3.2.1
Eurasian-eagle-owl-KP-Q133-2011-JN808066
Dk-Hokkaido-WZ101-2010-AB612912
Dk-Hokkaido-WZ83-2010-AB612904
Ck-Jiangsu-k0402-2010-JQ638675
Great-crested-Qinghai-2009-CY063321
A-VN-HN31388M1-2007-HM114588
A-VN-UT31239-2007 HM114556.txt

Little-egret-HK-8863-2007-CY036208
Water-Hunan-7-2009-CY098856
Md-Vietnam-1455-2006-CY029538
Ck-Hunan-2008-GU182162
Black-crowned-heron-HK-659-2008-CY036232
Dk-VN-208-2005-EU930941
Water-Xinjiang-2009-CY098833
Grey-heron-HK-1046-2008-CY036248
Md-VN-LBM132-2012-AB742266
Dk-VN-QT800-2011
EVM-Hunan-3-2011-JX576787
Md-VN-LBM113-2012-AB742258
Dk-VN-QT1603-2011
A-Hubei-1-2010-CY098761
Water-Hebei-2-2009-CY098777
66
40
11
9
14
81
51
47
48
49
30
45
9
5
7

0.002
Clade 2.3.2.1
Clade 2.3.2.1
Clade 2.3.2
Clade 2.3.4
Clade 2.3.2
M2
Nucleotide
3.2.2.3. Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc
Gen M1 và M2 thu nhận từ chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 được đưa vào phân tích phả hệ cùng với 20 chủng
A/H5N1 của Việt Nam và thế giới (Hình 3.9., phụ lục 3.A).

Hình 3.9 : Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ nguôn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 dựa trên phân tích trình tự nucleotide gen
M1 và gen M2 sử dụng chương trình MEGA4.0 (phương pháp kết nối liền kề NJ – Neighbour Joining, với hệ số kiểm định tin cậy đã
thử 1000 bootstrap). Mũi tên chỉ dẫn các chủng phân lập và phân tích trong nghiên cứu này.


3.2.3. Phân tích gen NS
3.2.3.1. Phân tích trình tự nucleotide và amino acid
Gen NS thu nhận từ chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 mã hoá cho 2 chuỗi
polypeptide NS1 và NS2 (Hình 3.6). Gen NS1 có độ dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino
acid, khởi đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen NS2 có độ dài 366 bp
bao gồm 121 amino acid, bắt đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAA. Gen NS2
và NS1 có chung 30 nucleotide đầu 5’ của vùng mã hóa và gen NS2 được tạo ra do ghép
nối 30 nucleotide này với 336 nucleotide từ vị trí 514 trở về sau cho đến nucleotide 849.
Phần mã hóa này tạo ra một khung đọc khác, lệch một nucleotide so với khung đọc của
gen NS1.
3.2.3.2. Phân tích sự đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid
Kết quả phân tích cho thấy:
Đối với gen NS1 (Bảng 3.10)
- Chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 có tỷ lệ đồng nhất và tương đồng với

các chủng so sánh qua các năm 2005-2012 có sự biến động 92 - 99% về thành phần
nucleotide và 90 - 99% về thành phần amino acid; so với các chủng khác của Việt Nam tỷ
lệ này là 92 - 99% và 90 - 99%; so với các chủng của thế giới các tỷ lệ tương ứng là 96 -
98% và 93 - 99%.
Đối với gen NS2 (Bảng 3.11)
- Các chủng có tỷ lệ đồng nhất về nucleotide là 93 - 100% và tương đồng về amino
acid với các chủng so sánh từ năm 2005 tới năm 2012 biến động khá lớn 89 - 100%.
Nhìn chung, tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid của chủng
Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 là khá cao so với một số chủng phân lập qua các năm
2010 - 2012, nhưng có biến động lớn hơn so với một số chủng phân lập qua các năm 2005
– 2009


NS1
Nucleotide
Clade 2.3.2.1
Clade 2.3.2
Clade 2.3.4
Clade 2.3.2
DK-VN-QT800-2011
Dk-VN-QT1603-2011
Md-VN-LBM113-2012-AB742259
Md-VN-LBM132-2012-AB742267
A-Hubei-1-2010-CY098762
EVM-Hunan-3-2011-JX576790
Water-Hunan-7-2009-CY098857
Dk-Hokkaido-WZ101-2010-AB612913
Dk-Hokkaido-WZ83-2010-AB612905
Eurasian-eagle-owl-KP-Q133-2011-JN808066
Ck-Jiangsu-k0402-2010-JQ638681

Great-crested-Qinghai-1-2009-CY063322)
Black-crowned-heron-HK-659-2008-CY036233
Little-egret-HK-8863-2007-CY036209
Grey-heron-HK-10462008-CY036249
Ck-Hunan-2008-GU182161
Water-Xinjiang-2009-CY098834
Dk-VN-208-2005-EU930944
Water-Hebei-2-2009-CY098778
A-VN-HN31388M1-2007-HM114589
A-VN-UT31239-2007-HM114557
Md-Vietnam-1455-2006-CY029539
88
48
28
9
42
86
61
61
70
67
51
86
87
67
0.005
Md-VN-LBM132-2012-AB742267
EVM-Hunan-3-2011-JX576790
DK-VN-QT1603-2011
Dk-VN-QT800-2011

Md-VN-LBM113-2012-AB742259
A-Hubei-1-2010-CY098762
Water-Hunan-7-2009-CY098857
Dk-Hokkaido-WZ83-2010-AB612905
Dk-Hokkaido-WZ101-2010-AB612913
Little-egret-HK-8863-2007-CY036209
Ck-Jiangsu-k0402-2010-JQ638681
Eurasian-eagle-owl-KP-Q133-2011-JN808
Great-crested-Qinghai-1-2009-CY063322
Black-crowned-heron-HK-659-2008-CY036233
Grey-heron-HK-10462008-CY036249
Ck-Hunan-2008-GU182161
Water-Xinjiang-3-2009-CY098834
Water-Hebei-2-2009-CY098778
Dk-VN-208-2005-EU930944
A-VN-HN31388M1-2007-HM114586
A-VN-UT31239-2007-HM114557
Md-Vietnam-1455-2006-CY029539
87
29
54
37
19
8
70
69
38
36
59
30

25
0.01
NS2
Nucleotide
Clade 2.3.2.1
Clade 2.3.2
Clade 2.3.4
Clade 2.3.2.
Clade 2.3.2.1
.2.3.3. Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc
Gen NS thu nhận từ chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 được phân tích phả hệ cùng với 20 chủng A/H5N1 của Việt Nam
và thế giới (Hình 3.10, Phụ lục 3.B).













Hình 3.10. Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ nguôn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 dựa trên phân tích trình tự nucleotide gen
NS1 và NS2 sử dụng chương trình MEGA4.0 (phương pháp kết nối liền kề NJ – Neighbour Joining, với hệ số kiểm định tin cậy đã thử
1000 bootstrap). Mũi tên chỉ dẫn các chủng phân lập và phân tích trong nghiên cứu n

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
(1) Toàn bộ 3 phân đoạn thuộc nhóm gen cấu trúc gồm phân đoạn 5: gen NP; phân đoạn 7: gen
M và phân đoạn 8: gen NS của virus cúm A/H5N1 chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 đã
được thu nhận và giải trình tự.
- Phân đoạn 5 chứa gen NP có kích thước 1497 nucleotide mã hoá cho chuỗi polypeptide
NP gồm 498 amino acid; Phân đoạn gen M có kích thước 998 nucleotide; phân đoạn gen NS có
kích thước 875 nucleotide.
- Phân đoạn 7 (gen M) và phân đoạn 8 (gen NS) xảy ra hiện tượng cắt – nối exon
(splicing) tạo ra các sản phẩm gen khác nhau.
(2) Chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 có mức độ đồng nhất (về nucleotide) và tương
đồng (về amino acid) cao ở tất cả 3 phân đoạn gen với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở Việt
Nam năm 2012 và với chủng cúm A/H5N1 phân lập trên người ở Hồ Bắc – Trung Quốc năm
2010.
(3) Phân tích mối quan hệ phả hệ từng gen riêng biệt của toàn bộ hệ gen cho thấy chủng Dk-VN-
QT800và Dk-VN-QT1603 tập hợp trong cùng nhóm với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở Việt
Nam năm 2012 và với chủng cúm A/H5N1 phân lập trên người ở Hồ Bắc – Trung Quốc năm
2010
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục giải trình tự toàn bộ hệ gen của các chủng virus cúm A/H5N1 mới xuất hiện
trong năm 2012 và những năm tiếp theo, lưu giữ các gen của các chủng phân lập ở các địa
phương khác nhau, trên đối tượng các vật chủ khác nhau để trên cơ sở đó giám sát chặt chẽ cũng
như có biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm đạt hiệu quả. Cần phân tích đặc tính sinh học
phân tử nhóm gen kháng nguyên của các chủng mới xuất hiện năm 2012 và những năm tiếp theo
để đánh giá mức độ tiến hóa cũng như mối quan hệ về kháng nguyên-miễn dịch của các chủng
virus cúm A/H5N1 với các chủng vaccine cũng như tạo được nguồn nguyên liệu chủ động trong
việc kiến tạo và sử dụng vaccine tại Việt Nam.

References
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Nguyễn
Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2006), "Phân tích mối tương đồng kháng nguyên và
miễn dịch giữa các chủng virus cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng
vacxin cúm A/H5N1", Tạp chí Công nghệ sinh học 4 (3), tr. 1-7.
2. Lê Thanh Hòa (2006), Y-sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học tập 1, tr. 29-48.
3. Lê Thanh Hòa, Nguyễn Thị Bích Nga, Trần Quang Vui, Nguyễn Mạnh Kiên, Nguyễn
Xuân Vũ, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), "Phát hiện chủng virus cúm A/H5N1
dòng Phúc Kiến gây bệnh trên gia cầm/người tại Việt Nam", Tập san Hội nghị khoa học
toàn quốc lần thứ tư: Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công
nghiệp thực phẩm (Hà Nội, 16-17/10/2008).
4. Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp (2006), "Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng
chống cúm A/H5N1 cho người trên phôi gà từ chủng NIBRG-14 tại Viện vacxin và sinh
phẩm y tế, Nha Trang", Tạp chí Y học dự phòng 16 (5), tr. 5-10.
5. Lương Thị San, Phạm Thị Sửu, Nguyễn Thanh Liêm, Nguyễn Thị Dung, Phạm Phương Mai,
Nguyễn Văn Vĩnh Châu, Võ Công Đồng, Lê Thị Quỳnh Mai, Trần Tịnh Hiền, Hoàng Thuỷ Long,
Nguyễn Thị Kim Tiến, Menno De Jong, Peter Cheng, Tổ điều tra cúm gia cầm quốc tế của WHO
và Jeremy Farra cùng 14 cộng sự (2004), "Cúm gia cầm týp A (H5N1) trên 10 bệnh nhân ở
Việt Nam", Thời sự Y Dược học bộ 9 (2), tr. 67-74.
6. Phạm Văn Ty (2005); Virus học. Nhà xuất bản giáo dục, 334 trang.
7. Cao Thị Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Thanh Long, Lê Hà Tầm Dương (2005), "Đánh
giá về độc tính và khả năng lây cho người của virus cúm A/H5N1 qua các vụ dịch 2004-
2005 tại miền Nam Việt Nam qua giám sát đột biến gen", Tạp chí Y học dự phòng, 15
(6), tr. 5-10.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. ACIP - Advisory Committee on Immunization Practices (2000), "Prevention and Control
of Influenza", 49 (03), pp. 1-38.
9. Alonso-Caplen F.V., Nemeroff M.E., Qiu Y., and Krug R.M., (1991),
"Nucleocytoplasmic transport: The influenza virus NS1 protein regulates the transport of
spliced NS2 mRNA and its precursor NS1 mRNA", Genes and Development, 6, pp. 255-
267.


10. Baigent S.J., McCauley J.W. (2001), "Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length
of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue
culture", Virus Res, 79(1-2), pp. 177-185.
11. Basler C.F. (2007), "Influenza viruses: basic biology and potential drug targets", Infect
Disord Drug Targets, 7(4), pp 282-93. Review.
12. Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim
W., Subbarao K. (1999), "Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1)
viruses isolated from humans in 1997-1998", Virology, 254, pp. 115-123.
13. Castrucci M.R., Kawaoka Y. (1993), "Biologic importance of neuraminidase stalk length
in influenza A virus", J Virol, 67, pp. 759-764.
14. Cauthen A.N., Swayne D.E., Schultz-Cherry S., Perdue M.L., Suarez D.L. (2000),
"Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding
the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and
humans", J Virol, 74, pp. 6592-6599.
15. Chen W., Calvo P.A., Malide D., Gibbs J., Schubert U., Bacik I., Basta S., O’Neill R.,
Schickli J., Palese P., Henklein P., Bennink J.R., Yewdell J.W. (2001), "A novel
influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death", Nat Med, 7(12), pp.
1306-1312.
16. Chen Z. (2004), "Influenza DNA vacxin: an update", Chin. Med. J. (Engl), 117(1), pp.
125-132.
17. Claas E.C., Osterhaus A.D., van Beek R., De Jong J.C., Rimmelzwaan G.F., Senne D.A.,

Krauss S., Shortridge K.F., Webster R.G. (1998), "Human influenza A H5N1 virus
related to a highly pathogenic avian influenza virus", Lancet, 351, pp. 472-477.
18. Coleman J.R. (2007), "The PB1-F2 protein of Influenza A virus: increasing
pathogenicity by disrupting alveolar macrophages", J Virol, 4, pp. 9-11.
19. Davis C.T, Balish A.L, O’Niell E, Nguyen C.V, Cox N.J, Xiyan X, Klimov A, Nguyen
T, Donis R.O (2010), "Detection and characterization of clade 7 high pathogenicity avian
influenza H5N1 viruses in chickens seized at ports of entry and live pouly markets in
Vietnam", Avian Dis, 54(1 Suppl), pp. 307-312.
20. de Jong M.D, Hien T.T (2006), "Avian influenza A (H5N1)", J Clin Virol, 35(1), pp. 2-
13. Review.