Phân tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Phân tích proteomics mô ung thƣ của bệnh
nhân ung thƣ đại trực tràng


Nguyễn Thị Ngọc Hà


Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Trịnh Hồng Thái
Năm bảo vệ: 2012


Abstract. Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô
ung thƣ đại trực tràng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Phân tích và so sánh
sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thƣ đại trực tràng so với mô đại
trực tràng bình thƣờng thông qua biểu hiện của các điểm protein trên bản gel điện
di hai chiều. Nhận dạng đƣợc một số protein biểu hiện khác biệt đặc trƣng giữa
mô ung thƣ đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thƣờng.

Keywords. Sinh học thực nghiệm; Proteomics; Mô ung thƣ; Ung thƣ đại trực
tràng



Content
MỞ ĐẦU
Ung thƣ đại trực tràng là một trong những bệnh ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới,
nó đứng thứ ba chỉ sau ung thƣ phổi và ung thƣ vú. Đây là căn bệnh có tỷ lệ tử vong cao và
tỷ lệ mắc bệnh có xu hƣớng ngày càng tăng. Theo thống kê, năm 2008 ƣớc tính có khoảng

1,24 triệu ngƣời trên thế giới đƣợc chẩn đoán là mắc ung thƣ đại trực tràng, chiếm khoảng
10% trong số các loại ung thƣ. Số ca tử vong do ung thƣ đại trực tràng trong năm 2008 là
610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lƣợng tử vong do ung thƣ.
Việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thƣ đại trực tràng có ý nghĩa rất quan trọng,
giúp làm tăng hiệu quả điều trị bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do loại ung thƣ này gây ra. Thực tế
cho thấy, nếu phát hiện khối u đại trực tràng ở giai đoạn đầu và chữa trị kịp thời thì tỷ lệ
sống sót của bệnh nhân sau 5 năm sẽ là 80 – 100%. Hiện nay, một số phƣơng pháp xét
nghiệm lâm sàng đang đƣợc áp dụng để chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng. Tuy nhiên, các
phƣơng pháp này là thƣờng phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn, cho kết quả có độ chính xác
không cao. Nhu cầu đặt ra cho các nhà khoa học là làm thế nào để tìm ra đƣợc các chỉ thị
sinh học đặc trƣng để chẩn đoán, phát hiện ung thƣ đại trực tràng ở giai đoạn sớm.
Hiện nay, một trong những hƣớng nghiên cứu chỉ thị sinh học cho ung thƣ đại trực
tràng đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm là sử dụng công cụ proteomics. Bằng việc
phân tích sự biến đổi trong thành phần, số lƣợng các protein có mặt trong huyết thanh, dịch

cơ thể, mô ung thƣ của bệnh nhân ung thƣ, các nhà khoa học hi vọng tìm ra đƣợc các chỉ
thị sinh học mới, dễ nhận biết để ứng dụng chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng ở giai đoạn
sớm, nhằm phục vụ công tác chẩn đoán, điều trị bệnh một cách hiệu quả.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân tích
proteomics mô ung thƣ của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng“ với mục tiêu:
- Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ
đại trực tràng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng.
- Phân tích và so sánh sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thƣ đại trực
tràng so với mô đại trực tràng bình thƣờng thông qua biểu hiện của các điểm protein trên
bản gel điện di hai chiều.
- Nhận dạng đƣợc một số protein biểu hiện khác biệt đặc trƣng giữa mô ung thƣ
đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thƣờng.
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc phòng thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội.

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.1.1. Ung thƣ đại trực tràng là gì?
Ung thƣ đại trực tràng là loại ung thƣ phổ biến nhất trong các loại ung thƣ đƣờng
tiêu hóa, bao gồm ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng đƣợc gọi theo tên của mô, nơi
phát sinh ung thƣ.
Ung thƣ đại trực tràng xảy ra khi một số tế bào ở lớp lót trong (còn gọi là niêm mạc)
của đại tràng hay trực tràng trở nên bất thƣờng và phát triển một cách không kiểm soát
đƣợc, tạo thành khối u (còn gọi là polyp). Các khối u này có thể là u lành tính hay u ác
tính. U ác tính là chính là ung thƣ đại trực tràng. Khi di căn, các tế bào ung thƣ đại trực
tràng thƣờng di căn tới gan.
Ung thƣ đại trực tràng là ung thƣ phổ biến thứ ba trên thế giới chỉ sau ung thƣ phổi
và ung thƣ vú. Năm 2008 ƣớc tính có khoảng 1,24 triệu ngƣời trên thế giới đƣợc chẩn đoán
là mắc ung thƣ đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thƣ. Số ca tử vong
do ung thƣ đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng
8% số lƣợng tử vong do ung thƣ [16, 45].
Tại Việt Nam, ung thƣ đại trực tràng là loại ung thƣ đứng thứ năm trong các loại ung
thƣ thƣờng gặp, sau ung thƣ dạ dày, phổi, vú, vòm họng và bệnh này có xu hƣớng ngày
càng tăng cao. Theo thống kê của Bệnh viện Ung Bƣớu TPHCM, năm 2007, bệnh viện có
218 ca bệnh ung thƣ đại trực tràng. Năm 2008 con số này là 306 ca và tính đến tháng 9
năm 2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung thƣ đại trực tràng [54]. Theo
thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ mắc ung thƣ đại tràng là 9% tổng số bệnh nhân ung thƣ
[55].
1.1.2. Nguyên nhân dẫn đến ung thƣ đại trực tràng
Nguyên nhân chính xác dẫn đến ung thƣ đại trực tràng vẫn chƣa đƣợc chứng minh rõ
ràng. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng đã cho thấy một số yếu tố có khả năng làm tăng
nguy cơ mắc ung thƣ đại trực tràng, bao gồm yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền.

Yếu tố không di truyền

Theo một số nghiên cứu, số lƣợng ngƣời mắc ung thƣ đại trực tràng không liên quan
đến các yếu tố di truyền chiếm 75 - 95% tổng số ngƣời mắc bệnh [41]. Các yếu tố này bao
gồm: lứa tuổi, giới tính, chế độ ăn uống, thuốc lá, chế độ vận động của cơ thể, các bệnh
liên quan đến viêm đại tràng, polyp đại tràng…
Các yếu tố di truyền
Trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng liên quan đến bệnh sử ung thƣ trong gia đình chỉ
chiếm khoảng 20% trong tất cả các trƣờng hợp mắc bệnh. Trong đó, chỉ có 5% các trƣờng
hợp là do di truyền các gen gây ung thƣ từ bố, mẹ sang con cái. Các bệnh di truyền liên
quan đến việc hình thành ung thƣ đại trực tràng bao gồm hội chứng đa polyp tuyến gia
đình (Familial Adenomatous Polyposis – FAP), hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền
(Attenuated Familial Adenomatous Polypsis – AFAP), hội chứng ung thƣ đại tràng di
truyền không phải đa polyp (Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer – HNPCC).
1.1.3. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thƣ đại trực tràng
Hệ thống phân loại theo Duke [12]
Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một nhà giải phẫu ngƣời Anh đã đƣa ra hệ thống
phân loại giai đoạn cho ung thƣ trực tràng. Theo hệ thống phân loại này, ung thƣ trực tràng
đƣợc chia ra thành 4 giai đoạn:
Duke A: Khối u bị giới hạn ở thành của trực tràng.
Duke B: Khối u xâm lấn qua thành của trực tràng nhƣng chƣa ảnh hƣởng đến các
hạch bạch huyết.
Duke C: Khối u lan tới các hạch bạch huyết cạnh trực tràng.
Duke D: Khối u di căn tới các bộ phận khác trên cơ thể nhƣ thận, gan, phổi…
Hệ thống phân loại TNM
Hệ thống phân loại ung thƣ đại trực tràng TNM (Tumor – Lympho node –
Metastases) là hệ thống đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Hệ thống phân loại TNM
phân giai đoạn ung thƣ đại trực tràng dựa vào kích thƣớc khối u (T), mức độ lây lan của
khối u tới các hạch bạch huyết (N) và mức độ di căn tới các cơ quan khác của cơ thể (M).
Con số đƣợc thêm vào phía sau mỗi chữ cái cho biết kích thƣớc hoặc phạm vi của khối u

và mức độ di căn. Ở nhiều loại ung thƣ, các cách phối hợp TNM này tƣơng ứng với một
trong 5 giai đoạn (hình 2).

Hình 2. Các giai đoạn phát triển của ung thƣ đại trực tràng [50]
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ
Chỉ thị sinh học (Biomarker) đƣợc định nghĩa là các phần tử đƣợc tìm thấy trong
máu, trong các loại dịch của cơ thể hoặc trong mô, đặc trƣng cho một quá trình sinh lý hoặc
các giai đoạn bệnh lý.

1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ
Chỉ thị sinh học ung thƣ là những phần tử có trong tế bào hoặc mô ung thƣ, trong
máu hay dịch cơ thể khác. Chỉ thị sinh học gồm 2 loại chính là chỉ thị tế bào và chỉ thị thể
dịch. Chỉ thị ung thƣ dạng tế bào bao gồm các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể
hormone và thụ thể yếu tố tăng trƣởng, những biến đổi ADN, mARN, yếu tố phiên mã của
tế bào. Chỉ thị ung thƣ dạng thể dịch bao gồm các chất đƣợc phát hiện ở nồng độ bất
thƣờng có mặt trong huyết thanh, nƣớc tiểu và các loại dịch khác của cơ thể [2]. Một chỉ
thị ung thƣ lý tƣởng là chỉ thị có thể dễ dàng xác định đƣợc, cho kết quả đáng tin cậy, các
xét nghiệm sử dụng loại chỉ thị này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, chi phí thấp.
1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh
học ung thƣ
Hiện nay, có 3 kỹ thuật sinh học phân tử chính đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu chỉ
thị sinh học của ung thƣ bao gồm:
 Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng những biến đổi gen liên quan
đến sự phát sinh ung thƣ.
 Sử dụng kỹ thuật proteomics để xác định những biến đổi của các protein liên
quan đến quá trình phát sinh, hình thành ung thƣ. Ƣu điểm của kỹ thuật proteomics là có
khả năng nghiên cứu đƣợc mức độ biểu hiện của gen thông qua các phân tử protein tạo ra.
 Sử dụng kỹ thuật metabolomics để nghiên cứu tất cả những chất chuyển hóa
đƣợc tạo ra trong tế bào, trong mô.
1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.3.1. Proteomic là gì?
Proteomics là môn khoa học nghiên cứu các protein đƣợc biểu hiện trong tế bào,
mô hoặc cơ thể trong những điều kiện và thời gian xác định [1]. Không chỉ dừng lại nghiên
cứu sự tồn tại của protein của một tế bào nào đó, proteomics còn đi sâu nghiên cứu tất cả
các dạng protein đã đƣợc cải biến, tƣơng tác giữa các protein, cấu trúc không gian và các
phức hệ cao hơn của protein.
1.3.2. Công cụ nghiên cứu proteomics
Để phân tích cả hệ gồm nhiều protein, kỹ thuật proteomics cần có sự hỗ trợ của 4
công cụ phân tích sau:
Công cụ đầu tiên là cơ sở dữ liệu. Các dữ liệu về protein, các trình tự biểu hiện
đƣợc đánh dấu và trình tự genome hoàn chỉnh là một dữ liệu đầy đủ và chọn lọc cho tất cả
các protein biểu hiện trong các cơ thể.
Công cụ thứ hai là khối phổ, đây là bộ phận trung tâm và cơ bản của phân tích
proteomics. Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ đƣợc lựa chọn
để phân tích hệ protein. Kỹ thuật này phân tích các protein hay các mảnh peptide theo tỷ số
m/z (khối lƣợng/độ tích điện).
Công cụ thiết yếu thứ ba là hệ thống phần mềm có thể so sánh, đối chiếu dữ liệu
khối phổ với các trình tự protein đặc trƣng trong cơ sở dữ liệu.
Công cụ thiết yếu thứ tƣ trong nghiên cứu proteomic là các kỹ thuật phân tách
protein. Công việc phân tách protein nhằm hai mục đích chính. Thứ nhất, nó làm đơn giản
các phức hệ protein phức tạp bằng cách phân tách chúng thành các phân tử hay nhóm nhỏ
protein độc lập. Thứ hai, việc phân tách này cho cái nhìn tổng quan về sự khác biệt của hệ
protein giữa hai mẫu khác nhau, nhờ đó xác định đƣợc các protein đặc trƣng để phân tích.
Ngày nay, hai dạng phân tích proteomics chủ đạo đƣợc sử dụng là: điện di hai chiều kết
hợp với khối phổ và sắc ký hai chiều kết hợp với khối phổ.

1.3.3. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng
Trên thế giới, sự phát triển của nghiên cứu proteomics đƣợc đánh dấu bằng sự ra
đời của tổ chức nghiên cứu hệ protein ngƣời (Human Proteome Organisation–HUPO) tại
Pháp năm 2002. Bên cạnh đó còn có các tổ chức khu vực, trong đó có tổ chức AOHUPO

(Asia Oceania Human Proteome Organisation) thuộc châu Á-châu Đại Dƣơng.
Một trong những ứng dụng quan trọng đầu tiên của proteomics là trong lĩnh vực
nghiên cứu ung thƣ. Việc tìm ra những biến đổi trong hệ protein của bệnh nhân ung thƣ có
thể giúp các nhà khoa học tìm hiểu rõ hơn về cơ chế phát sinh bệnh ở mức độ phân tử. Các
protein biến đổi cũng có thể trở thành các chỉ thị sinh học mới góp phần sàng lọc, chẩn
đoán sớm và theo dõi tiến triển của bệnh.
Phân tích proteomics huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng
Huyết tƣơng tách từ máu ngƣời là một hệ protein tuyệt vời cho phân tích
proteomics. Nó tập hợp các protein từ các mô khác nhau trong cơ thể. Những hiểu biết về
hệ protein huyết tƣơng mang lại những thông tin quan trọng về nhiều quá trình sinh học
diễn ra trong cơ thể.
Chỉ thị sinh học đƣợc tìm thấy trong huyết tƣơng là chỉ thị lý tƣởng cho chẩn đoán
ung thƣ do rất dễ dàng thu thập mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân và việc chẩn đoán sẽ dễ
dàng hơn. Hiện nay, chỉ thị CEA có mặt trong máu đang đƣợc ứng dụng rộng rãi để chẩn
đoán ung thƣ đại trực tràng. Tuy nhiên, nhƣ đã đề cập ở trên, sử dụng chỉ thị CEA chỉ có
khả năng phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV). Hơn nữa, chi phí cho xét
nghiệm CEA tƣơng đối cao. Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm thêm các chỉ thị sinh học trong
máu để ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ đại trực tràng là hết sức cần thiết.
Năm 2004, Yu và cs đã tiến hành phân tích proteomics huyết tƣơng của 182 mẫu
khác nhau gồm 55 mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, 35 mẫu huyết
tƣơng của bệnh nhân u tuyến đại trực tràng và 92 mẫu huyết tƣơng của ngƣời bình thƣờng.
Nghiên cứu đã chỉ ra 4 protein khác biệt giữa bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và ngƣời
bình thƣờng. Các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học với độ đặc hiệu 92% và
độ nhạy là 89% [39].
Năm 2005, với kỹ thuật SELDI-TOF/MS, Albrethsen và cs đã so sánh các protein
có trong mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại tràng với huyết tƣơng của ngƣời khỏe
mạnh và protein có trong mô ung thƣ đại tràng với mô đại tràng bình thƣờng. Nghiên cứu
này cho thấy hàm lƣợng các protein HNP- 1, HNP- 2 và HNP- 3, còn đƣợc gọi là α-
defensin-1, α-defensin-2, α-defensin-3 tăng lên trong huyết tƣơng của ngƣời bệnh và trong
mô tại vị trí khối u. Một phần của protein HNP 1-3 sẽ kết hợp với loại protein khối lƣợng

lớn chƣa xác định trong huyết tƣơng. Nhóm nghiên cứu đề xuất rằng HNP 1-3 có thể đƣợc
coi nhƣ chỉ thị sinh học trong máu của bệnh nhân ung thƣ đại tràng [4Error! Reference
source not found.].
Ngoài các nghiên cứu nhằm tìm kiếm chỉ thị sinh học để chẩn đoán bệnh trong giai
đoạn sớm, các nhà khoa học còn tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc trƣng cho tình trạng di căn
của ung thƣ đại trực tràng. Năm 2010, Xue và cs đã tiến hành nghiên cứu với mục đích nhƣ
vậy. Bằng kỹ thuật LC-MS/MS, các nhà khoa học đã so sánh mức độ thay đổi lƣợng các chất
tiết vào trong máu từ các dòng tế bào ung thƣ ban đầu và dòng tế bào đã di căn đƣợc lấy trên
cùng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. 6 protein khác biệt đặc trƣng đã đƣợc xác nhận bằng
kỹ thuật Western blot. Trong đó, yếu tố trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trƣởng 15 là 2
protein có biểu hiện tăng ở các dòng tế bào đã di căn. Sử dụng kỹ thuật ELISA bánh kẹp
cũng chỉ ra rằng 2 protein này có mức độ biểu hiện tăng lên đáng kể trong huyết tƣơng ở ung
thƣ đại trực tràng đã di căn tới hạch bạch huyết. Kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này có thể

cho thấy trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trƣởng 15 có trong huyết tƣơng có thể ứng dụng
đƣợc để chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng đã di căn [37].
Phân tích proteomics mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng
Với mục đích nghiên cứu, tìm kiếm chỉ thị sinh học cho ung thƣ đại trực tràng, năm
2005, Alfonso và cs đã tiến hành phân tích proteomics ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng
nhờ kỹ thuật 2D-PAGE kết hợp MS. Nghiên cứu đƣợc tiến hành với mẫu mô tại vị trí khối
u và đối chứng là mẫu mô tại vị trí cận khối u của 7 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng.
Nghiên cứu đã chỉ ra 72 protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ và mô bình thƣờng.
Nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt bằng phân tích khối phổ đã xác định đƣợc 41
protein. Các protein khác biệt liên quan đến quá trình điều hòa phiên mã, các protein tín
hiệu (annexins IV và V, relaxin, APC), các protein tham gia tổ chức khung xƣơng tế bào
(vimentin, cytokeratins, beta actin) và các protein liên quan đến quá trình tổng hợp và cuộn
gập protein (HSP 60, cathepsin D, RSP4, calreticulin) [6].
Nghiên cứu của Bai và cs sƣ
̉
du

̣
ng kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với khối phổ,
thƣ
̣
c hiê
̣
n trên mẫu mô tại vị trí khối u đại trực tràng và mẫu mô tại vị trí gần khối u trên
cùng một bệnh nhân. Mẫu mô đại trực tràng từ 12 bệnh nhân đã đƣợc sử dụng cho nghiên
cứu này. Kết quả điện di 2 chiều cho thấy có 60 protein biểu hiện khác biệt (hàm lƣợng
chênh lệch 1,5 lần) giữa mô ung thƣ và mô thƣờng. Tiếp tục tiến hành phân tích khối phổ
để nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt, 10 protein đã đƣợc nhận dạng, bao gồm 2
protein biểu hiện giảm và 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thƣ. 2 protein biểu hiện giảm
ở mô ung thƣ bao gồm carbonic anhydrase II và protein disulfide isomerase. 8 protein biểu
hiện tăng ở mô ung thƣ bao gồm APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor,
phosphoglycerate kinase 1, fumarate hydratase, aldolase A, activator protein 2B,
glutathione S-transferase A3, Arginase và zinc finger protein 64 homolog [8].


Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là 10 mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đƣợc lấy tại vị
trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5 – 10 cm).
Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh
viện K Tam Hiệp, Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội cung cấp.
Mẫu mô đƣợc đựng trong ống đựng mẫu, đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng để vận chuyển từ
bệnh viện về phòng thí nghiệm. Các mẫu mô sau đó đƣợc bảo quản trong tủ âm sâu (-
80C) cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo.
2.1.2. Hóa chất

Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc đề cập ở bảng 2.
Bảng 2. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu
STT
Tên hóa chất
Nhà cung cấp
1
Bio–Lyte 4-7 ampholyte, Bio–Lyte 3-10 ampholyte
GE Health Care, Mỹ
2
Các peptide chuẩn Insuline B (Mw = 3494,65 Da),
Angiotensine II (Mw = 1046,5423 Da)
Sigma – Aldrich, Mỹ
3
Chất nền CHCA (α–Cyano–4- hydroxycinnamic acid)
Sigma – Aldrich, Mỹ

4
Enzyme trypsin
Sigma – Aldrich, Mỹ
5
CHAPS, DTT, IAA, Tris – base
Biorad, Mỹ
6
Agarose low melting, Glycine, Urea
Sigma, Mỹ
7
SDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide
Pharmacia - Mỹ
8
Acetone, Acetonitrile, Methanol

Merk, Đức
Tất cả các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ sạch phân tích.
2.1.3. Thiết bị
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các thiết bị, dụng cụ trong Phòng thí
nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Enzyme và Protein.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng
Mẫu mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đƣợc lấy ra từ tủ -80
o
C, rã đông.
Cân 2 mẫu mô với lƣợng tƣơng đƣơng (khoảng 0,1g) cho vào hai cối sứ riêng biệt để trên
đá. Quy trình xử lý mẫu mô đại trực tràng đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Bước 1. Thu các phân đoạn dịch chiết protein
 Mẫu mô đƣợc cắt nát bằng kéo cho đến khi mẫu nát nhỏ. Bổ sung 100 µl đệm muối
phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4. Chuyển toàn bộ mẫu mô đã cắt và dịch đệm vào ống
eppendorft để trong 30 phút, ở 4
o
C. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C
để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 1.
 Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 1 đƣợc bổ sung 200µl đệm PBS 0,05M, pH 7,4 để ở
4
o
C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C để thu dịch nổi
là phân đoạn PBS 2.
 Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 2 đƣợc hòa tan bằng 100 µl đệm lysis (Urea 7M, Tris

30mM, CHAPS 4% và DTT 65mM), để ở 4
o
C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000
vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 1.
 Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 3 đƣợc hòa tan bằng 100 µl đệm lysis, để ở 4
o
C trong
30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C để thu dịch nổi là phân
đoạn lysis 2.
 Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 4 đƣợc hòa tan bằng 200 µl đệm lysis, để ở 4
o
C trong
60 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C để thu dịch nổi là phân
đoạn lysis 3.
Bước 2. Loại mỡ trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được
Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu đƣợc (PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2 và
lysis 3) ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C và hút loại lớp mỡ phía trên. Bƣớc loại mỡ
đƣợc lặp lại ít nhất 2 lần để đảm bảo loại mỡ tối đa.
Bước 3. Loại cặn tế bào, ADN, ARN trong các phân đoạn dịch chiết protein thu
được
Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu đƣợc sau quá trình loại mỡ ở tốc độ
60.000g trong 30 phút ở 4

o
C, thu dịch nổi phía trên, loại bỏ cặn. Bƣớc này đƣợc lặp lại 2
lần để đảm bảo loại cặn tối đa.
Bước 4. Kiểm tra thành phần protein có trong các phân đoạn chiết và độ sạch
của mẫu

Dịch chiết protein thu đƣợc từ các phân đoạn sẽ đƣợc điện di trên gel
polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành phần protein có trong mẫu và độ sạch của
mẫu. Các mẫu chƣa đạt độ sạch sẽ đƣợc tủa bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích
mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100%. Các dịch chiết của cùng một mẫu đƣợc trộn lại
để chuẩn bị cho điện di hai chiều.
2.2.2. Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford
Để đảm bảo hàm lƣợng protein tổng số giữa các mẫu nghiên cứu là tƣơng đƣơng
nhau, trƣớc khi điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành định lƣợng protein trong mẫu dịch
chiết protein từ mô ung thƣ và mô bình thƣờng bằng phƣơng pháp Bradford. Sau khi đã
xác định hàm lƣợng protein có trong mẫu, chúng tôi tiến hành tính toán sao cho hàm lƣợng
protein có trong dung dịch sử dụng cho điện di hai chiều của mẫu bệnh và mẫu đối chứng
là tƣơng đƣơng nhau.
2.2.3. Điện di hai chiều
Quá trình này đƣợc bắt đầu bằng việc làm trƣơng thanh strip có gradient pH cố
định bằng đệm trƣơng gel có chứa protein. Sau 1,5 giờ dung dịch sẽ ngấm vào thanh strip.
Lƣợng protein tối đa mà sợi gel IPG strip pH 3 - 10 dài 17cm có thể thấm đƣợc là 400µg.
Điện di đẳng điện đƣợc thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell hoặc Ettan
IPGphor3 để tập trung các phân tử protein vào vị trí tƣơng ứng với pI của phân tử đó trên
thanh IPG strip. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 bƣớc đƣợc trình bày trong
bảng 3.
Bảng 3. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm
Bƣớc
Hiệu điện thế V
Thời gian (t)

V.t (V - giờ)
Chế độ tăng U
Bƣớc 1
50
12 giờ
…
Trƣơng gel
Bƣớc 2
125
2 giờ
…
Tuyến tính
Bƣớc 3
250
15 phút
…
Nhanh
Bƣớc 4
10.000
2 giờ
…
Chậm
Bƣớc 5
10.000
…
40.000 Vh
Nhanh
Tổng

≈ 20 giờ

≈ 60.000

Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh strip đƣợc ngâm trong đệm cân bằng I (Tris
HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; DTT 0,1%) ở nhiệt độ phòng và
đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; IAA 0,25%)
thực hiện trong bóng tối cũng ở nhiệt độ phòng. Mỗi bƣớc cân bằng đƣợc thực hiện 3 lần,
thời gian mỗi lần theo thứ tự là: 5 phút, 10 phút, 10 phút.
Điện di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Kết thúc
điện di chiều hai, các protein đƣợc cố định 45 phút trong dung dịch chứa axít phosphoric
1,3%, methanol 20%, sau đó nhuộm bằng dung dịch Coomassie G250 qua đêm theo
phƣơng pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988). Phƣơng pháp
nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein [43].
2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều
Đầu tiên bản gel điện di hai chiều đƣợc quét vào máy tính có phần mềm phân tích
chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản). Bƣớc đầu phân tích hình ảnh bản gel điện di
hai chiều, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và đánh số thứ

tự cho các spot. Tiếp đó, phần mềm Phoretix sẽ xác định vị trí, thể tích của từng spot và giá
trị cƣờng độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel từ đó giúp chỉ ra các spot tƣơng ứng
trên từng bản gel và các spot có biểu hiện khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel
mẫu đối chứng.
2.2.5. Cắt và thủy phân spot
Các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai chiều đƣợc cắt ra khỏi
bản gel. Trƣớc tiên cần phải loại bỏ chất màu Coomassie từ các spot protein. Protein trong
các spot đƣợc thủy phân thành các peptide để chuẩn bị cho phân tích khối phổ. Loại
enzyme đƣợc sử dụng để thủy phân protein là trypsin. Khi đó, phân tử protein đƣợc cắt
thành các mảnh peptide có kích thƣớc từ 6 – 20 acid amin, thích hợp cho phân tích khối
phổ về sau [1].
2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein
Tiến hành phân tích khối phổ MALDI – TOF MS để xác định khối lƣợng của tập

hợp các peptide thu đƣợc sau quá trình thủy phân các spot protein bằng enzyme trypsin.
Mẫu peptide đƣợc phân tích đồng thời với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide
Angiotensin II (Mw 1046,54 Da) và Insulin B (Mw 3494,65 Da). Hỗn hợp peptide đƣợc
trộn với chất nền CHCA, để khô và đƣa vào máy phân tích khối phổ AXIMA – CRF
PLUS
.
Protein đƣợc nhận dạng bằng phƣơng pháp PMF (Peptide Mass Fingerprint).
Phƣơng pháp này nhận dạng protein bằng việc so sánh khối lƣợng của tập hợp các peptide
thu sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu có sẵn, sử dụng phần mềm Mascot.


Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Kết quả tách chiết đƣợc kiểm tra bằng điện di SDS - PAGE (hình 4).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Hình 4. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng bình
thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng trên cùng bản gel polyacrylamide 10% có SDS
Giếng 1, 2, 3, 4, 5: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis
2, lysis 3 thu được từ mô đại trực tràng bình thường.
Giếng 6, 7, 8, 9, 10: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1,
lysis 2, lysis 3 thu được từ mô ung thư đại trực tràng.
Hình 4 cho thấy kết quả điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết thô protein từ
mẫu mô đại trực tràng. Nhìn vào kết quả điện di chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất

hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dƣới chứng tỏ đã tách chiết thành công
protein từ mô đại trực tràng và thành phần protein thu đƣợc trong mẫu là đa dạng và phong
phú. Trong các mẫu, phân đoạn PBS 2, lysis 2 và lysis 3 (giếng số 2, 4, 5 và 7, 9, 10) có
các băng vạch rõ nét và không có hoặc ít có vệt kéo dài từ trên xuống dƣới. Điều này

chứng tỏ các phân đoạn này là tƣơng đối sạch, ít bị lẫn các thành phần phi protein. Bên
cạnh đó, các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 (giếng số 1, 3 và 6, 8) của các mẫu có các băng
protein hiện lên chƣa rõ ràng và xuất hiện hiện tƣợng kéo vệt dọc theo chiều dài giếng.
Điều này chứng tỏ các phân đoạn này có thể lẫn các thành phần phi protein trong mẫu. Do
đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu của các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 bằng dung dịch
acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100% ở -20
o
C. Protein
sau khi tủa đƣợc hòa tan lại bằng chính đệm lysis và đƣợc điện đi kiểm tra trên gel
polyacrylamide 10% có SDS. Kết quả điện di kiểm tra mẫu tủa đƣợc cho trong hình 5.
1 2 3 4

Hình 5. Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1 từ
mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng trên bản gel
polyacrylamide 10% có SDS
Giếng 1, 2,: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu
được từ mô đại trực tràng bình thường.
Giếng 3, 4: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu
được từ mô ung thư đại trực tràng.
Kết quả điện di kiểm tra cho thấy các mẫu dịch chiết phân đoạn PBS 1 và lysis 1
sau khi tủa bằng acetone đã xuất hiện những băng vạch rõ nét, không còn các vệt dọc kéo
dài trên bản gel. Điều này chứng tỏ mẫu sau khi tủa đã loại đƣợc đáng kể các thành phần
phi protein trong mẫu dịch chiết thô ban đầu. Mẫu sau khi tủa có thể sử dụng cho các phân
tích tiếp theo.
Các phân đoạn khác nhau của mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đƣợc
trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein đầy đủ của mô đại trực tràng dùng để tiến
hành bƣớc thí nghiệm tiếp theo.
3.2. PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN
DI HAI CHIỀU
Protein trong dịch chiết mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ của bệnh nhân

ung thƣ đại trực tràng đƣợc phân tách thành các spot protein riêng rẽ bằng kỹ thuật điện di
hai chiều. Chiều thứ nhất là điện di đẳng điện trên thanh IPGstrip, pH 3-10, dài 17cm. Điện
di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS.

Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu đƣợc phân tách thành các spot riêng rẽ
hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến sau phiên mã hay
biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lƣợng phân tử tƣơng tự nhau và điểm
đẳng điện gần nhau (hình 6).
3 10

3 10

A - Mô đại trực tràng bình thƣờng
B - Mô ung thƣ đại trực tràng
Hình 6. Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên bản gel
điện di hai chiều
Chiều 1: Điện di đẳng điện trên thanh IPG strip pH 3-10 dài 17cm;
Chiều 2: Điện di SDS - PAGE trên gel polyacrylamide 10%
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tách đƣợc các protein mô đại trực tràng
bình thƣờng và mô ung thƣ của 5 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng trên bản gel điện di hai
chiều, sử dụng thanh strip dài 17 cm, pH 3-10.
3.3. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
Sử dụng phần mềm phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều Phoretix, bƣớc đầu
chúng tôi đã xác định đƣợc tổng số spot protein đƣợc phân tách trên mỗi bản gel điện di hai
chiều (bảng 4).
Bảng 4. Số lƣợng spot protein phân tách trên bản gel điện di hai chiều
TT
Mã bệnh nhân
Số lƣợng spot
Mô bình thƣờng

Mô ung thƣ
1
11781
188 spot
239 spot
2
10608
139 spot
86 spot
3
10483
106 spot
162 spot
4
10597
130 spot
130 spot
5
11812
120 spot
166 spot
Phần mềm Phoretix còn đƣa ra hình ảnh ba chiều (3-D) của các spot protein, trong đó
độ lớn của spot đƣợc thể hiện bằng bề rộng đáy spot trên hình ảnh 3-D. Đây là cơ sở để so
sánh sự biểu hiện khác biệt của các spot protein tƣơng ứng giữa các cặp bản gel điện di mẫu
protein mô đại trực tràng.



A - Mô bình thƣờng
B - Mô ung thƣ

Hình 7. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thƣ so với mô bình
thƣờng
Tiến hành phân tích độc lập từng cặp bản gel điện di hai chiều, chúng tôi đã xác
định đƣợc các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ so với mô đại trực tràng
bình thƣờng trên từng cặp bản gel. Hình 8 minh họa kết quả so sánh biểu hiện protein khác
biệt trên cặp bản gel điện di hai chiều mẫu mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781.


A - Mô đại trực tràng bình thƣờng
B - Mô ung thƣ đại trực tràng
Hình 8. Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều mẫu
mô đại trực tràng bình thƣờng so với mẫu mô ung thƣ của
bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng mã 11781
↑
O

: Biểu hiện tăng ở mô ung thƣ
+
O
: Chỉ có ở mô ung thƣ
↓
O
: Biểu hiện giảm ở mô ung thƣ
-
O
: Chỉ có ở mô bình thƣờng
Chúng tôi đã tiến hành thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel
điện di hai chiều của cả 5 bệnh nhân. Kết quả đƣợc đƣa ra trong bảng 5.

Bảng 5. Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel

điện di hai chiều của 5 bệnh nhân
Biểu hiện
Mã bệnh nhân
11781
10608
10483
10597
11812
Tăng ở mô ung thƣ (↑)
17
6
10
12
15
Giảm ở mô ung thƣ (↓)
5
22
1
9
19
Chỉ xuất hiện ở mô ung thƣ (+)
11
0
0
1
5

Chỉ xuất hiện ở mô thƣờng (-)
0
8

0
14
1
Tổng số khác biệt
33
36
11
36
40
Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thƣ đại trực
tràng so với bản gel mô đại trực tràng bình thƣờng của các bệnh nhân, chúng tôi nhận thấy
có 43 spot biểu hiện khác chung bao gồm 16 spot biểu hiện tăng, 17 spot biểu hiện giảm và
10 spot không xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ đại trực tràng.
3.4. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS
Bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS chúng tôi đã xác định đƣợc các peptide trong mẫu
thủy phân protein và biểu thị bằng các đỉnh trên đồ thị. Với mỗi đỉnh trên đồ thị, trục
hoành biểu diễn khối lƣợng của peptide (đơn vị dalton) và trục tung biểu thị độ lớn của tín
hiệu tƣơng ứng peptide đó khi phân tích khối phổ (đơn vị mV) (hình 9).

Hình 9. Phân tích khối phổ các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân protein T17B33
bằng enzyme trypsin
Sau khi phân tích khối phổ protein đƣợc nhận dạng theo phƣơng pháp PMF. Khối
lƣợng của các peptide đƣợc tạo ra sau khi thủy phân đƣợc so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI,
sử dụng phần mềm Mascot thông qua website w.w.w. matrixscience.com.
Các spot biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ đại trực tràng và mô bình thƣờng trên
tất cả các bản gel 2-DE dài 17cm của 5 bệnh nhân đƣợc tiến hành phân tích khối phổ. Khi
so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng phần mềm Mascot đã nhận dạng đƣợc 41 protein
trong đó 29 protein đã đƣợc định danh và 12 protein giả thuyết (bảng 6).

Bảng 6. Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI TOF-MS từ bản gel mô ung thƣ so sánh với bản gel
mô đại trực tràng bình thƣờng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng
STT
Spot
Ký hiệu trong
NCBI
Tên protein
KLPT
(Da)
Pi
Điểm theo
hệ thống
MASCOT
Tỷ lệ
% phù
hợp
Biểu
hiện
1.
T17B5
Q8NBP6
Hypothetical protein NT2RP2000636
84.002
9,10
68
9
↑
2.
T17B25
gi|29292410

Immunoglobulin heavy chain
10.137
5,25
64
12
↑
T17B135
3.
T17B28
gi|119612397
TAF2 RNA polymerase II, TATA box
binding protein (TBP)-associated factor,
150kDa, isoform CRA_a
119.143
8,17
68
14
↑
T17B33
4.
T17B31
gi|55769537
Zinc finger protein 658
125.674
8,63
70
10
↑
5.
T17B38

Q15374
GARS protein
46.585
6,34
69
17
↑
6.
T17B108
gi|340764274
Immunoglobulin heavy chain variable
region
14.793
8,56
86
39
↑
7.
T17B162
YD49_HUMAN
Hypothetical zinc finger protein KIAA1349
88.217
9,29
63
10
↑
8.
T17T100
Q9NXL8
Hypothetical protein ELJ20171

40.482
8,11
65
20
↓
9.
T17T116
CAD83811
Sequence 1 from patent WO02063009
24.950
8,52
65
20
↓
10.
T17T120
GO1496
Transcription factor IIIA (Fragment)
39.762
9,33
69
32
↓
11.
T17T139
Q96M66
Hypothetical protein FLJ32790
20.953
9,60
64

27
↓
12.
T17T178
S53351
Malate dehydrogenase (oxaloacetate –
decarboxylating) (NADP) (EC 1.1.1.40)
precursor, mitochondrial
67.639
7,92
65
13
↓
13.
TTB87A
K2C1_HUMAN
Keratin, type II cytoskeletal 1 (Cytokeratin
1) (K1) (CK 1) (67 kDa cytokeratin)
66.170
8,16
65
19
↑
14.
TTB87B
ATHUC
Actin, cardiac muscle
42.334
5,23
83

38
↑
15.
TTB87C
Q16846
Tyrosine hydroxylase (EC 1.14.16.2)
(FRAGMENT)
11.503
6,37
67
37
↑
16.
TTB116
gi|85396888
Protein tyrosine phosphatase, receptor type, S
169.480
6,16
83
13
↑
17.
TTB119
CAB58611
Sequence 1 from patent WO9318147
22.885
6,22
64
24
↑

18.
TTT84
G01523
Heat shock protein 27 – human
27.094
8,24
67
26
↓


STT
Spot
Ký hiệu trong
NCBI
Tên protein
KLPT
(Da)
Pi
Điểm theo
hệ thống
MASCOT
Tỷ lệ
% phù
hợp
Biểu
hiện
19.
TTT97
Q86YT1

Acyl-coenzyme A synthetase ACSM2B,
mitochondrial
64.760
8,36
71
14
↓
20.
CB29
gi|51127397
Mutated CMP-sialic acid transporter A1
12.088
8,90
73
38
↑
21.
CB51
gi|4502517
Carbonic anhydrase 1
28.909
6,59
84
25
↑
22.
CT16
Q9H019
Hypothetical protein
32.407

5,62
77
29
↓
23.
CT22
S55041
Proteasome endopeptidase complex (EC
3.4.25.1) beta chain C10-II-human
23.201
6,14
65
22
↓
24.
CT27
B38431
Myc- binding factor Max, short form
17.191
6,07
63
26
↓
25.
CT38
Q8NHR9
Similar to data source: SPTR, source key:
P39825, evidence: ISS putative related to
PROFILIN
14.481

8,76
65
34
↓
26.
CT40
AAA76850
Creatine kinase (EC 2.7.3.2) chain B
42.786
5,27
71
18
↓
27.
CT41
gi|194376310
Unnamed protein product
38.950
5,19
67
29
↓
28.
CT59
Q29856
MHC class I (fragment)
21.381
6,24
67
32

↓
29.
CT67
gi|4501889
Actin, gamma-enteric smooth muscle
isoform 1 precursor
42.249
5,31
82
29
↓
30.
CT74
gi|82408340

Chain A, Crystal Structure Of Diras2 In
Complex With Gdp And Inorganic
Phosphate
19.588
6,81
80
21
-
31.
CT79
gi|154959417
Suppressor of tumorigenicity 20 protein
9.189
8,52
68

60
-
32.
CT82
AAH33813
BCO33813 NID
29.310
5,23
72
19
-
33.
CT86
gi|4099605
Translational activator GCN1, partial
109.122
5,91
70
12
-
34.
CT94
Q8IZJ2
Plexin D1
196.552
6,55
77
10
↓
35.

CT96
gi|28175105
ZFYVE26 protein, partial
55.592
8,90
81
25
-
36.
CT104
gi|40807213
FAM179B protein
88.718
8,94
67
15
-
37.
CT113
gi|25140644
Tyrosine hydroxylase isoform 1
14.144
9,52
70
27
-
38.
CT120
gi|7447027
Glutamate/aspartate transporter II

61.745
6,20
88
26
↓
39.
CT123
gi|40786418
Profilin – 4
14.481
8,76
68
31
↓


STT
Spot
Ký hiệu trong
NCBI
Tên protein
KLPT
(Da)
Pi
Điểm theo
hệ thống
MASCOT
Tỷ lệ
% phù
hợp

Biểu
hiện
40.
CT127
gi|25901054
SE2-5LT1 protein
89.926
6,31
81
11
-
41.
CT134
gi|4139750

Chain A, Crystal Structure Of The Nfkb
P50P65 HETERODIMER COMPLEXED
To The Immunoglobulin Kb Dna
31.377
7,76
70
26
-




3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhận dạng đƣợc 41 spot protein tƣơng ứng với 29
protein đã đƣợc định danh và 12 protein giả thiết. Căn cứ vào chức năng của protein cũng

nhƣ các quá trình sinh học mà các protein tham gia, chúng tôi chia các protein có biểu hiện
khác biệt giữa mô ung thƣ và mô đại trực tràng bình thƣờng thành 5 nhóm khác nhau.
3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis
Chúng tôi xác định đƣợc 4 protein liên quan đến các quá trình này. Trong số đó,
chúng tôi đặc biệt quan tâm tới protein Suppressor of tumorigenicity 20.
Suppressor of tumorigenicity 20 protein (ST20 hay HCCS) thuộc nhóm protein ức chế
khối u. Suppressor of tumorigenicity 20 protein có vai trò phân bố cytochrome c từ ty thể đi
vào tế bào chất, từ đó tăng cƣờng hoạt hóa caspase 9 và caspase 3, thúc đẩy sự chết của tế
bào. Suppressor of tumorigenicity 20 protein thƣờng có mặt trong các tế bào bình thƣờng
nhƣng lại vắng mặt ở các tế bào ung thƣ [19]. Việc thiếu hụt loại protein này chính là nguyên
nhân làm giảm quá trình apoptosis và tế bào thoát khỏi sự chết theo chƣơng trình. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi thấy sự vắng mặt của protein suppressor of tumorigenicity 20 trong
dịch chiết protein từ mô ung thƣ đại trực tràng. Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên
cứu về vai trò của loại protein này trƣớc đó. Nhƣ vậy, sự thiếu hụt protein Suppressor of
tumorigenicity 20 sẽ tạo điều kiện cho các tế bào thoát khỏi sự chết theo chƣơng trình, tiếp
tục phân chia mạnh mẽ và hình thành ung thƣ đại trực tràng.
3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận dạng đƣợc 6 protein tham gia vào quá trình
miễn dịch và bảo vệ cơ thể. Các protein này là thành phần của hệ thống miễn dịch nhƣ chuỗi
nặng của phân tử Ig và vùng biến đổi của nó, phân tử MHC lớp I. Bên cạnh đó, có sự khác
biệt của một số protein tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể, chống lại các gốc tự do, stress
nhƣ protein sốc nhiệt (HSP 27), GARS protein và yếu tố Nfkb.
3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào
Trong số các protein đƣợc nhận dạng, chỉ có 4 protein liên quan đến chức năng cấu
trúc tế bào có biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ và mô đại trực tràng bình thƣờng, đó là
actin và cytokeratin-1 có biểu hiện tăng ở mô ung thƣ, profilin-4 có biểu hiện giảm ở mô ung
thƣ.
Cytokeratin-1 là nhóm cytokeratin (CK) axit. Nhóm này gồm có các cytokeratin sau:
CK10, CK12, CK 13, CK14, CK16, CK17, CK18, CK19 và CK20. Cytokeratin-1 tham gia
vào con đƣờng lectin, phản ứng lại với các stress tế bào, tổng hợp các sợi cơ, điều hòa quá

trình hình thành mạch [56]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên hệ giữa việc thay đổi mức độ
biểu hiện của Cytokeratin-1 với sự phát sinh ung thƣ. Cytokeratin-1 có thể ảnh hƣởng đến
quá trình phát sinh ung thƣ thông qua một vài đƣờng truyền tín hiệu nhƣ PI3K/Akt, Wnt và
đƣờng truyền tín hiệu ERK MAPK. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy lƣợng
cytokeratin-1 tăng lên ở mô ung thƣ đại trực tràng so với mô bình thƣờng. Kết quả này hoàn
toàn phù hợp với các kết quả nghiên cứu trên thế giới. Nghiên cứu của Kim và cộng sự cũng
cho thấy sự biểu hiện tăng lên của cytokeratin 17 ở ung thƣ đại trực tràng.
3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất
Các protein tham gia quá trình trao đổi chất chiếm số lƣợng nhiều nhất trong số các
protein đƣợc nhận dạng, trong đó, nổi bật là protein creatine kinase. Creatine kinase là một
enzyme đƣợc biểu hiện ở rất nhiều loại tế bào và mô khác nhau. Protein này biểu hiện giảm ở
mô ung thƣ đại trực tràng so với mô bình thƣờng theo nghiên cứu này. Chức năng của
creatine kinase là xúc tác thuận nghịch quá trình chuyển đổi gốc phosphate giữa ATP và
nhiều hợp chất phosphogen nhƣ creatine phosphate. Theo một nghiên cứu của
Balasubramami và cộng sự, creatine kinase B có liên quan đến ung thƣ đại trực tràng. Trong
nghiên cứu của họ, protein creatine kinase B biểu hiện giảm ở mô ung thƣ đại trực tràng [9].


Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả của nhóm nghiên cứu này về mối liên quan
giữa creatine kinase B với ung thƣ đại trực tràng và mức độ biểu hiện của protein này.
3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến sau phiên mã,
dịch mã
Đối với các protein thuộc nhóm tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến
sau phiên mã, dịch mã, chúng tôi xác định đƣợc 5 protein có biểu hiện khác biệt giữa mô ung
thƣ và mô đại trực tràng bình thƣờng. Các protein này bao gồm: TAF2 RNA polymerase II,
Zinc finger protein 658, Transcription factor IIIA, Myc- binding factor Max và Translational
activator GCN1.


KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Bằng kỹ thuật điện di hai chiều đã phân tách đƣợc các protein trong mô ung thƣ đại
trực tràng và mô đại trực tràng bình thƣờng của các bệnh nhân thành các spot riêng rẽ trên
các bản gel điện di hai chiều.
2. Đã xác định đƣợc các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ đại trực
tràng và mô đại trực tràng bình thƣờng của từng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Trong đó
có 43 spot khác biệt chung ở các bệnh nhân gồm: 16 spot biểu hiện tăng, 17 spot biểu hiện
giảm và 10 spot không xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ.
4. Sử dụng kỹ thuật phân tích MALDI - TOF MS đã xác định đƣợc 41 spot tƣơng ứng
với 29 protein đã đƣợc định danh và 12 protein giả thuyết. Các protein đã đƣợc nhận dạng
đƣợc chia thành 5 nhóm chức năng bao gồm: nhóm protein liên quan đến chu trình tế bào và
apoptosis; protein liên quan đến quá trình miễn dịch, bảo vệ cơ thể; protein tham gia cấu trúc
tế bào; protein tham gia trong các quá trình trao đổi chất; protein tham gia vào quá trình phiên
mã, dịch mã và cải biến sau phiên mã, dịch mã. Trong đó, một số protein có biểu hiện khác
biệt đặc trƣng giữa mô ung thƣ đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thƣờng nhƣ Zinc
finger protein 658, cytokeratin-1 biểu hiện tăng ở mô ung thƣ; các protein MHC class I
antigen, HSP27, Creatine kinase chain B, profilin-4 biểu hiện giảm rõ rệt ở mô ung thƣ và
Suppressor of tumorigenicity 20 protein chỉ xuất hiện ở mô đại trực tràng bình thƣờng mà
không xuất hiện trong mô ung thƣ.

KIẾN NGHỊ
Từ quá trình nghiên cứu thực tế, chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục nhận dạng các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ đại trực
tràng so với mô đại trực tràng bình thƣờng trên số lƣợng bệnh nhân lớn hơn nhằm tìm ra các
protein đặc trƣng cho ung thƣ đại trực tràng.
2. Tiếp tục thu thập mẫu và phân tích proteomics mô đại trực tràng của bệnh nhân ung
thƣ đại trực tràng ở các giai đoạn ung thƣ khác nhau nhằm phân tích sự biến đổi thành phần
các protein liên quan đến bệnh.

References
Tiếng Việt
1. Phan Văn Chi (2006), Proteomics – Khoa học về hệ protein, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, Hà Nội.
2. Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học cơ sở, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
3. Huỳnh Quyết Thắng (2009), ”Điều trị ung thƣ đại trực tràng gia đoạn II-III tại Bệnh viện Ung
bƣớu Cần Thơ”, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 13(1), pp. 177 – 186.



Tiếng Anh
4. Albrethsen J., Bøgebo R., Gammeltoft S., Olsen J., Winther B., Raskov H. (2005),
“Upregulated expression of human neutrophil peptides 1, 2 and 3 (HNP 1-3) in
colon cancer serum and tumours: a biomarker study”, BMC Cancer, 5(1).
5. Albrethsen J., Moller C. H., Olsen J., Raskov H., Gammeltoft S. (2006), “Human
neutrophil peptides 1, 2 and 3 are biochemical markers for metastatic colorectal
cancer”, Eur J Cancer, 42(17), pp. 3057 – 64.
6. Alfonso P., Núñez A., Lombardia L., and Sánchez L. (2005), “Proteomic expression
analysis of colorectal cancer by two-dimensional differential gel electrophoresis”,
PROTEOMICS, 5(10), pp. 2602-2611.
7. Allal A.S., Kähne T., Reverdin A. K., Lippert H., Schlegel W., Reymond M. A. (2004),
“Radioresistance-related proteins in rectal cancer”, PROTEOMICS, 4(8), pp. 2261-
2269.
8. Bai X., Li S. Y., Yu B., An P., Cai H. Y., Du J. F. (2010), “Proteome analysis of human
colorectal cancer tissue using 2-D DIGE and tandem mass spectrometry for
identification of disease-related proteins”, African Journal of Biotechnology, (41),
pp. 6840-6847.
9. Balasubramani M., Day B. W., Schoen R. E., Getzenberg R. H. (2006), “Altered
expression and localization of creatine kinase B, heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein F, and high mobility group box 1 protein in the nuclear matrix
associated with colon cancer”, Cancer Res.
10. Cancer Research UK (2012), Treating Bowel Cancer - A Quick Guide.
11. Ciocca D. R., Calderwood S. K. (2005), “Heat shock proteins in cancer: diagnostic,
prognostic, predictive, and treatment implications”, Cell Stress Chaperones, 10(2),
pp. 86–103.
12. Dukes C. E. (1932), “The classification of cancer of the rectum”, Journal of Pathological
Bacteriology, 35(3), pp. 323-332.
13. Fedirko V., Tramacere I., Bagnardi V., Rota M., Scotti L., Islami F., Negri E., Straif
K., Romieu I., La V. C., Boffetta P, Jenab M. (2011), "Alcohol drinking and
colorectal cancer risk: an overall and dose-response meta-analysis of published
studies", Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical
Oncology / ESMO, 22(9), pp. 1958–1972.
14. Gasparini G., Hayes D. F. (2006), “Biomarkers in Breast Cancer, Molecular
Diagnostics for Predicting and Monitoring Therapeutic Effect”, Humana Press,
pp.18–20.
15. Goldstein M. J., Mitchell E. P. (2005), “Carcinoembryonic antigen in the staging and
follow-up of patients with colorectal cancer”, Cancer Invest; 23(4), pp. 338-51.
16. International Agency for Research on Cancer (2011), Cancer Worldwide, Cancer
Research UK.
17. Jing Y., Zhang J., Waxman S., Mira-y-Lopez R. (1996), “Upregulation of cytokeratins 8
and 18 in human breast cancer T47D cells is retinoid-specific and retinoic acid
receptor-dependent”, Differentiation, 60(2),pp. 109-117.
18. Kim C. Y., Jung W. Y., Lee H. J., Kim H. K., Kim A., Shin B. K. (2012), “Proteomic
analysis reveals overexpression of moesin and cytokeratin 17 proteins in colorectal
carcinoma”, Oncol Rep., 27(3), pp. 608-620.
19. Kim T. E., Kim Y. W., Hwang S. Y., Shin S. M., Shin J. W., Lee Y. H., Shin S. Y., Han
K. T., Lee J. M., Namkoong S. E., Kim J. W. (2002), “Candidate tumor suppressor,
HCCS-1 is downregulated in human cancers and induces apoptosis in cervical
cancer”, Int. J. Cancer, 97, pp.780–786.

20. Habermann J. K., Bader F. G., Franke C., Zimmermann K., Gemoll T., Fritzsche B., Ried
T., Auer G., Bruch H. P., Roblick U. J. (2008), “From the genome to the proteome -
biomarkers in colorectal cancer”, Langenbeck's Archives of Surgery, 393(1), pp. 93-
104.
21. Labianca R., Beretta G. D., Kildani B., Milesi L., Merlin F., Mosconi S., Pessi M. A.,
Prochilo T., Quadri A., Gatta G., Braud de F., Wils J. (2010), “Colon cancer”,
Critical Reviews in Oncology/Hematology, 74(2010), 106–133.
22. Lee I. M., Shiroma E. J., Lobelo F., Puska P., Blair S. N., Katzmarzyk P. T. (2012),
“Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an
analysis of burden of disease and life expectancy”, Lancet.
23. Li C., Tan Y. X., Zhou H., Ding S. J., Li S. J., Ma D. J., Man X. B., Hong Y., Zhang
L., Li L., Xia Q. C., Wu J. R., Wang H. Y., Zeng R. (2005), “Proteomic analysis of
hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma: Identification of potential
tumor markers”, Proteomics, 5(4), pp. 1125-1139.
24. Liebler D. C. (2002), Introduction to Proteomics, Humana Press, Totowa, NJ, USA.
25. Lucas S. D., Ek B., Rask L., Rastad J., Akerström G., Juhlin C. (1997), “Aberrantly
expressed cytokeratin 1, a tumor-associated autoantigen in papillary thyroid
carcinoma”, Int J Cancer., 73(2), pp. 171-177.
26. Marion M. B. (1976), “A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein – Dye Binding”, Analytical
Biochemistry, 72, pp. 248 – 254.
27. Maximilian L. W., Maike A. L., Markus R. (2012), “The central role of initiator caspase-
9 in apoptosis signal transduction and the regulation of its activation and activity on
the apoptosome”, Experimental Cell Research, 318(11), pp. 1213–1220.
28. National Commission of Digestive Disease (2008), “Cancers of the Digestive System”,
Nature, 445, pp. 111-115.
29. Newton K. F., Newman W., Hill J. (2010), “Review of biomarkers in colorectal cancer”,
Colorectal Disease, 14(1), pp. 3-17.

30. Parkin D. M., Bray F. I., Devesa S. S. (2001), “Cancer burden in the year 2000. The
global picture”, Eur J Cancer 2001, 37(8), pp. 4-66.
31. Peng Y., Li X., Wu M., Yang J., Liu M., Zhang W., Xiang B., Wang X., Li X., Li
G., Shen S. (2012), “New prognosis biomarkers identified by dynamic proteomic
analysis of colorectal cancer”, Mol. BioSyst., 8, pp. 3077-3088.
32. Polanski M., Anderson N.L. (2006), “A List of Candidate Cancer Biomarkers for
Targeted Proteomics”, Biomarker Insights, 2, pp. 1-48.
33. Radiya G. A., Helen M. B., Ruth M. A. (2012), “Zinc fingers of the cerebellum (Zic):
Transcription factors and co-factors”, The International Journal of Biochemistry &
Cell Biology, 44(11), pp. 2065–2068.
34. Research Advocacy Network (2010), Biomarkers in Cancer – An Introductory Guide for
Advocates.
35. Shi Y. L., Ping A., Hui-Yun C., Xue B., Ying-Nan Z., Bo Y., Fu-Yi Z., Gang C. (2010),
“Proteomic analysis of differentially expressed proteins involving in liver metastasis
of human colorectal carcinoma”, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 9, pp. 149-153.
36. Tan H. T., Wu W., Ng Y. Z., Zhang X., Yan B., Ong C. W., Tan S., Salto-Tellez
M., Hooi S. C., Chung M. C. (2012), “Proteomic analysis of colorectal cancer
metastasis: stathmin-1 revealed as a player in cancer cell migration and prognostic
marker”, J Proteome Res., 11(2), pp. 1433-1445.
37. Xue H., Lu B., Zhang J., Wu M., Huang Q., Wu Q., Sheng H., Wu D., Hu J., Lai M.
(2010), “Identification of serum biomarkers for colorectal cancer metastasis using a
differential secretome approach”, J Proteome Res. ;9(1), pp. 545-55.


38. Xuezhi B., Quingsong L., Tet W. F., Shashikant J., Tao Y., Han-Ming S., Choon N. O.,
Peh Y. C., Kong W. E, Choy-Leong H. (2006), “Proteomic Analysis of Colorectal
Cancer Reveals Alterations in Metabolic Pathways”, Molecular & Cellular
Proteomics, 5(6), pp. 1119 - 1130.
39. Yu J. K., Chen Y. D., Zheng S. (2004), “An integrated approach to the detection of
colorectal cancer utilizing proteomics and bioinformatics”, World J Gastroenterol,

10, pp. 3127-3131.
40. Ward D. G., Nyangoma S., Joy H., Hamilton E., Wei W., Tselepis C., Steven N.,
Wakelam M. J. O. , Johnson P. J. , Ismail T., Martin A. (2008), “Proteomic
profiling of urine for the detection of colon cancer”, Proteome Science, 2008, pp. 6-
19.
41. Watson A. J., Collins P. D. (2011), “Colon cancer: acivilixation disorder”, Digestive diseases,
29(2):, pp. 222-228.
42. Weng Y. R., Cui Y., Fang J. Y. (2012), “Biological functions of cytokeratin 18 in
cancer”, Mol Cancer Res., 10(4), pp. 485-493.
43. Westermeier R., Naven T. (2002), Proteomics in practice, Wiley-VCH Verlag-GmbH,
Freiburg.
44. Wittenmayer N., Jandrig B., Rothkegel M., Schlüter K., Arnold W., Haensch W.,
Scherneck S., Jockusch B. M. (2004), “Tumor Suppressor Activity of Profilin
Requires a Functional Actin Binding Site”, Mol Biol Cell., 15(4), pp. 1600-1608.
45. World Health Organisation (2008), Global Cancer Facts & Figures, 2rd Edition,
American Cancer Society Inc.

Công cụ World Wide Web
46. (6/12/2012).
47. (20/12/2012).
48. (20/12/2012).
49. (15/12/2012).
50.
(10/12/2012).
51. (12/12/2012).
52. (02/12/2012).
53. (10/12/2012).
54. />tr%E1%BB%B1c-trang-co-di-truy%E1%BB%81n/ (15/12/2012).
55. (20/12/2012).
56. (25/12/2012).

57. (25/05/2012).