Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam

Tách dòng và thit k vector biu hin gen mã
hóa cho th th neurokinin-1  i Vit Nam


Lê Hng Thu

i hc Khoa hc T nhiên
Luchuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30
ng dn: PGS. TS. Võ Th 
o v: 2012


Abstract: Tng quan v G protein; h tachykinin  ng vt có vú; th th h tachykinin
và th th neurokinin-1; ng dng ca th th neurokinin-u tr bnh; vector
biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1. Trình bày nguyên li
nghiên cu: Tách RNA tng s; phn c; phn ng PCR (Polymerase
Chain Reaction); Tinh sch DAN b n DNA
vào vector; k thut bin np; sàng lc khun l    t ct s dng
enzyme gii hn; ký thun di; phân tích trình t cDnA ca cDNA-t
qu và tho lun: Tách dòng gen mã hóa cho th th neurokinin-1 t phi; thit k
vector biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1.

Keywords: Sinh hc thc nghim; Gen mã hóa; i Vit Nam; Th th
neurokinin-1; Cu trúc protein


Content
M U
Th th neurokinin  1 thuc nhóm các th th xuyên màng liên kt vi G protein. Khi th th
 i cu t gc hiu SP s dn truyn cn t vùng thn kinh
ngoi vi v n kinh, gây ra trng thái lo âu và các triu chng ging trm cm, mt

u hòa các phn ng min dch ca
.
 nhng nghiên cu v cu trúc và cha th th neurokinin-c
ph gng tìm ra các chi vn vi th th neurokinin-1 nhm sn xut thuc gi
cho các bnh nhân b chu, thuc chng trm cm, thuc chng nôn cho các bnh
u v th th này  i Vit Nam còn rt
ít hoc công b. Chính vì vy, vi mn cDNA hoàn chnh
mã hóa cho th th này  i Vit Nam và biu hin chúng trên h thng t ng v có
th ch c ngun gen và các h thng sàng lc thuc t ngu c liu Vit Nam,
 tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam” c thc hin ti Phòng thí nghim Sinh Y, Khoa Sinh
hc; Phòng Genomic thuc Phòng thí nghim Tr m Công ngh Enzyme - Protein và
Phòng Sinh hc Phân t thuc Trung tâm nghiên cu Khoa hc s si hc Khoa
hc T i hc Quc Gia Hà Ni.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN
1.1.1. G protein
G protein lc phát hin và mô t bi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cu tác
ng ci vi t bào. Vi Nobel lý sinh  y
h
nh v  mt trong màng t c hot hóa nh th th liên kt vi G protein
(GPCRs) phân b trên b mt màng t bào.
1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein
H th th liên kt vi G protein là nhng phân t c nh (350-500 acid amine)
c phân thành các phân h khác nhau d ng v trình t acid amine,
ch t vi các cu tn ra 367 th th
liên kt vi G protein  c tìm thy vt chc

1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ
Tachykinin là mt trong nhng h neuropeptide ln nhc tìm th ca tt c

  ng v     c phân lp t  ng vt không
ng [15, 45].


                 

 


ha                

 
ptide

1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1
1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin
Th th ca h tachykinin (TACR) thuc lp A trong h th th liên kt vi G protein (Hình 1).
  th rhodopsin, TACR có cu trúc gc ni
vi nhau bi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh cht (exoloop và cytoloop). Nhng
vòng  phía ngoài màng t bào ca th th liên kt vi G protein có cha chn cu t
gc hiu trong khi các vùng xuyên màng có ch nh hot tính ca th th.
i ta phân loi TACR da vào s sai khác trong các trình t này [45].
1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH
T nhng hiu bit v cha th th neurokinin 1 ha h ng hiu
qu u tr mt s c
nhiên khi nhic phm ln tp trung nghiên cu v th th tachykinin nhm tìm ra các
chi vn c ng du tr bnh: làm thuc ging lo âu, trm
cm, cha các bng hô h phát hin ra các chi vn vi th th 
mt mt xích quan trng trong viu tr trong via chng bun nôn
và s nôn ma do tác dng ca hóa tr lin nay các nghiên cu v chi vn

vi th th tachykinin v c kt qu   i và gp rt nhi  
c s dng th th ng ca thuc vn là mt bài tóan hay và khó cho
nhiu nhà nghiên c các nghiên cu ch yu tp trung vào nhng phân t không có
bn cht peptide có kh m xuyên qua màng t bào tht này
ha hn s u tr bnh liên quan ti chng nghi
1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1
Gen mã hóa cho th th liên kt v c dung hp vào nhiu h vector và
nhiu dòng t  biu hin chúng trên c t  trên t
bào nhân thc. Tuy nhiên, do th th liên kt vc bii sau dch mã
bng cách gn thêm carbonhydrate hoc biu hin trên h thng t bào nhân
ng không cho kt qu n.
Theo các nghiên c     c biu hin trong vector pCDNA [24],
pMAM- các chng t bào HEK293, COS-7,
u cho kt qu kh quan. Mt nghiên cu ga Farahdiba và cng s
khi nghiên cu truyn tin ca th th -n hành dung hp gen mã hóa cho th th
này vi gen mã hóa cho NK1 và biu hin chúng trong hai h vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1
t qu t cho chúng tôi la chn và thit k vector biu hin pCDNA3
và pEGFP- tài.
pCDNA3 và pEGFP-N1 là vector biu hin  t ng vt vc trình bày
trong ph lc.

Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
Mu phi b c cung cp bi Vin Quân Y 103 (kí hiu H211 ly
ngày 25/1/2011).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu



cDNA
-NK1
-NK1
Tách -NK1
-NK1









Hình 5  nghiên cu tách dòng và thit k vector biu hin cDNA mã hóa cho
th th neurokinin  1  phi Vit Nam.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI

RNA tng s t mu phc tách chit bng kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit
c tng hp nh phn c s dng RNA tng s và
mi hexamer. Thành phu kin ca phn ng tng hc trình bày trong Bng
9.
Bảng 9: Thành phu kin phn ng tng hp cDNA ca gen neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện


13.0

0


1.5
dNTPs (10 mM)
2.5

5.0
- 
0
trong 10 phút
AMV RTase
3.0
- Kéo dài: 37
0
trong 90 phút
- 85
0
trong 5 phút
Tổng
25.0
Sn phc bo qun  4
o
 s dng cho các thí nghim tip theo.
--1
n cDNA mã hóa cho th th NK1 s -NK1 và
- c ni v to nên cDNA hoàn ch
Hình 6.

Hình 6:   khu-NK1 ca gen mã hóa cho neurokinin-1
 khu-NK1, chúng tôi s dc tng hp t phn ng phiên
 làm khuôn cho phn ng PCR vi cp mc hiu NK1 F/ NK1 R1. Thành phn
u kin ca phn c trình bày trong Bng 10.
Bảng 10: Thành phu kin phn ng PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa
cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.4
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 45 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:


2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R1 (2 µM)
0.5
Pfu polymerase
0.1
cDNA
1.0
Tổng
15.0

NK1 F

NK1 R

NK1 R1

NK1 F1

94 bp
76 bp


94 bp
Đoạn 5’–NK1 (788 bp)

CCCGG
G

76 bp
CCCGG
G
Đoạn 3’- NK1 (728 bp)
72
0
C, 10 phút
Sn phn di trên gel agarose. Kt qu n di cho mc
xp x -NK1.

Hình 7: n di sn phm PCR khu   -NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Gii chng âm không có cDNA; Gin phm PCR khui
-NK1; Ging M: thang chun SY-500.
Sn phc tinh sch bng High Pure PCR Product Purificati
chun b cho phn -NK1 ca cDNA.
3.1.3. --1
 i v-NK1, chúng tôi s dng cDNA làm khuôn cho phn ng
PCR vi cp mi NK1 F1/ NK1 R  khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Tuy nhiên, sn phm PCR gc hi
DNA vi (Hình 8).

Hình 8n di sn phm PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Gin phm PCR khu-NK1; Ging M: thang chun SY-500.
Lp li phn ng nhiu l u kin v n cDNA, nhi gn m
chúng tôi vn. Vì vy, chúng tôi quynh thc hin phn
c vi m tng hp li cDNA t RNA tng s. Thành phu
kin ca phn c thc hing 11, ch i mi hexamer

bng mc s dng làm khuôn cho phn ng PCR khui
-NK1 bng cp mc hiu NK1 F1/ NK1 R. Thành phu kin ca phn ng
c trình bày trong Bng 11.
Bảng 11: Thành phu kin phn ng PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa
cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.4
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 45 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

(MgCl
2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F1 (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Pfu polymerase
0.1
cDNA
1.0
Tổng
15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 9). Kt qu cho thy bên c
c hit hic lp vc
NK1. S dng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sch
-NK1.

Hình 9n di sn phm PCR dùng khuôn cDNA tng hp t mi oligo T khui
-NK1. Ging  n phm PCR khu-NK1, Ging M: thang chun SY-
100.
---1
ch, t--ng
phn ng ni s dng kit Gene JET
TM
PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phn ca phn ng
nc trình bày trong Bng 12.

Bảng 12: Thành phn phn ng n-NK1 (ho-NK1) ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1 vào vector pJET1.2
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
-NK1
(ho
8.0
Hn hp ni   16
0

m 2x
10.0
pJET 1.2 (50 ng/µl)
1.0
T4 ligase (5 u/ µl)
1.0
Tổng
20.0
ng hn hp nc bin np vào dòng t bào kh bin E.coli i m
ng thch cha  sàng lc các khun lc nhn plasmid tái t hp, chúng tôi chn
8 khun l kin chèn bng phn ng PCR vi cp mc hiu.
 ki-NK1, chúng tôi s dng trc tip khun lc làm khuôn cho phn ng
PCR vi cp mi NK1 F/NK1 R1. Thành phu kin phn c trình bày trong
Bng 13.
Bảng 13: Thành phu kin phn ng PCR sàng lc khun l-NK1
ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện

H
2
O
10.0
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R1 (2 µM)
0.5

Taq DNA polymerase (1 u/µl)
0.5
Khuôn
1.0
Tổng
15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 10). Kt qu cho thy 7 trong 8 khun
lu cho mc phù hp v-y, chúng 
NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1. Chúng tôi kí hiu by
khun lc này lt t -NK1--NK1-7.



788 bp
Hình 10: n di sn phm PCR sàng lc các khun lc vi cp mi NK1 F/ NK1 R1. Ging 1-8
lt là các khun l i chng âm không có khuôn; M: thang
chun SY-500.
 c các khun lNK1, chúng tôi chn 8 khun l kim
tra s có mt c-NK1 bng phn ng PCR vi cp mi NK1 F1/ NK1 R. Thành phn
u kin ca phn c trình bày trong Bng 14.
Bảng 14: Thành phu kin phn ng PCR sàng lc khun l-NK1
ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.0
- Thi gian biu tiên:

94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F1 (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1 u/µl)
0.5
DNA khuôn
1.0
Tổng

15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 11). Kt qu cho thy 5 trong 8 khun lc (s
u cho mc phù hp v-y, chúng
NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1. Chúng
tôi kí hin l-NK1--NK1-5.

728 bp
Hình 11: n di sn phm PCR sàng lc các khun l-NK1 bng cp mi
NK1 F1/ NK1 R. Ging 1-8 lt là các khun l i chng
âm không có khuôn; M: thang chun SY-500.
3-1
Quá trình tách dòng cDNA hoàn chnh mã hóa cho th th neurokinin- c trình bày trong
Hình 12.

Hình 12.  n cDNA hoàn chnh mã cho th th neurokinin-1.
u tiên chúng tôi chn khun l-NK1--NK1- tách chit các plasmid tái t hp
 - -c kí hi-NK1- -
NK1-6. S d-NK1-2 làm khuôn cho phn  khu-NK1 vi mi
NK1 R1 c hiu cho NK1 và mi pJET R ca vector pJET 1.2. Thành phu kin ca
phn c trình bày trong Bng 15.


Bảng 15: Thành phu kin phn ng PCR khu-NK1 trong vector tái t hp
-NK1-2 bng cp mi NK1 R1/ pJET R
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O

10.4
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 120 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 R1 (2 µM)
0.5
pJET R (2 µM)
0.5
Pfu polymerase (1 u/µl)

0.1
-NK1-2
1.0
Tổng
15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 13). Kt qu cho thch
-NK1 bng cp mi NK1 R1/pJET R.

Hình 13: n di sn phm PCR khu-NK1 bng cp mi pJET R/ NK1 R. Ging
1: sn phm PCR bng cp mi chng âm không có DNA khuôn;
M: thang chun SY-100.
Sn phc tinh sch bng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) c ct bi hai
enzyme XbaI/SmaI  chun b cho vic ghép ni v-NK1. Ti
tin hành ct vector tái t h-NK1-6 vi hai enzyme XbaI/ SmaI. Thành phn phn ng ct
c trình bày trong Bng 16.

Bảng 16: Thành phn cu kin cho phn ng ct vi hai enzyme XbaI/SmaI
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
42.0
 37
0
C trong 2 gi
m Tango 10x
6.0
-NK1-2 (hoc sn phm

n -NK1)
8.0
SmaI
2.0
XbaI
2.0
Các sn phm ct vn di kim tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14A).
Kt qu cho thy phn ng cc thc hic cc
c 700 bp c-
c 3341 bp g-Nc tinh sch bng kit ca QIAquick Gel
Extraction (QIAGEN) rn di kim tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14B). Kt qu cho
thm bo cho phn ng ni tip theo.

99
7
Hình 14 n di sn phm c c và sau khi tinh sch bng kit QIAquick Gel Extraction
(QIAGEN). A: sn phm cc khi tinh sch; B: sn phm ct sau khi tinh sch; 1: sn phm
PCR ch-NK1 sau khi ct; 2: sn ph -NK1-6 ct; M: thang chun-100;
M1: thang chun 1 kb.
-NK1 và vector có ch-c ni vi nhau theo thành phn trình bày trong
Bng 17.
Bảng 17:Thành phn phn ng n-NK1 vào vector pJET1.2--NK1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
m 2x
10.0
 16
0


-NK1
5.0
-NK1-6
4.0
T4 ligase
1.0
Tổng
20.0
n hp nc bin np trc tip vào dòng vi khun E.coli 
trình bày trong mc 2.2.2.6. Kt qu  ng chn lc b sung kháng sinh có nhiu
khun lc. Chúng tôi chn 13 khun l kim tra s có mt cn cDNA hoàn chnh bng
phn ng PCR vi cp mi bt cp vi trình t  u
a cDNA hoàn chnh mã cho th th neurokinin-1. Thành phu kin ca phn ng
c trình bày trong Bng 18.
Bảng 18: Thành phu kin phn ng PCR sàng lc khun lc chn cDNA hoàn
chnh mã hóa cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.0
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0

C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1u/ µl)
0.5
Khuôn
1.0
Tổng
15.0


Hình 15n di sn phm PCR sàng lc các khun l n cDNA NK1 hoàn chnh.

Ging1-13 là các khun l  i chng âm không có DNA; M:
thang chun 1 kb.
Kt qu n di sn phm PCR cho thc 10 trong s 13 khun lc mang
c xp x i. Các khun lc kí hiu NK1-1
n NK1-10.
-1
Chúng tôi chn khun lc NK1- tách plasmid tái t hc kí hiu pNK1-3.
Plasmid pNK1-c gii trình t hai chiu bng mi ca vector pJET 1.2 F/ R. Kt qu c
trình bày trong Ph lc.
Kt qu khi so sánh vi trình t nucleotide ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-c
tách dòng t i Vit Nam, chúng tôi không thy bt k s sai khác nào. C hai trình t
u có 5 nucleotide khác vi trình t trong ngân hàng d liu (Mã s trên NCBI: M81797.1).
u này chng t rng s khác bit gia trình t nucleotide trong gen mã hóa cho th th
neurokinin-1 ci Vit Nam vi trình t nucleotide trong ngân hàng d li
hình ca gen mã hóa cho th th neurokinin-1  i.
y, t kt qu gii trình t cho th dòng thành công cDNA hoàn chnh
mã hóa cho th th neurokinin-1 t mu phi Vit Nam.
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1
3.2.1. Thiết kế mồi
 biu hin cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1  i, chúng tôi s dng hai vector biu
hin  t ng vt là pCDNA3 và pEGFP-u tiên cn chuy
dòng trong vector pJET1.2 sang hai h thng vector biu hin. Khi la chn enzyme ct gii hn,
chúng tôi không thy enzyme nào trong v m ca vector pEGFP-N1 và pCDNA3 tha
u kin c n cDNA hoàn chnh t vector tái t hp pJET1.2-NK1. Vì vy,
t k mi NK1 F
3
/ NK1 R
3
 chuyn cDNA-NK1 t pNK1-3 sang vector biu
hin. Trình t cp mi NK1 F

3
/ NK1 R
3
c thit k da vào trình t cDNA hoàn chnh tách
dòng t phi Vi a mi NK1 F
3
c thit k mang trình t
nhn bit cho enzyme ct gii hn HindIII và mi NK1 F
3
mang trình t nhn bit cho enzyme
Bam
+ NK1 F
3
- - 


- - 



Hình 16:  thit k mi NK1 F
3
/R
3
 khui cDNA-NK1 t vector pNK1-3.
Mt khác, chúng tôi s dng mã m u trong trình t cDNA ca NK1 thay vì mã m c
thit k sn trên vector biu hin nên trong quá trình thit k mi chúng tôi phi chèn thêm trình
t Kozak (ACCATGG)   c phiên mã và dch mã ca gen trong t
bào nhn.
Vi hai mc thit k mi, chúng tôi khui cDNA t pNK1-3. Thành phu kin

ca phn c th hin trong Bng 19.
ACCATGG
G T T AC A C GA GAGG A T C
Trình t Kozak
AAT
Hind III
C CT AGG
AAGCTT
-CTAGAAGATCGAAATGGATAACGTCCTCC /-/-/ pNK1 /-/-/ CAATGTGCTCTCCTAGGGATCCTTA-


ATTT
ATTT
AAGCTT
AAGCTT
ACCATGG
AC CA T GG
ATAACGTCCTCC
ATAA C GT C C TC C
GGATCC
Bam HI
CTAGGAGAGCACATTG
TAA
GGATCC
Bảng 19: Thành phu kin phn ng PCR khui cDNA-NK1 t pNK1-3 bng cp
mi NK1 F3/ NK1 R3
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H

2
O
10.4
- Thi gian biu tiên: 94
o
C, 5 phút
- Lp li 4 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 50
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Lp li 35 chu k
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút


2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F3 (2 µM)
0.5
NK1 R3 (2 µM)
0.5
Pfu polymerase
0.1
pNK1-3
1.0
Tổng
15.0
Trong phn ng PCR, do trình t mi thit k có mi dài không bt
cc vào khuôn nên trong 4 chu k u tiên, chúng tôi h thp nhi gn m có th
n gen mong mun.  các chu k ti gn m m bo
c hiu ca phn ng. Kt qu n di sn phm PCR cho th
c xp x 


Hnh 17: 





 PCR v






 1-3  1
F3/NK1 R3. Ging 1: sn phm PCR khui cDNA NK1; M: thang chun SY-500; : 


 .
y cp mi mi thit k c hin cDNA hoàn chnh mã hóa cho th
th neurokinin-ng thn DNA mc nhân bn có mang v trí nhn bit ca cp
enzyme HindIII/ BamHI  n phc tinh sch bng kit High Pure
c kí hiu là eNK1 (expression NK1).
3.2.2.  -1
Chúng tôi tách chit và tinh sch hai loi plasmid pCDNA3 và pEGFP-N1. Hai plasmid
c ct lt vi enzyme HindIII. Sn phm cn di và tinh sch
bn phm tinh sch tip tc ct
vi BamHI. Thành phu kin phn ng ct vi tc trình bày trong Bng
20 và Bng 21.
Bảng 20: Thành phu kin cho phn ng ct sn phm PCR cha gen NK1 bng enzyme
HindIII
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
60.0
 37

0
Ctrong 2 gi
m R 10x
15.0
eNK1(hoc plasmid)
70.0
Hind III
5.0
Tổng
150.0

Bảng 21: Thành phu kin cho phn ng vi enzyme BamHI
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
33.0
 37
0
Ctrong 2 gi
m 10x Bam HI
10.0
Sn pht vi HindIII
54.0
Bam HI
3.0
Tổng
100.0

Qua mc ct sn phc tinh sch bng High Pure Product Purification kit
n di kim tra. K



 c th hin trong Hình 18.

Hnh 18: 





 3, pEGFP-N1  1 vi hai enzyme Hind III
và Bam HI. Ging 1, 2, 3 



 3, pEGFP-N1 1 ; 1, 2, 3:




 3, pEGFP-N1 1 ; M1: marker 1 kb; M2: thang chun
SY-500.
Sau khi tinh sng vector pCDNA 3  -N1 vi thành
ph

 22.
Bảng 22: Thành phu kin ca phn ng ni cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1 vào

vector pCDNA3 và pEGFP-N1
Thành phần
Thể tích(µl)
Thành phần
Thể tích (µl)
m 10x
2.0
m 10x
2.0
eNK1ct
8.5
eNK1 ct
10.0
Plasmid pCDNA3 ct
8.5
Plasmid pEGFP-N1 ct
7.0
T4 ligase
1.0
T4 ligase
1.0
Tổng
20.0
Tổng
20.0
Điều kiện: Ủ ở 16
0
C qua đêm









 





 E. coli DH5
 c nhit (Mc 2.2.2.6). Khun lc nhn plasmid pCDNA3 s m   ng có
kháng sinh ampicillin (50µg/ml). Khun lc nhn plasmid pEGFP-N1 s mng có
kháng sinh Kanamycin (50µg/ml). Trên c hai long, 
  nh mã hóa cho NK1, chúng tôi chn 14 khun
lng cha kháng sinh ampicillin và 15 khun lng cha kháng sinh
kanamycin làm khuôn cho phn ng PCR v

 1 F3/ NK1 R3.  u
ki












 23.
Bảng 23: Thành phu kin ca phn ng PCR kim tra cDNA-NK1 trong các th bin
np
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.0
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 135 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0

C, 10 phút

1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F3 (10 µM)
0.5
NK1 R3 (10 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1 u/ µl)
0.5
Khuôn
1.0
Tổng
15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 19 và Hình 20). Kt qu cho thy vi
các dòng vi khun mang vector tái t hc 8 trong 15 khun lc
n chèn cDNA-n (Hình 19).Vi các dòng cha vector
tái t hp peGFP-c 13 trong 15 khun lc chn chèn cDNA-NK1 có
 c mong mun (Hình 20).

Hnh 19: 












 





 3-NK1.
1A-14A:   ng; ging M: thang chun SY-500.

Hnh 20: 


















 1-NK1.
1E-15E:  nh s ng; ging M: thang chun SY-500.








 





 3-NK1 1-
NK1 mang cDNA hoàn chnh mã cho NK1. Da vào n di, chúng tôi la chn hai khun
lc 11A và 5E. Các vector tái t hp ca hai khun lc kí hiu là pCDNA3-NK1-11 
pEGFP-N1-NK1-5. Chúng tôi tách chit hai loi plasmid tái t h  .
3.2.3. Giải trnh tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 trong vector biểu hiện
 khnh s có mt ca cDNA-NK1 trong các vector biu hin, 




pCDNA3-NK1-11  -N1-NK1-5 








   n chèn
NK1 

 .








 -NK1 





  y
a cDNA-NK1 

















 1-3. 














 u hin mang cDNA hoàn chnh mã hóa cho th th neurokinin-1  i Vit
Nam
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN


1. Tách dòng thành công cDNA hoàn chnh mã hóa cho th th neurokinin  1  phi i Vit
Nam. cDNA- các v trí 184, 333, 370,

641, 996) không ging vi trình t cDNA-NK1 trong ngân hang d liu, chng t s a
gen mã cho th th NK1  i Vit Nam.
2. Thit k thành công vector biu hin pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA mã cho th th
NK1 phân lp t phi ci Vit Nam.





.