(Luận án tiến sĩ) thiết kế, tổng hợp và đánh giá tác động ức chế acetylcholinesterase và β amyloid của một số dẫn chất tương đồng curcumin và flavonoid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THÁI SƠN

THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC
CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE VÀ BETA-AMYLOID
CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT TƯƠNG ĐỒNG
CURCUMIN VÀ FLAVONOID

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP.HỒ CHÍ MINH, Năm 2022

ho tro tai file :


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THÁI SƠN

THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC
CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE VÀ BETA-AMYLOID
CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT TƯƠNG ĐỒNG
CURCUMIN VÀ FLAVONOID

NGÀNH: HÓA DƯỢC
MÃ SỐ: 62720403

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. THÁI KHẮC MINH
2. GS.TS. TRẦN THÀNH ĐẠO

TP.HỒ CHÍ MINH, Năm 2022

ho tro tai file :


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu
đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc công bố ở
bất kỳ nơi nào.

Tác giả luận án

Trần Thái Sơn

ho tro tai file :


MỤC LỤC

Trang

Danh mục từ viết tắt và thuật ngữ Anh–Việt .............................................................. i
Danh mục các hình .................................................................................................... iii
Danh mục các sơ đồ ................................................................................................. vii
Danh mục các bảng ................................................................................................. viii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................4
1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer .............................................................................4
1.2. Tổng quan về acetylcholinesterase ......................................................................5
1.3. Tổng quan về β-secretase .....................................................................................8
1.4. Tổng quan về curcumin và dẫn chất ..................................................................13
1.5. Tổng quan về flavonoid .....................................................................................16
1.6. Tổng quan về nghiên cứu in silico trong hóa dƣợc ............................................20
1.7. Các nghiên cứu có liên quan đến đề tài..............................................................36
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................41
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.........................................................................................42
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................42
Chƣơng 3. KẾT QUẢ ...............................................................................................66
3.1. Kết quả nghiên cứu thiết kế các dẫn chất in silico .............................................66
3.2. Kết quả nghiên cứu tổng hợp hóa học................................................................93
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học .................................................................103
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ..........................................................................................107
4.1. Nghiên cứu thiết kế dẫn chất in silico ..............................................................107
4.2. Tổng hợp hóa học .............................................................................................121
4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro .................................................................141
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................154

ho tro tai file :


DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

ho tro tai file :


i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH–VIỆT

Từ viết tắt

Từ tiếng Anh

Đối chiếu tiếng Việt

13

Carbon-13 nuclear magnetic

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

resonance

carbon-13

Proton nuclear magnetic

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

resonance

proton

Two-dimensional quantitative

Mối liên quan định lƣợng cấu

structure–activity relationship

trúc–hoạt tính sinh học 2 chiều

1

C-NMR

H-NMR

2D-QSAR
A

β-amyloid

ACh

Acetylcholin

AChE

Acetylcholinesterase

AD

Alzheimer’s disease

Bệnh Alzheimer

APP

Amyloid-beta precursor protein

Protein tiền sinh chất amyloid

ATCI

Acetylthiocholin iodid

BACE-1

Beta-site amyloid precusor

-Secretase

protein cleaving enzyme 1
CADD

Computer-aided drug design

Thiết kế thuốc với sự hỗ trợ của
máy tính

CoMFA

Comparative molecular field
analysis

CoMSIA

Comparative similarity indices
analysis

CTF83

C-terminal fragment consisting

Phân mảnh gắn kết với màng có

of 83 amino acids

đầu C tận cùng và chứa 83 acid
amin

CTF99

C-terminal fragment consisting

Phân mảnh liên kết với màng có

of 99 amino acids

đầu C tận cùng và chứa 99 acid
amin

DMSO

Dimethyl sulfoxid

ho tro tai file :


ii

Từ viết tắt

Từ tiếng Anh

DTNB

Acid 5,5’-dithio-bis-nitrobenzoic

EF

Enrichment factor

Đối chiếu tiếng Việt

Hệ số làm giàu

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

EtONa

Natri ethanolat

FRET

Fluorescence resonance energy

Truyền năng lƣợng cộng hƣởng

transfer

huỳnh quang

GH

Goodness of hits

IC50

half maximal inhibitory

Nồng độ ức chế 50% hoạt tính

concentration

của enzym

IR

Infrared

Phổ hồng ngoại

LHM

Linear heuristic method

LOO

Leave-one-out

MLR

Multiple linear regression

MS

Mass spectroscopy

Phổ khối

PLS

Partial least squares

Thuật tốn bình phƣơng tối thiểu
từng phần

Quantitative structure–activity

Mối liên quan định lƣợng cấu

relationship

trúc–hoạt tính sinh học

RMSD

Root-mean-square deviation

Độ lệch căn quân phƣơng

RMSE

Root-mean-square error

Sai số căn quân phƣơng

ROC

Receiver operating characteristic

sAPP

soluble APP

QSAR

Mảnh APP hòa tan

ho tro tai file :


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cơ chế phản ứng phân hủy acetylcholin bởi acetylcholinesterase. ..............6
Hình 1.2. Cấu tạo của acetylcholinesterase và 2 vùng gắn kết quan trọng (tinh thể
1EVE) .............................................................................................................7
Hình 1.3. Quá trình phân cắt protein tiền sinh chất amyloid .....................................9
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của BACE-1 ................................................................10
Hình 1.5. Các đặc điểm cấu trúc của BACE-1 (tinh thể 1FKN) ..............................12
Hình 1.6. Nguyên tắc của phƣơng pháp xác định hoạt tính ức chế BACE-1 ...........13
Hình 1.7. Cấu trúc của curcumin. .............................................................................14
Hình 1.8. Các tác dụng của curcumin đối với các yếu tố bệnh sinh của bệnh
Alzheimer .....................................................................................................15
Hình 1.9. Cấu trúc khung hóa học của một số nhóm flavonoid chính. ....................17
Hình 1.10. Tác dụng sinh học của flavonoid................................................................18
Hình 1.11. Một cách biểu diễn pharmacophore ..........................................................23
Hình 1.12. Tóm tắt ngun lý chung của q trình xây dựng mơ hình
pharmacophore. ............................................................................................25

Hình 1.13. Ngun tắc xây dựng và đánh giá các mơ hình pharmacophore bằng
cơng cụ Pharmacophore Elucidation của phần mềm MOE 2008.10 ...........26
Hình 1.14. Nguyên tắc của phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu .............................29
Hình 1.15. Tóm tắt ngun lý cơ bản của q trình xây dựng các mơ hình QSAR. 30
Hình 1.16. Ngun lý cơ bản của phƣơng pháp docking phân tử. ...........................34
Hình 1.17. Nguyên tắc docking phân tử bằng phần mềm FlexX .............................35
Hình 2.1. Tóm tắt nội dung nghiên cứu.................................................................... 41
Hình 2.2. Tóm tắt quy trình thiết kế các dẫn chất in silico. .....................................42
Hình 2.3. Các khung cấu trúc curcumin và flavonoid đƣợc sử dụng để thiết kế thƣ
viện tổ hợp ảo. ..............................................................................................44

ho tro tai file :


iv

Hình 2.4. Minh họa quá trình xây dựng thƣ viện tổ hợp ảo bằng cơng cụ QuaSARCombigen. ....................................................................................................45
Hình 2.5. Thiết kế các dẫn chất phenothiazin chalcon có các nhóm thế khác nhau
trên vịng B. ..................................................................................................48
Hình 2.6. Thiết kế các dẫn chất flavon. ....................................................................48
Hình 3.1. Cấu trúc của 4 chất đƣợc sử dụng để xây dựng các mơ hình
pharmacophore cho các chất ức chế AChE. ................................................ 67
Hình 3.2. Cấu trúc của 4 chất đƣợc sử dụng để xây dựng các mô hình
pharmacophore cho các chất ức chế BACE-1. ............................................67
Hình 3.3. Mơ hình pharmacophore A1 (AChE). ......................................................69
Hình 3.4. Mơ hình pharmacophore B1 (BACE-1). ..................................................69
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc thƣ viện tổ hợp ảo các dẫn chất flavonoid và curcumin
xây dựng đƣợc. .............................................................................................70
Hình 3.6. Mối tƣơng quan giữa hoạt tính sinh học (pIC50) thực nghiệm và đƣợc dự
đốn bằng các mơ hình 2D-QSAR xây dựng cho các chất ức chế (A) AChE

và (B) BACE-1.............................................................................................75
Hình 3.7. Hoạt tính ức chế (pIC50) AChE và BACE-1 dự đoán của các dẫn chất
curcumin và flavonoid sàng lọc đƣợc ..........................................................76
Hình 3.8. Hoạt tính ức chế (pIC50) AChE và BACE-1 dự đoán của các dẫn chất
phenothiazin chalcon thiết kế.......................................................................77
Hình 3.9. Hoạt tính ức chế (pIC50) AChE và BACE-1 dự đoán của các dẫn chất
flavon (dẫn xuất baicalein) đƣợc thiết kế.....................................................78
Hình 3.10. Hoạt tính ức chế (pIC50) AChE và BACE-1 dự đoán của các dẫn chất
flavon (dẫn xuất diosmetin) đƣợc thiết kế ...................................................79
Hình 3.11. Xếp chồng các cấu dạng docking lại của phối tử đồng kết tinh vào các
tinh thể của AChE: (A) 1ACJ, (B) 1DX6, (C) 1EVE, (D) 1W6R, (E)
4EY6—chuỗi A, (F) 4EY6—chuỗi B, (G) 4EY7—chuỗi A, (H) 4EY7—
chuỗi B. ........................................................................................................82

ho tro tai file :


v

Hình 3.12. Xếp chồng các cấu dạng docking lại của phối tử đồng kết tinh vào các
tinh thể của BACE-1: (A) 3VEU, (B) 4B78, (C) 5HU0—chuỗi A, (D)
5HU0—chuỗi B, (E) 5HU1—chuỗi A, (F) 5HU1—chuỗi B, (G) 6EQM. ..83
Hình 3.13. Kết quả docking phân tử của các dẫn chất sàng lọc đƣợc ......................84
Hình 3.14. Kết quả docking phân tử của các dẫn chất phenothiazin chalcon thiết
kế.. ................................................................................................................85
Hình 3.15. Kết quả docking phân tử của các dẫn chất baicalein thiết kế .................86
Hình 3.16. Kết quả docking phân tử của các dẫn chất diosmetin thiết kế ...............87
Hình 3.17. Kết quả IC50 của các dẫn chất tổng hợp trong nghiên cứu đối với AChE
và BACE-1 .................................................................................................104
Hình 3.18. Kết quả pIC50 của các dẫn chất tổng hợp trong nghiên cứu đối với AChE

và BACE-1 .................................................................................................105
Hình 4.1. Tƣơng quan giữa hoạt tính sinh học thực nghiệm và đƣợc dự đốn bằng
mơ hình 2D-QSAR đối với AChE của các dẫn chất (A) phenothiazin
chalcon (các dẫn chất AC1–AC3, AC6–AC11); và (B) dẫn chất flavon (Số
liệu của các dẫn chất flavon và chất đối chiếu galantamin)....................... 115
Hình 4.2. Tƣơng quan giữa hoạt tính sinh học thực nghiệm và đƣợc dự đốn bằng
mơ hình 2D-QSAR đối với BACE-1 của các dẫn chất (A) phenothiazin
chalcon; và (B) dẫn chất flavon (Số liệu của các dẫn chất flavon và chất đối
chiếu quercetin). .........................................................................................117
Hình 4.3. So sánh mật độ điện tích dƣơng trên nguyên tử carbon ở nhóm carbonyl
trong phân tử dẫn chất benzaldehyd và acepromazin. ...............................122
Hình 4.4. Liên kết hydro nội phân tử trong cấu trúc baicalein và diosmetin. ........125
Hình 4.5. Cấu trúc của dẫn chất AC4 .....................................................................131
Hình 4.6. Phổ 1H-NMR của diosmetin. ..................................................................139
Hình 4.7. Phổ 13C-NMR của diosmetin. .................................................................140
Hình 4.8. Mơ hình tƣơng tác của galantamin với AChE (tinh thể 1DX6). ............143
Hình 4.9. Mơ hình tƣơng tác của AC12 với AChE (tinh thể 1DX6). ....................144

ho tro tai file :


vi

Hình 4.10. Mơ hình tƣơng tác của AC1 (A) và AC2 (B) với AChE (tinh thể 1DX6).
....................................................................................................................144
Hình 4.11. Mơ hình tƣơng tác của B1 (A) và B2 (B) với AChE (tinh thể 1DX6). 145
Hình 4.12. Mơ hình tƣơng tác của B3 với AChE (tinh thể 1DX6). .......................146
Hình 4.13. Mơ hình tƣơng tác của verubecestat với BACE-1 (tinh thể 5HU1). ....148
Hình 4.14. Mơ hình tƣơng tác của AC4 với BACE-1 (tinh thể 5HU1). ................148
Hình 4.15. Mơ hình tƣơng tác của AC12 với BACE-1 (tinh thể 5HU1). ..............149

Hình 4.16. Mơ hình tƣơng tác của AC1 với BACE-1 (tinh thể 5HU1). ................149
Hình 4.17. Mơ hình tƣơng tác của AC13 với BACE-1 (tinh thể 5HU1). ..............150
Hình 4.18. Mơ hình tƣơng tác của D5 và D6 với BACE-1 (tinh thể 6EQM). .......151
Hình 4.19. Mơ hình tƣơng tác của quercetin với BACE-1 (tinh thể 6EQM). ........152

ho tro tai file :


vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang
Sơ đồ 1.1. Phản ứng tạo sản phẩm màu theo phƣơng pháp Ellman ...........................8
Sơ đồ 1.2. Nguyên tắc của quá trình tổng hợp curcumin .........................................16
Sơ đồ 1.3. Phản ứng ngƣng tụ Claisen–Schmidt trong tổng hợp các dẫn chất chalcon.
......................................................................................................................19
Sơ đồ 1.4. Tổng hợp một số phân nhóm flavonoid. .................................................20
Sơ đồ 2.1. Phản ứng tổng hợp các phenothiazin chalcon ......................................... 55
Sơ đồ 2.2. Xử lý nguyên liệu acepromazin maleat. ..................................................55
Sơ đồ 2.3. Tổng hợp các dẫn chất baicalein. ............................................................58
Sơ đồ 2.4. Tổng hợp diosmetin và các dẫn chất .......................................................58
Sơ đồ 4.1. Sự hình thành anion enolat trong môi trƣờng kiềm của dẫn chất
acepromazin ............................................................................................... 122
Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng tạo phenothiazin chalcon ...........................................122
Sơ đồ 4.3. Tổng hợp ether bằng phƣơng pháp tách nƣớc. ......................................124
Sơ đồ 4.4. Cơ chế phản ứng ether hóa baicalein và diosmetin theo phƣơng pháp
Willamson. .................................................................................................125
Sơ đồ 4.5. Phản ứng thủy phân dimethyl sulfat trong môi trƣờng nƣớc. ...............125
Sơ đồ 4.6. Cơ chế phản ứng ester hóa baicalein hoặc diosmetin............................128

ho tro tai file :


viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Vị trí, chức năng và thành phần các acid amin quan trọng tại các vùng
gắn kết của acetylcholinesterase. ...................................................................7
Bảng 1.2. Các nhóm thơng số mơ tả phân tử đƣợc tính tốn bởi phần mềm MOE 2008.10.
......................................................................................................................28
Bảng 1.3. Các thuật toán sử dụng để xây dựng mơ hình QSAR. .............................28
Bảng 2.1. Các phần mềm và phƣơng tiện sử dụng trong thiết kế các dẫn chất in silico. 43
Bảng 2.2. Các nhóm thế đƣợc sử dụng để thiết kế thƣ viện tổ hợp các dẫn chất
curcumin và flavonoid. ................................................................................44
Bảng 2.3. Hóa chất sử dụng để tổng hợp các dẫn chất flavonoid. ...........................53
Bảng 2.4. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu tổng hợp hóa học. ....................54
Bảng 2.5. Nguyên liệu và điều kiện phản ứng tổng hợp các dẫn chất phenothiazin
chalcon. ........................................................................................................56
Bảng 2.6. Nguyên liệu và điều kiện phản ứng tổng hợp các dẫn chất flavon. .........60
Bảng 2.7. Hóa chất, thiết bị sử dụng trong khảo sát hoạt tính ức chế AChE. ............62
Bảng 2.8. Thành phần của hỗn hợp phản ứng trong một giếng đo. .........................63
Bảng 2.9. Hóa chất, thiết bị sử dụng trong khảo sát hoạt tính ức chế BACE-1. .......64
Bảng 2.10. Thành phần của hỗn hợp phản ứng trong một giếng đo. .......................65
Bảng 3.1. Số lƣợng các dẫn chất theo nhóm cấu trúc trong thƣ viện tổ hợp ảo ....... 66
Bảng 3.2. Cơ sở dữ liệu để xây dựng và đánh giá các mơ hình pharmacophore. ....66
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá các mơ hình pharmacophore đối với AChE. ................68
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá các mơ hình pharmacophore đối với BACE-1. ............68

Bảng 3.5. Số lƣợng các dẫn chất flavonoid đƣợc sàng lọc qua các mô hình
pharmacophore theo từng nhóm cấu trúc. ....................................................70
Bảng 3.6. Các dẫn chất phenothiazin chalcon đƣợc thiết kế. ...................................71
Bảng 3.7. Các dẫn chất flavon đƣợc thiết kế từ baicalein. .......................................72

ho tro tai file :


ix

Bảng 3.8. Các dẫn chất flavon đƣợc thiết kế từ diosmetin. ......................................73
Bảng 3.9. Các mơ hình 2D-QSAR đƣợc xây dựng cho các chất ức chế AChE và
BACE-1. .......................................................................................................74
Bảng 3.10. Các thông số mô tả đƣợc lựa chọn để xây dựng các mơ hình 2D-QSAR. ......74
Bảng 3.11. Thống kê pIC50 dự đoán trên AChE và BACE-1 của các dẫn chất
flavonoid và curcumin thu đƣợc từ sàng lọc ảo. ..........................................80
Bảng 3.12. Thống kê pIC50 dự đoán trên AChE và BACE-1 của các phenothiazin
chalcon đƣợc thiết kế. ..................................................................................80
Bảng 3.13. Thống kê pIC50 dự đoán trên AChE và BACE-1 của các dẫn chất
baicalein đƣợc thiết kế. ................................................................................80
Bảng 3.14. Thống kê pIC50 dự đoán trên AChE và BACE-1 của các dẫn chất
diosmetin đƣợc thiết kế. ...............................................................................81
Bảng 3.15. Kết quả giá trị RMSD của quá trình docking lại các phối tử đồng kết tinh.
......................................................................................................................81
Bảng 3.16. Thống kê kết quả docking của các dẫn chất flavonoid và curcumin thu
đƣợc từ sàng lọc ảo. .....................................................................................88
Bảng 3.17. Thống kê kết quả docking của các dẫn chất phenothiazin chalcon thiết kế.
......................................................................................................................89
Bảng 3.18. Thống kê kết quả docking của các dẫn chất baicalein thiết kế. .............90
Bảng 3.19. Thống kê kết quả docking của các dẫn chất diosmetin thiết kế. ............91

Bảng 3.20. Danh sách các dẫn chất có tiềm năng cho tổng hợp hóa học. ................92
Bảng 3.21. Tóm tắt kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu thiết kế các dẫn chất in silico. 92
Bảng 3.22. Danh sách các dẫn chất thiết kế đƣợc lựa chọn để tổng hợp hóa học. ...93
Bảng 3.23. Tóm tắt hoạt tính sinh học in vitro của các dẫn chất tổng hợp đƣợc trong
nghiên cứu. .................................................................................................106
Bảng 4.1. So sánh giữa các mơ hình pharmacophore đƣợc phát triển trong nghiên
cứu này với các công bố của các tác giả khác............................................ 110
Bảng 4.2. So sánh giữa mơ hình 2D-QSAR trên đích tác động AChE đƣợc phát
triển trong nghiên cứu này với các nghiên cứu của các tác giả khác. ........113

ho tro tai file :


x

Bảng 4.3. So sánh giữa mơ hình 2D-QSAR trên đích tác động BACE-1 đƣợc phát
triển trong nghiên cứu này với nghiên cứu của các tác giả khác. ..............116
Bảng 4.4. Tóm tắt phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của AC4. .......................133
Bảng 4.5. Tóm tắt phổ của baicalein. ......................................................................137
Bảng 4.6. So sánh phổ của diosmetin trong nghiên cứu này với dữ liệu đã công bố.
....................................................................................................................138

ho tro tai file :


1

MỞ ĐẦU
Bệnh Alzheimer (Alzheimer’s Disease – AD) là căn bệnh thối hóa thần kinh
khơng hồi phục đƣợc Alois Alzheimer mơ tả lần đầu tiên vào năm 1906 [104]. Đây

là căn bệnh có tỷ lệ cao ở ngƣời lớn tuổi. Theo ƣớc tính, năm 2018 trên tồn thế
giới có khoảng 50 triệu ngƣời bị mất trí nhớ có liên quan đến AD, và con số này sẽ
tăng lên gần 3 lần vào năm 2050 [89]. AD đang tạo một gánh nặng rất lớn về kinh tế
- xã hội lên hệ thống y tế của nhiều nƣớc phát triển có dân số ngày càng già đi. Chi
phí cho chăm sóc y tế tồn cầu đối với bệnh mất trí nhớ, bao gồm cả AD, lần lƣợt
vào các năm 2015, 2030 và 2050 tƣơng ứng sẽ là 950 tỷ, 2.500 tỷ, và 9.100 tỷ đô la
Mỹ [70]. Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ học đã ghi nhận hiện đang có
khoảng 500.000 ngƣời trên 60 tuổi bị sa sút trí tuệ bao gồm cả AD, và con số này
ngày một tăng lên kèm theo đó là chi phí cho điều trị bệnh ngày một lớn [4]. Các
thuốc hiện đƣợc sử dụng trong điều trị AD; bao gồm rivastigmin, galantamin,
donepezil, và memantin; chỉ làm chậm lại sự tiến triển của quá trình suy giảm các
chức năng nhận thức mà không chữa lành đƣợc bệnh [101]. Chính vì vậy, nhu cầu
tìm kiếm các liệu pháp mới có thể chặn đứng hoặc đảo nghịch tiến triển của bệnh
hiện nay là cực kỳ lớn.
Về mặt bệnh học, AD đƣợc xác nhận là căn bệnh với nhiều yếu tố bệnh sinh
bao gồm: sự hiện diện của các mảng β-amyloid (Aβ) ở ngoại bào và các đám rối sợi
thần kinh cùng với protein Tau bị phosphoryl hóa quá mức ở nội bào tế bào thần
kinh [101], [165], sự mất tính tồn vẹn của hệ vi mạch thần kinh ở não [62], và
những thay đổi trong các hoạt động synap/thần kinh và trong chuyển hóa thần kinh
[55]. Nhƣ vậy, do bản chất đa yếu tố phức tạp của AD nên một trong các hƣớng trị
liệu mới là chú trọng đến việc tìm ra các hợp chất có tác dụng đồng thời trên nhiều
yếu tố bệnh học quan trọng của bệnh. Hai cách tiếp cận nghiên cứu thuốc mới trong
điều trị AD thu hút nhiều mối quan tâm của các nhà khoa học trong một thời gian
dài là tái lập dẫn truyền hệ cholinergic thông qua ức chế acetylcholinesterase
(AChE) và ức chế β-amyloid thông qua ức chế enzym β-secretase (beta-site

ho tro tai file :


2

amyloid precusor protein cleaving enzyme 1, BACE-1). Đây là 2 enzym quan trọng
trong sinh bệnh học của AD. AChE chịu trách nhiệm cho những khiếm khuyết trong
con đƣờng dẫn truyền tín hiệu cholinergic, cịn BACE-1 là enzym có liên quan đến
q trình sinh tổng hợp thành phần chính của các mảng β-amyloid [97].
Curcuminoid (curcumin và các chất tƣơng đồng) và flavonoid là 2 nhóm hợp
chất thiên nhiên thu hút nhiều mối quan tâm nhất trong thời gian gần đây vì những
hoạt tính sinh học đa dạng của chúng, đặc biệt là những tác dụng đƣợc chứng minh
là có lợi đối với AD [117], [153]. Những lợi ích trị liệu của các dẫn chất curcumin
và flavonoid đối với AD thông qua nhiều con đƣờng khác nhau, trong đó có các tác
động trên AChE [10], [153] và BACE-1 [169], [176].
Thiết kế thuốc với sự hỗ trợ của máy tính là phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng
rộng rãi trong lĩnh vực phát minh thuốc, và đã cho ra đời nhiều tác nhân trị liệu hữu
hiệu [75], [177], [180]. Bằng cách sử dụng phƣơng pháp này, các nhà khoa học có
thể đƣa ra nhiều gợi ý có giá trị để định hƣớng cho các giai đoạn nghiên cứu thực
nghiệm của tiến trình phát triển thuốc. Nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng các
phƣơng pháp thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính bao gồm nghiên cứu mối liên
quan định lƣợng cấu trúc–hoạt tính sinh học 2 chiều (two-dimensional quantitative
structure–activity relationship, 2D-QSAR), mơ hình pharmacophore và docking
phân tử đã đƣợc áp dụng thành cơng trong tìm kiếm các cấu trúc có tiềm năng ức
chế AChE và BACE-1. Điều này giúp cho viễn cảnh tìm kiếm các chất mới trong
điều trị AD ngày càng rộng mở và đầy hứa hẹn [8], [66], [86], [87].
Nhƣ vậy với việc nhận thấy rõ bệnh Alzheimer là căn bệnh có nhiều yếu tố
bệnh sinh, trong đó đáng chú ý nhất là sự rối loạn dẫn truyền cholinergic và sự hình
thành và kết tập các mảng Aβ, đồng thời cũng nhận thấy rõ các dẫn chất flavonoid
và curcumin có hoạt tính sinh học rất đa dạng, trong đó có các hoạt tính quan trọng
trên sinh bệnh học Alzheimer, đặc biệt là những hoạt tính liên quan đến AChE và
BACE-1, đề tài “Thiết kế, tổng hợp và đánh giá tác động ức chế
acetylcholinesterase và -amyloid của một số dẫn chất tƣơng đồng curcumin
và flavonoid” đƣợc thực hiện với các mục tiêu:

ho tro tai file :


3

1. Thiết kế in silico các dẫn chất curcumin và flavonoid đƣợc dự đốn có
hoạt tính ức chế trên cả 2 đích tác động của bệnh Alzheimer là AChE và BACE-1.
- Xây dựng thƣ viện tổ hợp ảo các dẫn chất curcumin và flavonoid phục vụ
cho nghiên cứu sàng lọc để tìm kiếm các dẫn chất và các khung cấu trúc có tác động
đồng thời trên AChE và BACE-1.
- Xây dựng các mơ hình pharmacophore đối với AChE và BACE-1 và sàng
lọc trên thƣ viện tổ hợp ảo để tìm kiếm các dẫn chất và khung cấu trúc có tiềm năng
ức chế mạnh đối với AChE và BACE-1.
- Thiết kế mới các dẫn chất từ các khung cấu trúc đƣợc dự đốn có tiềm năng
ức chế trên cả 2 enzym.
- Xây dựng các mơ hình 2D-QSAR để dự đốn hoạt tính sinh học của các
dẫn chất sàng lọc và đƣợc thiết kế mới.
- Xây dựng các mơ hình docking phân tử để đánh giá và phân tích khả năng
gắn kết của các dẫn chất sàng lọc và đƣợc thiết kế mới.
- Đề xuất danh sách các chất tiềm năng nhất để lựa chọn cho tổng hợp hóa
học và đánh giá hoạt tính sinh học in vitro.
2. Tổng hợp các dẫn chất lựa chọn từ danh sách các chất đƣợc thiết kế.
3. Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro các dẫn chất tổng hợp đƣợc.

ho tro tai file :


4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer (AD) là một trong những thách thức lớn nhất về mặt y tế đối
với chúng ta trong kỷ nguyên hiện tại. Bệnh biểu hiện bằng sa sút năng lực trí tuệ,
mất dần trí nhớ, rối loạn ngơn ngữ và khả năng sử dụng các động tác cũng nhƣ nhận
thức, dẫn đến ảnh hƣởng nghiêm trọng cho lao động nghề nghiệp và giao tiếp xã hội
của bệnh nhân. AD còn gây tác động nặng nề đến gia đình và những ngƣời xung
quanh vì chăm sóc một bệnh nhân AD thƣờng rất khó khăn và tốn kém. AD tiến
triển trầm trọng theo thời gian và cuối cùng sẽ dẫn đến tử vong [101]. Hiện số
ngƣời đang bị sa sút trí tuệ có liên quan đến AD trên toàn thế giới vào khoảng 50
triệu ngƣời (năm 2018), và con số này sẽ tăng lên đến 152 triệu vào năm 2050 [89],
với chi phí cho chăm sóc y tế tồn cầu đối với bệnh là hàng ngàn tỷ đơ la Mỹ [70].
AD có các yếu tố nguy cơ, bao gồm: tuổi tác, yếu tố di truyền, lối sống, chế
độ ăn, bia rƣợu, thuốc lá, các bệnh lý tim mạch, đái tháo đƣờng, trầm cảm, béo phì.
Ngồi ra, các yếu tố làm tăng dự trữ nhận thức bao gồm giáo dục, trí thơng minh,
nghề nghiệp và hoạt động xã hội trong suốt cuộc đời cũng góp phần làm tăng hoặc
giảm nguy cơ đối với AD [133].
Về mặt bệnh học, AD đƣợc xác định là căn bệnh với nhiều cơ chế bệnh sinh
bao gồm: (i) sự lắng đọng ở ngoại bào của các mảng Aβ; (ii) sự xuất hiện bên trong
nội bào của các đám rối tơ sợi thần kinh có chứa các protein Tau bị phosphoryl hóa
quá mức [101], [165]; (iii) rối loạn dẫn truyền thần kinh cholinergic [59]; (iv) hậu
quả của đáp ứng viêm và miễn dịch kéo dài [80]; (v) và nhiều yếu tố khác [29].
Về thuốc điều trị, các chất ức chế acetylcholinesterase trong đó có donepezil,
rivastigmin và galantamin hiện là những chất đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Các thuốc
này đều ức chế có hồi phục AChE. Tác dụng điều trị cũng nhƣ tác dụng khơng
mong muốn của nhóm thuốc này gần nhƣ tƣơng đƣơng nhau và việc lựa chọn sử
dụng thuốc nào trong điều trị chủ yếu dựa vào giá thành, khả năng dung nạp của
bệnh nhân và kinh nghiệm của bác sĩ [98]. Memantin là một chất kháng thụ thể Nmetyl-D-aspartat đƣợc Cơ quan quản lý Thực và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ cấp phép vào

ho tro tai file :


5

năm 2003 để điều trị AD giai đoạn trung bình đến nặng. Memantin có thể dùng một
mình hoặc phối hợp với các chất ức chế acetylcholinesterase [73].
Ngoài những thuốc đã đƣợc cấp phép, cho đến nay, đã và đang có rất nhiều
thuốc đƣợc thử nghiệm trên lâm sàng đối với AD ở các thể và giai đoạn khác nhau
nhƣ: (i) các liệu pháp kháng amyloid: bao gồm các chất ức chế BACE-1, các chất
ức chế hay điều hòa -secretase; (ii) các liệu pháp chủng ngừa nhƣ vaccin hay
immunoglobulin; (iii) các kháng thể đơn dòng; (iv) các liệu pháp tác động lên
protein Tau nhƣ: các chất ức chế phosphoryl hóa Tau, các chất ổn định cấu trúc vi
ống, và (v) nhiều liệu pháp khác. Tuy nhiên, vẫn chƣa có một thử nghiệm lâm sàng
nào cho kết quả tác dụng khả quan của các chất nghiên cứu [98].
1.2. Tổng quan về acetylcholinesterase
1.2.1. Vai trò trong bệnh Alzheimer
Giả thuyết cholinergic nhấn mạnh rằng các synap thần kinh hiện diện khắp nơi
trên hệ thần kinh trung ƣơng của ngƣời, với mật độ dày đặc ở vùng dƣới đồi, thể vân,
hệ viền và vùng tân vỏ não (neocortex). Điều này gợi ý rằng dẫn truyền thần kinh
cholinergic có khả năng đóng vai trị tối quan trọng đối với trí nhớ, khả năng học hỏi,
sự tập trung và các chức năng thần kinh cao cấp khác. Chính vì vậy, hệ cholinergic ở
não chiếm một vai trị trung tâm trong các nghiên cứu đã và đang đƣợc thực hiện đối
với tình trạng sa sút trí tuệ do tuổi gây ra, trong đó có AD [59]. Acetylcholinesterase
(AChE, EC 3.1.1.7) có vai trị xúc tác cho phản ứng thủy phân acetylcholin (ACh) và
của một số ester cholin dẫn truyền thần kinh khác. AChE đƣợc tìm thấy chủ yếu tại các
synap thần kinh cholinergic, ở đó nó nhanh chóng phân hủy ACh để giải phóng cholin
và acetat. Do đó AChE đóng vai trị thiết yếu trong dẫn truyền thần kinh cholinergic
[35]. Các chất ức chế acetylcholinesterase làm tăng nồng độ acetylcholin ở khe synap
não bộ và là một trong rất ít liệu pháp trị liệu đã đƣợc chứng minh trên lâm sàng có

hiệu quả trong điều trị tình trạng sa sút trí tuệ do AD gây ra. Chính điều này đã xác
nhận hệ cholinergic là một đích trị liệu quan trọng đối với căn bệnh này [59]. Từ thực
tế nhận thấy đƣợc tầm quan trọng của AChE mà enzym này đã trở thành mục tiêu của
các loại thuốc đƣợc thiết kế để điều trị khơng chỉ bệnh Alzheimer mà cịn một số bệnh
khác liên quan đến hệ cholinergic nhƣ nhƣợc cơ, tăng nhãn áp…[145].

ho tro tai file :


6

1.2.2. Cơ chế xúc tác
AChE có khả năng tạo một sản phẩm trung gian cấu trúc tứ diện thông qua
phản ứng acid–base với bộ ba xúc tác (gồm các acid amin serin, histidin, và
glutamat). Histidin cho phép chuyển một proton giữa các nguyên tử oxy trong serin
và ACh, do đó sẽ loại phần cholin đi để tạo serin đã đƣợc acetyl hóa. Khi acetyl-serin
bị deacetyl hóa, q trình tái tạo AChE trạng thái tự do bắt đầu. Trong phản ứng này
acid amin aspatat giúp ổn định acid amin histidin đã bị proton hóa, rồi acid amin này
sẽ phóng thích acetat để khôi phục một enzym mới ở trạng thái tự do. Tƣơng tác giữa
các acid amin (tyrosin, phenylalanin, tryptophan) tạo nên vùng anion ngoại bào cũng
ảnh hƣởng đến cấu dạng gắn kết của ACh vào vị trí này [182]. Cơ chế phản ứng phân
hủy ACh của AChE đƣợc trình bày ở Hình 1.1.

Hình 1.1. Cơ chế phản ứng phân hủy acetylcholin bởi acetylcholinesterase. ACh:
acetylcholin, Ser: serin, His: histidin. (Nguồn: Zhou và cộng sự (2010) [182]).
1.2.3. Cấu trúc của acetylcholinesterase
Cấu trúc của AChE đƣợc nghiên cứu đầy đủ nhất là enzym của loài
Tetronarce californica (trƣớc đây gọi là Torpedo california). Đây là một polypeptid
có chứa 528 acid amin. Trong cấu trúc của AChE, hai vùng gắn kết quan trọng đã
đƣợc nghiên cứu chi tiết là vùng xúc tác và vùng ngoại biên. Cấu trúc của AChE và

các vùng gắn kết này đƣợc trình bày ở Hình 1.2, chức năng và thành phần các acid
amin quan trọng tại các vùng gắn kết của AChE đƣợc trình bày ở Bảng 1.1 [175].

ho tro tai file :


7

Hình 1.2. Cấu tạo của acetylcholinesterase và 2 vùng gắn kết quan trọng (tinh thể
1EVE). Ala: alanin, Asp: aspartat, Glu: glutamat, Gly: glycin, His: histidin, Phe:
phenylalanin, Ser: serin, Trp: tryptophan, Tyr: tyrosin. (Nguồn: Bajda và cộng sự
(2013) [12]).
Bảng 1.1. Vị trí, chức năng và thành phần các acid amin quan trọng tại các vùng
gắn kết của acetylcholinesterase.
Các
acid amin

Vùng

Vai trò

Xúc tác
Nằm ở đáy của một khoang tác động hẹp (khoảng 5 Å) và sâu (khoảng 20 Å)
Bộ ba xúc tác

Ser200, His440,
Glu327

Phân hủy ACh

Túi ―oxyanion‖

Gly118, Gly119,
Ala201

Ổn định phức trung gian đƣợc hình thành bằng cách
tiếp nhận oxy trên nhóm carbonyl của acetylcholin

Túi acyl

Trp233, Phe288,
Phe290, Phe331

Ổn định nhóm methyl của cấu tử acetat trong q trình
xúc tác và đóng vai trị quan trọng trong tính chọn lọc
cơ chất cho enzym

Vùng anion

Trp84, Glu199,
Phe330

Ổn định điện tích dƣơng của phối tử bằng tƣơng tác
tĩnh điện với Glu199 và đặc biệt các tƣơng tác với
electron π của nhân thơm Trp84 và Phe330

Vùng ngoại biên
Nằm ở lối vào của khoang tác động
Tyr70, Asp72, Tyr121,
Trp279, Tyr334

Thúc đẩy sự kết tập các mảng -amyloid đồng thời biến
đổi chức năng synap của các tế bào thần kinh hải mã

Ala: alanin, Asp: aspartat, Ser: serin, His: histidin, Glu: glutamat, Gly: glycin, Ala: alanin, Trp:
tryptophan, Phe: phenylalanin, Tyr: tyrosin.
(Nguồn: Xu và cộng sự (2017) [175]).

ho tro tai file :


8

1.2.4. Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế acetylcholinesterase
Có nhiều phƣơng pháp khác nhau đã đƣợc mô tả để xác định hoạt tính ức chế
AChE bao gồm phƣơng pháp đo màu sử dụng thuốc thử Ellman [48] hay thuốc thử
muối Fast Blue B [99], phƣơng pháp huỳnh quang [132], hay HPLC [68]. Tuy
nhiên, phƣơng pháp Ellman là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để định
lƣợng hoạt tính ức chế AChE. Đây là một phƣơng pháp đo quang rất nhạy. Phƣơng
pháp này đƣợc tiến hành bằng việc đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 405 nm của
hợp chất có màu vàng đƣợc tạo thành giữa thiocholin (sản phẩm thủy phân cơ chất
acetylthiocholin iodid - ATCI bởi AChE) với thuốc thử Ellman (acid 5,5’-dithiobis-nitrobenzoic - DTNB) theo nhƣ Sơ đồ 1.1.

Sơ đồ 1.1. Phản ứng tạo sản phẩm màu theo phƣơng pháp Ellman. (Nguồn: Ellman
và cộng sự (1961) [48]).
1.3. Tổng quan về β-secretase
1.3.1. Vai trò trong bệnh Alzheimer
Khi có sự phân cắt bất thƣờng của protein tiền sinh chất amyloid (amyloid
precursor protein, APP), các monomer Aβ sẽ đƣợc tạo thành và kết tập lại thành các
oligomer Aβ rồi cuối cùng sẽ lắng đọng dƣới dạng các tơ sợi và mảng Aβ. Các lắng

đọng Aβ và đám rối tơ sợi thần kinh này sẽ gây mất synap thần kinh và các neuron,

ho tro tai file :


9

và kết quả là các vùng não bị ảnh hƣởng sẽ bị teo nhỏ [37]. APP có thể đƣợc phân
cắt theo 2 con đƣờng khác nhau với sự tham gia của các enzym -, -, và secretase. Sự phân cắt liên tiếp bởi phức hợp -secretase và -secretase sẽ ngăn
chặn việc tạo thành A. Trong con đƣờng tạo amyloid, -secretase sẽ phân cắt APP
tại vị trí β (nên đƣợc gọi là beta-site APP cleaving enzyme 1 hay BACE-1) để tạo
phân mảnh đầu C liên kết với màng và chứa 99 acid amin (C-terminal fragment
consisting of 99 amino acids, CTF99), và một mảnh APP hòa tan (soluble APPβ,
sAPP). sAPP cũng là cơ chất của phức hợp -secretase và bị enzym này phân cắt
làm phóng thích vùng APP nội bào (AICD) và các monomer A có chứa từ 1–38
đến 1–43 acid amin. Các monomer A này sau đó sẽ kết tập lại tạo thành các
oligomer và mảng A [181] (Hình 1.3).

Hình 1.3. Quá trình phân cắt protein tiền sinh chất amyloid. APP: protein tiền sinh
chất amyloid, AICD: vùng APP nội bào, BACE-1: β-secretase, CTF83: phân mảnh
gắn kết với màng có đầu C tận cùng và chứa 83 acid amin, CTF99: phân mảnh liên
kết với màng có đầu C tận cùng và chứa 99 acid amin, sAPP: mảnh APP hòa tan.
(Nguồn: Zhou và cộng sự (2019) [181]).

ho tro tai file :


10

1.3.2. Cơ chế xúc tác của BACE-1

BACE-1 xúc tác theo cơ chế acid–base để phân cắt liên kết peptid trong quá
trình xúc tác (Hình 1.4) [14]. Cơ chế gồm hai bƣớc:
Đầu tiên, Asp228 khơng proton hóa có vai trị là một base và Asp32 proton
hóa đóng vai trị một acid. Asp228 nhận proton từ phân tử nƣớc và tạo ion hydroxyl
(OH-). Ion hydroxyl có tính ái nhân sẽ tấn cơng vào nguyên tử C của nhóm carbonyl
trên liên kết peptid (I) đồng thời Asp32 sẽ chuyển proton cho nguyên tử oxy của
nhóm carbonyl này tạo thành một dẫn chất gem-diol trung gian (II).
Bƣớc hai, hai acid amin aspartat đảo ngƣợc vai trò so với bƣớc đầu, lúc này
Asp32 là một base và Asp228 là một acid. Asp228 chuyển proton cho nhóm –NH–
của liên kết peptid và Asp32 sẽ nhận proton của một trong hai OH- của nhóm gemdiol, dẫn đến sự phân cắt liên kết peptid (III).

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của BACE-1. Asp: aspartat (Nguồn: Barman và cộng
sự (2014) [14]).
1.3.3. Cấu trúc của BACE-1
Nhiều cấu trúc tinh thể của BACE-1 đã đƣợc xác định dƣới dạng có hoặc
khơng có phối tử đồng kết tinh tại vị trí hoạt động của nó. BACE-1 có các đặc điểm
cấu tạo nhƣ sau [105]:
-

Một vùng có hoạt tính protease ở thùy N tận cùng, một chuỗi liên kết,
một vùng xuyên màng, và một vùng nằm trong bào tƣơng.

ho tro tai file :