ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HỮU CƠ LÊN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus Setaceus Blume) TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HỮU CƠ LÊN QUÁ
TRÌNH SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN
(Anoectochilus Setaceus Blume)
TRONG NUÔI CẤY IN VITRO


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AC

: Than hoạt tính

BA

: Benzyl adenine

MS

: Murashige và Skoog, 1962

Mt

: Môi trường

NAA

: Acid α-naphtaleneacetic

NT

: Nghiệm thức

Nd

: Nồng độ

Tg

: thời gian

i


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Bảng kí hiệu nghiệm thức .................................................................................. 6
Bảng 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA ................................................................ 6
Bảng 3: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa và pepton lên cây lan kim tuyến ................ 6
Bảng 4: Khảo sát ảnh hưởng của chất rắn tạo nên quá trình tạo cây hồn chỉnh ............ 7
Bảng 5: Ảnh hưởng của quá trình khử khuẩn lên sự hình thành và phát triển của cây
lan Kim Tuyến ................................................................................................................. 8
Bảng 6: Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên quá trình nhân giống ............................ 9
Bảng 7: Ảnh hưởng của môi trường bổ sung pepton, cao nấm men, nước dừa lên quá
trình sinh trưởng và phát triển của cây lan kim tuyến ................................................... 10
Bảng 8: Ảnh hưởng của các chất tạo rắn lên quá trình tạo cây hồn chỉnh .................. 11

ii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên quá trình nhân giống ............................ 9
Hình 2: Ảnh hưởng của môi trường bổ sung pepton, cao nấm men, nước dừa lên quá

trình sinh trưởng và phát triển của cây lan kim tuyến ................................................... 11
Hình 3: Mơi trường agar ................................................................................................ 12
Hình 4: Mơi trường gelrite ............................................................................................ 13
Hình 5: Mơi trường bơng gịn ........................................................................................ 13
Hình 6: Kích thước mẫu cây.......................................................................................... 14

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................. Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................ii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... iii
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 2
1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến: ............................................................. 2
1.2. Phân loại thực vật: ................................................................................................ 2
1.3. Phân bố: ................................................................................................................ 3
1.4. Tính năng cơng dụng: ........................................................................................... 3
1.5. Phương pháp ni cấy tạo chồi và tạo cây hồn chỉnh in vitro ............................ 3
1.6. Vai trò của chất hữu cơ ......................................................................................... 4
1.6.1. Nước dừa ....................................................................................................... 4
1.6.2. Pepton ............................................................................................................ 4
1.7. Điều kiện thống khí ............................................................................................ 4
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 5
2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................... 5
2.1.1. Nguồn mẫu .................................................................................................... 5
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ............................................................................ 5
2.1.3. Môi trường nuôi cấy ...................................................................................... 5

2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................................................ 5
2.2.1. Khử trùng mẫu ............................................................................................... 5
2.2.2. Khảo sát của auxin và cytokinin lên quá trình nhân giống ........................... 6
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung pepton, nước dừa lên quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây lan kim tuyến ..................................................... 6
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của các chất tạo rắn lên q trình tạo cây hồn chỉnh .. 7
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung thêm pepton lên quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây lan Kim Tuyến in vitro. ............................................. 7
2.2.6. Điều kiện nuôi cấy ......................................................................................... 7

iv


CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 8
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của quá trình khử khuẩn lên sự hình thành và phát
triển của cây lan Kim Tuyến ....................................................................................... 8
3.2. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên quá trình nhân giống .............................. 8
3.3. Ảnh hưởng của mơi trường bổ sung pepton, cao nấm men, nước dừa lên quá
trình sinh trưởng và phát triển của cây lan kim tuyến ............................................... 10
3.4. Ảnh hưởng của các chất tạo rắn lên q trình tạo cây hồn chỉnh ..................... 11
3.5. Kết luận kiến nghị .............................................................................................. 14
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 16

v


Lời mở đầu

LỜI MỞ ĐẦU
Có thể nói trên thế giới, sự đa dạng sinh học có rất nhiều loại sinh vật phong

phú và q hiếm, có những lồi chỉ phân bố ở một số nơi nhất định, có lồi ưu ẩm, có
lồi chịu hạn,.... Việt Nam là một trong những quốc gia củng có nhiều loại sinh vật
quý hiếm có giá trị về dinh dưỡng và có giá trị sinh học cao, ngồi ra cịn có nhiều cây
thuốc có giá trị cao về mặt kinh tế trong việc điều trị bệnh. Về y dược có nhiều loại
cũng có giá trị kinh tế cao, một trong số đó khơng thể khơng nhắc tới nhà họ lan.
khong những có giá trị riêng về mặt y học, lan cịn có giá trị riêng về mặt kinh tế bởi
vẽ đẹp vốn có của nó, có những loại quý hiếm người ta có thể săn lùng lên tới tiền tỉ
một chậu. Mặc khác nói vè y học, các nhà khoa học đã chứng minh vè tác dụng thần
kỳ chữa bệnh của cây lan gấm hay còn gọi là cây lan Kim Tuyến.
Lan Kim Tuyến là một loại thảo dược quý của rừng núi Tây Bắc của Việt Nam.
Lan Kim Tuyến phân bố ở những vùng ẩm thấp cao, được săn lùng với giá trị lên tới
100 triệu 1 kg. Nói về căn bệnh ung thư là một căn bệnh mang nỗi khiếp sợ của con
người vì nó vẫn chưa có thuốc nào rị dứt điểm căn bệnh này, tuy nhiên giai đoạn đầu
nếu phát hiện kiệp thời thì lan Kim Tuyến sẽ mangn lại kết quả khả quan hơn.
Để đáp ứng nhu cầu này thì lan Kim Tuyến đã được những nhà khoa học
nghiên cứu và đem vào nuôi cấy mô để nhân giống số lượng lớn, vừa bảo vệ được cho
giống cây này không bị tuyệt chủng, mà ngược lại giá thành mềm đem lại sự tiếp cận
dể dàng hơn tới người tiêu dùng, nhưng chất lượng vẫn đảm bảo.

1


Chương I. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến:
Lan Kim tuyến (Anoectochilus) được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810
thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài, tại khu vực châu
Á và châu Úc đã phát hiện được 25 loài, nhưng Việt Nam hiện đã thống kê được 12

lồi, trong đó lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ
yếu với công dụng làm thuốc với tác dụng trị bệnh kháng tế bào ung thư đặc biệt của
nó.
Lan kim tuyến là cây thảo, có thân rễ mọc dài,thân trên đất mọng nước mang 2
- 6 lá mọc xoè sát đất. Chiều dài thân rễ từ 5 -12cm, trung bình là 8,5cm. Đường kính
thân rễ từ 2,5 - 3,5mm, trung bình là 3,28mm. Số lóng trên thân rễ từ 3 - 7 lóng, trung
bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1 - 5cm, trung bình là 2,14cm. Thân rễ thường
có màu xanh trắng, đơi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, khơng phủ lông.
Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ. Số rễ trên một cây thường từ 2 - 9 rễ,
chều dài của rễ thay đổi từ 1 - 9cm, rễ dài nhất trung bình là 6,37cm và ngắn nhất
trung bình là 1,04cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 4,07cm.
Lá hình trứng, gần trịn ở gốc, chóp hơi nhọn, lá có màu nâu đỏ ở mặt trên. Hệ
gân lá mạng lưới, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên
và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt,
nhẵn với 5 gân gốc. Số lượng lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6 chiếc, thông thường có
4 lá. Các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt. Chiều rộng trung bình
của các lá trên một cây là 2,5cm.Cuống lá dài 0,6 – 1,2cm, thường nhẵn và có màu
trắng xanh, đơi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn.
Hoa từng chùm mọc ở đầu ngọn thân, trục hoa dài từ 5 - 20cm, thường phủ lông
màu nâu đỏ, mang từ 4 - 10 hoa.
1.2. Phân loại thực vật:
Giới (regnum): Plantae
Bộ (ordo): Asparagales
Chi (genus):Anoectochilus
Họ (familia):Orchidaceae

2


Chương I. Tổng quan tài liệu

Loài (species):A. setaceus
1.3. Phân bố:
Ở Việt Nam hiện nay thống kê được khoảng hơn 15 lồi trong đó chỉ có 2 lồi
là cây thuốc rất quý:
1. Lan gấm ngọc vân bạc (Anoectochilus formosanus Hayata)
2. Lan gấm ngọc vân hồng (Anoectochilus roxburghii).
Các loài này sinh sống dọc theo dãy Hoàng Liên Sơn và dãy Trường Sơn, đặc
điểm là các loài này thường phân bố ở những nơi có độ ẩm thấp cao, có nhiệt độ thấp.
1.4. Tính năng cơng dụng:
+ Tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thơng.
+ Có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính
+ Dùng chữa thần kinh suy nhược,
+ Chữa ho khan,
+ Đau họng,
+ Cao huyết áp,
+ Suy thận,
+ Chữa di tinh,
+ Đau lưng,
+ Phong thấp,
+ Làm tiêu đờm,
+ Giải độc,
+ Giải nhiệt,
+ Giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan
+ Tăng cường sức khỏe, chủ trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan,
+ Vết thương do rắn cắn, còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt,
+ Trẻ con chậm lớn, suy thận,
+ Rượu lan gấm là tiên tửu có tác dụng hỗ trợ điều trị yếu sinh lý, hiếm muộn.
1.5. Phương pháp nuôi cấy tạo chồi và tạo cây hồn chỉnh in vitro
Quả Lan kim tuyến già (có màu nâu đỏ) được rửa dưới vòi nước chảy, ngâm

trong dung dịch xà phịng lỗng, rửa sạch xà phịng. Khử trùng bằng dung dịch HgCl2
0,1% và dung dịch natri hypochlorid 20% với thời gian khác nhau. Tráng lại quả bằng
nước cất vơ trùng 3 ÷ 5 lần, thấm khơ quả bằng giấy thấm vô trùng. Tách đôi quả lấy
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

3


Chương I. Tổng quan tài liệu

phôi cấy vào môi trường ni cấy khởi đầu (Bảng 1). Sau 2 ÷ 4 tuần nuôi, phôi nảy
mầm tạo thể chồi; cấy chuyển thể chồi sang các môi trường nhân nhanh thể chồi. Cấy
chuyển thể chồi sang các môi trường tạo chồi, cấy chuyển chồi sang các môi trường
nhân nhanh chồi. Tách riêng từng chồi để cấy chuyển sang mơi trường kích thích tăng
trưởng chồi. Chọn những chồi có chiều cao ≥ 3 cm cấy sang mơi trường tạo rễ.
1.6. Vai trị của chất hữu cơ
1.6.1. Nước dừa
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất
kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Nước dừa đã được sử dụng để
kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được lấy
từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa
được một số cơng ty hố chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản.
1.6.2. Pepton
Ảnh hưởng của peptone lên sự tạo chồi và rễ in vitro từ đoạn thân non hoặc
thân trưởng thành được nghiên cứu. Cả mẫu trưởng thành và mẫu non đã được sử dụng
để nghiên cứu ảnh hưởng của peptone khi tái sinh chồi. Các mẫu vật sẽ bị hoại tử nếu
khơng có mơi trường MS hoặc với các chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật. Trong
môi

trường

MS

bổ

sung

cả

peptone

và

benzyladenine

hoặc

acid

dichlorophenoxyacetic, các mẫu tồn tại nhưng chậm lại đáng kể trong q trình tạo
chồi. Thêm peptone vào mơi trường với lượng tối ưu là 2.0% (w / v) gây ra sự hình
thành chồi. Sự hình thành chồi cũng xảy ra ở các phần thân từ mẫu trưởng thành
nhưng tỷ lệ tái sinh vẫn còn thấp. Tất cả các chồi xuất phát từ thân non sẽ hình thành
rễ trên mơi trường bổ sung với peptone và axit naphthaleneacetic.
1.7. Điều kiện thống khí
Các bịch dùng để ni cấy phải được thiết kế các màng lọc thống khí nhưng
điều kiện phải ngăn chặn được sự xâm nhập của vi khuẩn từ môi trường bên ngồi, có
tác dụng trao đổi khí với mơi trường bên ngồi. Nếu các bịch dùng trong mơi trường
ni cấy khơng duocdj thiết kế các màng lọc thống khí sẽ ngăn ngừa được sự xâm
nhập của vi khuẩn nhưng đồng thời củng ngăn ngừa sự trao đổi thoát hơi nước của

cây, q trình này khiến rể bị tích nước làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của mơ và q trình quang hợp của mẫu cấy.

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

4


Chương II. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguồn mẫu
Nguồn mẫu của cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) có tại viện
sinh học phân tử. Giống cây được cấy chuyển nhiều lần đẻ tạo ra chồi có kích thước
phù hợp và được sử dụng trong quá trình nghiên cứu này.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
Thiết bị: Nồi hấp vơ trùng, tủ cấy vơ trùng, cân điện tử, hóa chất, máy đo pH.
Dụng cụ: Dao cấy, panh cấy, đĩa cấy, ống nghiệm thủy tinh, bịch ni cấy có
màng thống khí, ghim cố định, găng tay, khẩu trang y tế, giá để vật mẫu, đèn có ánh
sáng trắng.
Hóa chất: Các khống chất đa lượng, khống vi lượng, vitamin, NAA, BA.
Chất hữu cơ: giá, khoai tây, cà rốt.
2.1.3. Mơi trường ni cấy
Mơi trường ni cấy có bổ sung agar, đường, AC.
Các chất điều hòa sinh trưởng gồm có BA và NAA, các chất hữu cơ gồm có
pepton, nước dừa.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khử trùng mẫu

Mẫu được rửa trong nước xà phòng rửa chén nồng độ 10ml/l lắc trên máy lắc
30p
Các nghiệm thức khảo sát
- Không tráng qua cồn
- Tráng qua cồn 20s
- Tráng qua cồn 40s
Tiếp tục rửa bằng nước javen với các nồng độ 1%, 2%, 3%

5


Chương II. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Bảng 1: Bảng kí hiệu nghiệm thức
Tg tráng cồn

20s

40s

1%

a1.1

a2.1

2%

a1.2

a2.2

3%

a1.3

a2.3

Nd Javen

Mỗi nghiệm thức đánh giá 10 mẫu
Đánh giá tỉ lệ sống, tỉ lệ nhiễm
2.2.2. Khảo sát của auxin và cytokinin lên quá trình nhân giống
Auxin đươc sử dụng trong nghiệm thức này là NAA lần lượt ở các nồng độ 0,
0.1, 0.5 (mg/l) kết hợp với cytokinin kết hợp với BA ở các nồng độ 0, 0.5, 1, 2 (mg/l).
Bảng 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA
NAA

0

0.1

0.5

0

b01

b11

b21

0.5

b02

b12

b22

1

b03

b13

b23

2

b04

b14

b24

BA

Tốc độ nhân nhanh được đánh gia trên số chồi một mẫu
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung pepton, nước dừa lên quá trình

sinh trưởng và phát triển của cây lan kim tuyến
Mẫu được nuối cấy bổ sung trên môi trường MS bổ sung 0.1 mg/l NAA, 1mg/l
BA, 3mg/l đường sucrose, 7g/l agar điều chỉnh ph=5.8, bổ sung thêm pepton, nước
dừa theo các nghiệm thức sau:
Bảng 3: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa và pepton lên cây lan kim tuyến
pepton 1g/l

c1

pepton 2g/l

c2

nước dừa 100ml/l

c3

nước dừa 200ml/l

c4

pepton 1g/l+100ml/l nước dừa

c5

Đánh giá ảnh hưởng của các chất trên dựa trên cân nặng, số chồi/mẫu của mẫu
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

6

Chương II. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của các chất tạo rắn lên q trình tạo cây hồn chỉnh
Các chồi thu được từ các nghiệm thức nhân nhanh, được tách ra và cấy trên môi
trường MS bổ sung 30g/l đường, 0.5 g/l than hoạt tính, chất tạo rắn được khảo sát như
sau
Gelrite: 3g/l
Agar:7g/l
Bơng gịn: thể tích bơng gịn bằng thể tích mơi trường lỏng
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung thêm pepton lên quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây lan Kim Tuyến in vitro.
Mục đích tiến hành thí nghiệm: để khảo sát nồng độ ảnh hưởng của giá lên quá
trình sinh trưởng và phát triển của cây lan Kim Tuyến.
Quá trình tiến hành: các chồi đơn(cao khoảng 2cm) đươcc tách và ni cấy trên
mơi trường có bổ sung thêm 0.5mg/L NAA, 1mg/L BA, và được bổ sung thêm giá
được xay nhuyển và ép lấy nước theo nồng độ (0g/L, 0.5g/L, 1g/L, 1.5g/L, 2g/L).
Bảng 4: Khảo sát ảnh hưởng của chất rắn tạo nên q trình tạo cây hồn chỉnh
Nghiệm thức

Loại và nồng độ chất hữu cơ
Giá (g/L)

1

0

2

0.5

3

1

4

1.5

5

2

Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/mẫu, chiều cao(cm), khối lượng tươi(gam), số lá/cây,
số rễ/cây, độ rộng mặt lá(cm) sau 3 tháng.
2.2.6. Điều kiện nuôi cấy
Các mẫu cây phải được ni cấy ở nơi có bóng râm, nhiệt độ ẩm thấp cao, phải
được tưới phun sương 3/5 lần trong ngày để duy trì độ ẩm.
Điều kiện là khơng được để cây q khơ, vì đây là lồi cây ưa ẩm có chịu thích
nghi với mơi trường có khí hậu ẩm ướt.

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

7


Chương III. Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của q trình khử khuẩn lên sự hình thành và
phát triển của cây lan Kim Tuyến
Sau một tháng nhập mẫu tỉ lệ mẫu nhiễm và mẫu sống có bậc chồi tại mắc mũ
thể hiện ở bảng sau:
Bảng 5: Ảnh hưởng của quá trình khử khuẩn lên sự hình thành và phát triển của
cây lan Kim Tuyến
Tg tráng cồn 20s

40s

NĐ javen

tỉ lệ nhiễm

tỉ lệ sống

tỉ lệ nhiễm

tỉ lệ sống

1%

a1.1 7/10

a1.1 10/10

a2.1 7/10

a2.1 6/10

2%

a1.2 2/10

a1.2 9/10

a2.2 2/10

a2.2 5/10

3%

a1.3 2/10

a1.3 5/10

a2.3 2/10

a2.3 3/10

Theo bảng trên ta có thể nhận thấy tỉ lệ mẫu nhiễm tỉ lệ nghịch với thời gian xử
lí qua cồn và nồng độ javen, cồn có khả năng giết chết khuẩn và đẩy nước ra khỏi mẫu
nên có khả năng len lỏi vào các nách lá giúp diệt khuẩn sau. Tuy nhiên khi xử lí cồn ở
thời gian lâu thì mẫu mất nước nhiều và dẫn tới tỉ lệ mẫu chết cao, tuy nhiên cồn
khơng có khả năng diệt bào tử nấm, thể hiện rõ ở nghiệm thức kết hợp với nồng độ
javen thấp, mẫu bị nhiễm do nấm cao hơn. Ngược lại javen vừa có khả năng diệt
khuẩn và bào tử nấm đặc biệt ở nồng độ trên 2%, nhưng ở nồng độ javen quá cao thì tỉ
lệ mẫu chết cao do javen ăn sâu vào mẫu. Ở nồng độ javen trên 2% vẫn có một tỉ lệ
nhỏ mẫu nhiễm khuẩn, nguyên nhân có thể là do khuẩn tồn tại trong mạch dẫn. Dựa

vào bảng trên ta có thể thấy việc khử trùng tốt nhất là kết hợp vào mẫu nhanh qua cồn
trong thời gian 20 giây, sau đó rửa mẫu qua javen 2% trong 10 phút rồi tráng lại ba lần
bằng nước cất vô trùng rồi cắt bỏ phần mẫu chết do khử trùng trước khi cấy vào môi
trường.
3.2. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên quá trình nhân giống
Mẫu sau hai tháng cấy trên môi trường giữa BA và NAA cho thấy sự đa chồi rõ
rệt thể hiện ở bảng sau:

8


Chương III. Kết quả và thảo luận

Bảng 6: Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên q trình nhân giống
0

NAA
kí hiêu
BA

mt

0.1
số chồi
trên 1

kí hiêu

mẫu

mt

0.5
số chồi
trên 1
mẫu

kí hiêu
mt

số chồi
trên 1
mẫu

0

b0.1

1

b1.1

1

b2.1

1

0.5

b0.2

1.2

b1.2

1.3

b2.2

1.2

1

b0.3

3.4

b1.3

3.8

b2.3

3.0

2

b0.4

3.8

b1.4

3.9

b2.4

2.8

Ở bảng trên cho thấy ở nồng độ BA lớn hơn hoặc bằng 1mg/l cho tỉ lệ đa chồi
hơn hẳn. Mặc khác việc kết hợp với NAA ở nồng độ thấp sẽ tăng hiệu quả nhân nhanh
và kích thước chồi lớn hơn. Tuy nhiên ở nồng độ NAA cao hơn hoặc bằng 0,5mg/l
mẫu tiếc ra phenol gây hóa nâu mơi trường làm đen gốc ức chế sự phát triển của mẫu,
còn ở nồng độ BA 2mg/l mẫu có tỉ lệ đa chồi cao nhưng chồi bị ngắn khó tách tạo cây
hồn chỉnh, ngồi ra một số mẫu sẽ có dấu hiệu đột biến dính nhiều chồi.

Hình 1: Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên quá trình nhân giống

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

9


Chương III. Kết quả và thảo luận

3.3. Ảnh hưởng của môi trường bổ sung pepton, cao nấm men, nước dừa lên quá
trình sinh trưởng và phát triển của cây lan kim tuyến
Các chất hữu cơ bổ sung vào môi trường củng thể hiện rõ hiệu quả của nó qua
bảng sau:

Bảng 7: Ảnh hưởng của môi trường bổ sung pepton, cao nấm men, nước dừa lên
quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan kim tuyến
Kí hiệu mt

Số chồi(chồi/mẫu)

Cân nặng (g/mẫu)

Pepton 1g/l

c1

3.7

0.75g

Pepton 2g/l

c2

3.2

0.42g

Nước dừa 100ml/l

c3

3.9

0.84g

Nước dừa 200ml/l

c4

3.8

0.67g

c5

3.9

1.01

Pepton 1g/l+100ml/l
nước dừa

Việc bổ sung pepton vào môi trường giúp chồi mập hơn tuy nhiên lá nhỏ. Ở
nồng độ pepton lớn hơn hoặc bằng 2g/l mẫu tiếp xuc phenol gây hóa nâu mơi trường.
Hiện tượng này không bổ sung trên môi trường bổ sung nước dừa, ở nồng độ 100ml/l
nước dừa là thích hộ nhất, nhưng sự kết hợp nước dừa 100ml/l và pepton 1g/l cho kết
quả vượt trội hơn hẳn, việc này thể hiện qua tỉ lệ đa chồi cao hơn, chồi có thân và lá
mập hơn.

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

10

Chương III. Kết quả và thảo luận

Hình 2: Ảnh hưởng của môi trường bổ sung pepton, cao nấm men, nước dừa lên
quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan kim tuyến
3.4. Ảnh hưởng của các chất tạo rắn lên q trình tạo cây hồn chỉnh
Các chất tạo rắn khac nhau củng ảnh hưởng đáng kể đến quá trình tạo cây hoàn
chỉnh được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 8: Ảnh hưởng của các chất tạo rắn lên quá trình tạo cây hồn chỉnh
Cân nặng

Chiều cao

(g/mẫu)

(cm)

Gelrite 3g/l

0.65(g/mẫu)

Agar 7g/l

Thí nghiệm

Bơng gịn
40g/l

Số rể

Chiều dài

8.9cm

1.8

1.1

0.51(g/mẫu)

7.1cm

1.5

0.7

0.77(g/mẫu)

9.9cm

2.2

1.3

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

11


Chương III. Kết quả và thảo luận

Sau ba tháng cấy trên các môi trường bổ sung trên các chất tạo rắn khác nhau
cho thấy môi trường lỏng với giá đở là bơng gịn cho thấy hiệu quả vượt trội hơn hẳn.
cây hấp thu dinh dưỡng tốt hơn do các chất khống linh hoạt hơn trong mơi trường
lỏng. Mặc khác bơng gịn củng tạo một độ thống khí phù hợp trên bề mặt giúp rể phát
triển dài hơn. Cây phát triển trên bề mặt có gelrite cây củng phát triển khá tốt tuy nhiên
giá thành gelrite khá cao.

Hình 3: Mơi trường agar

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

12


Chương III. Kết quả và thảo luận

Hình 4: Mơi trường gelrite

Hình 5: Mơi trường bơng gịn
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

13


Chương III. Kết quả và thảo luận

Hình 6: Kích thước mẫu cây
Theo các kích thước từ trái sang phải lần lượt là gelrite, agar, bơng gịn.
3.5. Kết luận kiến nghị

Dựa vào các kết quả của các thí nghiệm trên tơi có thể đưa ra được quy trình
nhân giống cây lan kim tuyến như sau:
Mẫu được thu hái ngoài tự nhiên sau khi được thuần hóa, để mẫu vóng cao rồi
đưa đi khử trùng bằng cách lắc nhanh qua cồn 70 độ trong 2 giây rồi đưa qua dung
dịch javen 2% bổ sung 0.05% tween 80 trong 10p cho ra tỷ lệ mẫu sống cao và số mẫu
nhiễm thấp, tiếp đó mẫu được nhân nhanh trên môi trường MS bổ sung 1BA, 0.1
NAA, 100ml/l nước dừa+1g/l pepton+30g/l đường cho tốc độ nhân nhanh cao nhất,
chồi đạt chất lượng tốt nhất, những chồi này tiếp tục được tách và tạo cây hoàn chỉnh
là mơi trường MS có bổ sung 0.5g/l than hoạt tính, 30g/l đường và giá đở là bơng gịn
cho chất lượng cây tốt hơn hẳn.

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

14


Chương III. Kết quả và thảo luận

Vì thời gian có hạn tơi khơng có đủ thời gian tiến hành khảo sát cây ngồi vườn
ươm. Tơi kiến nghị khảo sát các loại giá thể như vỏ thông, dớn, sơ dừa, rong thủy đài
để ươm giống lan Kim Tuyến invitro.

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hữu Hải Đăng

15


Tài liệu tham khảo

TÀI LIỆU THAM KHẢO

/> /> /> /> /> />IM_TUYEN_ANOECTOCHILUS_SETACEUS_BLUME_BANG_KY_THUAT_NU
OI_CAY_IN_VITRO
/> /> /> /> /> /> />
16