Tài liệu Tiểu luận:Thu nhận và tinh chế enzyme ppt

Trường ĐH Nông Lâm Tp HCM
Bộ môn Công nghệ sinh học
Lớp DH06SH




CHỦ ĐỀ
:










GVHD: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
SVTH: BÙI THỊ HỒNG GẤM
MSSV: 06126031

[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


1




MỤC LỤC
YZ


I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 2
1. Định nghĩa 2
2. Tính chất của enzyme 2
II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ 3
1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế enzyme 3
2. Thu nhận enzyme thô 5
III. TINH SẠCH ENZYME 6
1. Các phương pháp tủa protein/enzyme 6
2. Sự thẩm tách 8
3. Sắc ký 8
4. Phương pháp dùng chất h

ấp phụ 14
IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYEM 15
V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME 15
1.Xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan 15
2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel 16
3. Phương pháp siêu ly tâm 17
4. Kỹ thuật khối phổ 18
VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 18
VII. TỔNG KẾT 19








[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


2

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song
chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Ðó là các quá trình
lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản
chất enzyme và các quá trình lên men. Cho đến nữa đầu thế kỷ XIX các nhà khoa học đã khái
quát được quá trình lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống và vai trò qua tr
ọng của
enzyme trong chuyển hoá các chất trong quá trình lên men.

Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên
qui mô công nghiệp, hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên
300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên
thị trường thế giới, các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase,
glucoseoxydase, cellulase, lipase…Các chế phẩm này đã được khai thác và tinh ch
ế có mức độ
tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng.
Đến nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới với sự kết hợp nhiều
ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên
cứu cũng như thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng những phân tử enzyme ưu
việt hơn dạng tự nhiên. Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụ
ng trong y học mà còn được
ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… Do
vậy, quá trình thu nhận và tinh sạch protein/enzyme giữ vai trò cực kỳ quan trọng và không
ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất để phụ vụ cho con người.
TÓM TẮT
Enzyme bản chất là protein được thu nhận từ ba nguồn: động vật , thực vật, vi sinh vật.
Do đó rất đa dạng về cấu trúc, tính chất, chức năng…Nên việc thu nhận và tinh chế enzyme khá
phức tạp vì quá trình tinh chế dựa vào đặc điểm cấu tạo, tính chất của từng loại enzyme mục
tiêu, và phải trải qua nhiều công đoạn khác nhau tùy từng loại enzyme. Tuy vậy, các quá trình
tinh sạch enzyme vẫn ứng d
ụng các phương pháp cơ bản sau: thu dịch chiết (cơ học, lý , hoá),
tủa ( bằng muối, dung môi hữu cơ, điểm đẳng điện), thẩm tách, từng bước tinh sạch bằng sắc ký
( sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp), kết tinh chế phẩm, đánh giá kết quả
tinh sạch và kiểm tra hoạt tính enzyme: xây dựng đường biểu diễn về độ hoà tan, điện di (điện
di một chiều, điện di dựa vào điểm đẳng điện, điện di hai chiều, điện di mao dẫn), siêu ly tâm,
khối phổ,
I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME
1. Định nghĩa
Enzyme (E) là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức

đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. E có tất cả trong tế bào sống, là các chất xúc tác
sinh học. (CNSH Enzyme và Ứng Dụng - Phạm Thị Trân Châu,Phan Tuấn Nghiã).
Trong phản ứng E xúc tác các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất
(substrate), E sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. E có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất
cả các chất xúc tác h
ữu cơ và vô cơ khác. E không chỉ có thể xúc tác các phản ứng trong cơ thể
sống , mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều
kiện nhất định.Có trên 4000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym [1]. E có tính đặc hiệu
cao, nghĩa là mỗi E chỉ tác dụng trên một hay một số S (cơ chất ) nhất định ở nhiệt độ và áp suất
bình thường.
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


3

2. Tính chất của enzyme
1. Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số E có
dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn.
2. Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong ete và các dung môi
không phân cực.
3. Không bền dưới tác dụng của nhiệt, nhiệt độ cao E bị biến tính. Môi trường axít hay
bazơ cũng làm E mất khả năng hoạt động.
4. Enzym có tính lưỡng tính: Tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các d
ạng: cation, anion
hay trung hòa điện.
5. Enzym chia làm hai nhóm: E một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase và các
E hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein).
 Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần:
• Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu.
• Coenzym: Phần không phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bản chất là

những hợp chất hữu cơ phức tạp
II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ
1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế E
Như đã nói ở trên, E là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và rất không ổn định.
Trong những điều kiện bất lợi rất không bền, có thể dễ bị biến tính (denaturation) và bị mất
hoạt độ. Do đó, khi làm việc với E phải chú ý tránh làm mất hoạt tính của nó. Thông thường
phần lớn E hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7+
2). Vì
vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh đều dễ gây biến tính E.
Nhiệt độ cao và các chất oxy hoá và chất khử, …cũng là một trong số những nguyên
nhân gây biến tính E. Tuy nhiên các E khác nhau có thể nhạy cảm với những tác nhân gây
biến tính khác nhau.
Vì thế, khi tách và tinh sạch E cần tiến hành ở nhiệt độ thấp từ 0
o
C đến 5
o
C. Đối với các
E không bền quá trình tinh sạch được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn từ -5
o
C đến
-20
o
C. Trong trường hợp này người ta sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO
2
hoặc
nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc…
Bảng 1:
Hỗn hợp làm lạnh

Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được

Nước đá : muối 100:33 (3:1) -21,3
o
C
Nước đá : H
2
SO
4
đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0
o
C

Tiến hành tinh sạch ở nhiệt độ thấp vừa hạn chế biến tính E cũng như tác dụng phân giải
của các E proteolytic có mặt trong dịch chiết. Đối với nhiều E có thể bổ sung chất ức chế
của E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thủy phân đối với E quan tâm. Các E
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


4

proteolytic được phân thành 4 lớp: protease serin, protease cystein, protease acid, protease
chứa kim loại.
Trên cơ sở 4 lớp của protease này, người ta cũng chia chất ức chế của E này thành 4 lớp
tương ứng. chất ức chế hai E protease serine và protease cystein được sử dụng nhiều do sự
phổ biến của hai E này. Đối với một số E nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả 4
loại chất ức chế đều được sử dụng.
Bảng 2:
Một số chất ức chế E proteolytic thường dùng trong tách chiết, tinh sạch
protein/E

Chất ức chế

Nồng độ và
thời gian
hiệu quả
Dung môi pha dung
dịch gốc và nồng độ
chất ức chế
Điều kiện và thời
gian bảo quản ở
dạng dung dịch gốc
E proteolytic bị ức chế
Phenyle methyl
sulphonyl
fluoride (PMSF)
0,1-1mM
vài giờ
100mM
trong ethanol hoặc
isopropanol
2-3 tháng ở nhiệt độ
phòng
Protease serine
Leupeptin 10-100μM
10mM
trong H
2
O
1 tuần ở 4
o
C hoặc 1
tháng ở -20

o
C
Protease kiểu trypsin
và một số kiểu
protease cystein
Iodoacetic acid
hay iodoacetate
(IAA)
10-100μM
vài giờ
100mM
trong H
2
O
Chỉ chuẩn bị trước
khi dùng
Protease cystein
Ethylene diamine
tetra acetic acid
(EDTA)
1-2mM,
lâu dài
500mM
pH 8,0
6-12 tháng ở nhiệt
độ phòng
Protease chứa kim
loại (trừ loại chứa
Ca
2+

thì phải dùng
EGTA)
Pepstain A
1μM
vài giờ
1mM
trong tanol
3-4 tháng ở -20
o
C Một số protease acid

Bổ sung các yếu tố làm bền (như CaCl
2
hay MgCl
2
với nồng độ 2-5mM, glycerol 10-
20% ), chất chống oxy hoá (β-mercaptoethanol hay dithiothreitol 1-5mM…).
Xây dựng quy trình đơn giản cũng là cách để bảo toàn hoạt tính E. Đối với một số E bền
nhiệt thì có thể dùng bước xử lý nhiệt (70-80
o
C, trong vòng 15-30 phút) và xử lý acid (pH
3-4) đối với các E bền acid nhằm hạn chế tác dụng phân cắt của proteolytic, vừa loại bỏ một
số protein không mong muốn.
Tránh tạo bọt khí vì nhiều E sẽ biến tính ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Để tránh
bọt khí. Chỉ sử dụng các gụng cụ inox để cắt xay nguyên liệu để tránh tác dụng của kim loại
nặng làm mất hoạt tính E.

[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009

5

2. Thu nhận enzyme
a . Chọn nguồn nguyên liệu
Việc điều chế chúng bằng phương pháp hoá học rất khó khăn và tốn kém, nên người ta
thường thu nhận chúng từ nguồn nguyên liệu sinh học. Có 3 nguồn nguyên liệu sinh học:
 Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim…dùng để tách E rất thuận lợi. Dịch tuỵ
tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease, và một số E khác.
Ví dụ
: Renin tách từ dạ dày bê nghé làm đông sữa trong sản xuất fomat.
 Thực vật: Thông thường E có mặt nhiều ở cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự
trữ giàu chất gì thì nhiều E chuyển hoá chất ấy.
Ví dụ:
hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu nành có nhiều E urease, papain
thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ các bộ phận cây dứa, fixin tách từ dịch ép của thân
và lá cây Ficus…
Tuy nhiên từ nguồn nguyên liệu động thực vật thì không thể sản xuất chế phẩm E với
quy công nghiệp bởi các nhược điểm:
- Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài
- Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được
- Đây là ngu
ồn nguyên liệu dùng làm thực phẩm không thể dùng để sản xuất sản
phẩm ảnh hưởng an ninh lương thực.
 Vi sinh vật: Là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất E có nhiều ưu điểm nổi bật, là nguồn
nguyên liệu vô tận, có thể chủ động tạo ra được.Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn
(16-100 giờ). Hệ E vi sinh vật vô cùng phong phú. Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ
kiếm và rẻ.
E vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, trong vòng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hoá một
lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng cơ thể chúng.
b. Thu dịch chiết E thô

Các E nội bào không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu trúc tế bào
chứa chúng. Do đó, để chiết rút E nội bào thì điều trước tiên ta phải phá vỡ cấu trúc tế bào
có chứa E và chuyển chúng và dung dịch.
Biện pháp cơ học như nghiền tế bào với cát thuỷ tinh hay cát thạch anh, làm đồng hoá
bằng thiết bị đồng hoá (homogenizator). Đối với mô thực vật thì ta thường thái nhỏ mẫu
hoặc cho trương nước để
tăng hiệu quả phá vỡ tế bào. Còn ở mô động vật khi chiết E người
ta cần cắt bỏ mô liên kết.
Đối với các E trong cấu tử ( nhân, microsome, ty thể, lyosome…) tế bào, để thu nhận
dịch chiết E ta có thể dùng các yếu tố vật lý và hoá học khác như sóng siêu âm, máy nén,
sốc nhiệt, dùng E (lyoyme, mutanolizin), dung môi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethyl
acetate…), chất detergent. Các chất này có tác dụng tốt trong phá vỡ cấu tử tế bào do trong
các bào quan này thường có chứa nhiều mỡ.
Sau khi đã phá v
ỡ cấu trúc tế bào, E được chiết bằng nước cất, dung dịch đệm hoặc
muối trung tính.
* Một số lưu ý khi chiết rút E
+ Chiết rút và kết tủa E ở nhiệt độ thấp ( 3 - 5
o
C )
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


6

+ Các thao tác phải nhanh
Một số chất điện ly được thêm vào để tăng hiệu quả chiết rút E như NaCl, ZnCl
2
,
CaCl

2
…
* Lưu ý
: Các nguyên liệu động vật, thực vật thường có mặt những chất có màu làm ảnh
hưởng đến việc làm sạch và xác định hoạt lực của E, nên ta thêm vào chất khử để loại màu.
Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để tăng nồng độ E, hoặc bổ sung các tác
nhân gây kết tủa protein/E để loại một số chất không mong muốn, sau đó hoà tan E trong
một thể
tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp.
III. TINH SẠCH ENZYME
Thu nhận E dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Hỗn hợp chứa E
sẽ phải trải qua nhiều công đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên đặc tính nhất định để thu
được một E tinh sạch. Sau mỗi bước thu nhận ta đều phải tiến hành xác định hoạt tính và
nồng độ E để đảm bảo hiệu quả tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa, màng
bán dẫn, sắc ký.
1. Các phương pháp tủa protein enzyme
Có nhiều phương pháp khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc
thay đổi pH của dung dịch có chứa protein/E, dùng nhiệt. Trong đó tủa bằng muối được sử
dụng nhiều nhất.
a. Tủa bằng muối
Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của
protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ
muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out), mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một
nồng độ nhất định. Lượng muối có thể được loại bỏ thông qua bướ
c thẩm tách.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:
log S = B - KI
Trong đó
S: độ hòa tan của protein

B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của
protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn
hợp và lượng muối có trong dung dịch)
I: cường độ ion của muối.
Hình1. Độ tan theo nồng độ muối
( />)
Khả năng tủa protein phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ
thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng
muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống.
Hiệu quả tủa protein/E của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ
tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate >
thiocyanate.
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


7

Để tủa E từ dịch chiết thô ta có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là
ammonium sulfatese (NH
4
)2SO
4
, do nó có độ hoà tan rất cao trong nước (720g/l,nhiệt độ
25
o
C), ít làm mất tác dụng E thậm chí còn có tác dụng làm bền E. Ngoài ra ammonium
sulfatese có khả năng tủa chọn lọc protein, do đó giúp loại một số protein không mong
muốn ra khỏi dịch chiết.
Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hòa

+ Dạng bột:
Người ta cho từng ít một vào dịch chiết E. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết
tủa ban đầu của E. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để
đảm bảo sự
hòa tan của muối.
0,515 x V (S
2
-S
1
)
X(g) =
1-0,272S
2

+ Dịch bão hòa:
Cho dung dịch (NH
4
)2 SO
4
vào dịch chiết E thì độ (NH
4
)2 SO
4
không tăng dột ngột. Sau
khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa
hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết được lấy ra
bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm
ion Ca

++

làm bền (CaCl
2
hoặc Ca(COOH)2). Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương
pháp thẩm tích. Thời gian thẩm tích thường là 24 - 28h, nước thay càng nhiều càng nhanh
càng tốt. Có thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất của dextran. Ưu
thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm mất
hoạt độ E. Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, các E có trọng lượng phân tử lớn
xuống trước. Giai đ
oạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng. Chuyển trạng thái từ dịch
nước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng.
Ví dụ:
Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH
4
)
2
SO
4
bão hòa hoàn toàn,
còn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hòa của dung dịch muối này. Ðiều đó nói
lên tính kết tủa lựa chọn của (NH
4
)
2
SO
4
cao hơn các muối khác.
100 ( S
1
-S

2
)
V (ml) =
1-S
2

* Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfatese
+ Cho muối vào dung dịch E một cách từ từ, đồng thời khuấy đều để tránh tăng nhanh
cục bộ nồng độ muối dẫn đến mất tính kết tủa chọn lọc, thậm chí làm mất hoạt tính E.
+ Sử dụng muối ammonium sulfatese mất nhiều thời gian và cần phải ly tâm tốc độ cao
và ở nhiệt độ thấp để tách protein tủa.
b. Tủa bằng các dung môi hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan
của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các
bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá
trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp, trừ một số
dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl sulfoxide (DMSO) và
ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao.
Ethanol hay aceton thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch. Sự kết tủa
có thể có tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được tủa bằng các
nồng độ khác nhau của dung môi (nồng độ dung môi thường chiếm 80% (v/v) trở lên). Sau
X: khối lượng (NH
4
)
2
SO
4

S1: độ bão hoà cho trước
S2: độ bão hoà cần thiết

V: thể tích (NH
4
)
2
SO
4

S1: độ bão hoà cho trước
S2: độ bão hoà cần thiết
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


8

đó dung môi được loại bằng cách cho bay hơi trong chân không hay thậm chí trong không
khí.
Phương pháp này cũng tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5
o
C trở xuống). Dùng dung môi
hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0
o
C và có thể đến – 20
o
C, như vậy nó có tác
dụng tốt đến độ ổn định của protein E. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi
dung môi bằng tách dùng máy ly tâm. Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối,
nhưng có nhược điểm là hay có màu.
Ví dụ:

Hình 2
: Mức tinh sạch và hiệu suất thu hồi protease có trong dịch trích từ
ruột cá Basa khi sử dụng các tác nhân kết tủa khác nhau
(Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti)-TrầnQuốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn -
Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM)
c. Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện
Khi pH của môi trường thay đổi, mức độ tủa của protein cũng thay đổi.
+ pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton).
+ pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi
proton (mất H
+
).
+ Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này
làm giảm tính tan của protein vì protein không còn
khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân
tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Hiện tượng
này được giải thích bằng phương trình Cohn.
Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác
nhau thay đổi theo pH.
Hình 3:
Tỷ lệ protein tủa theo pH
( /> )
Phương pháp này thường dùng cho các protein
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


9

đậu nành (có pI= 4.6)
d. Dùng nhiệt

Ngoài ra có thể dùng nhiệt để loại bỏ các protein E tạp ra khỏi dịch chiết E. Tuy nhiên
phương pháp này ít đuợc dùng vì hiếm E bền với nhiệt.
2. Sự thẩm tách
Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường là các tạp chất cóphân tử lượng thấp, người
ta thường dùng phương pháp thẩm tích(dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng
hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch E vào túi
colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi
vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M
chẳng hạn). Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các ch
ất có phân tử
nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trong
màng là các chất protein có phân tử lớn.






3. Sắc ký

Sắc ký là phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp
với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng định lượng và định tính.
Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Tùy vào loại mẫu cần phân
tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha tĩnh và pha động.Bốn
phương pháp được ứng dụng nhi
ều nhất trong tinh sạch E là:
o Sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy)
o Sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy)
o Sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity
chromagraphy)

o Sắc ký lỏng cao áp dựa vào
kích thước của phân tử nhưng
có độ phân giải cao nhờ vào áp
suất (high pressure liquid
chromagraphy).





Hình 4: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4
trong kết tủa protein
Túi cellophane
Đệm phosphate
có pH = 7, nồng
độ 0,01M
Hình5: Hai phương pháp
sắc ký cơ bản
A: Sắc ký trao đổi ion, dựa
vào sự tích điện của protein
B: Sắc ký phân loại kích
thước, dựa vào kích thước
protein
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


10

a. Sắc ký trao đổi ion
Nguyên tắc: là dựa vào điện tích thực của E tại một điểm pH nhất định (trừ điểm đẳng
điện) ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất
định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử mục tiêu mang điện tích trái dấu với
chúng.
Gel trao đổi ion được tổng hợp bằng cách gắn một nhóm chức tích đi
ện lên chất nền
cellulose, sephadex, sepharose, molselect…có 2 loại gel trao đổi ion: Trao đổi anion
(anionit) và trao đổi cation (cationit). Một số nhóm chức tích điện dương như DEAE
(diethyaminoethyl), QAE (quaternary aminoethy)…Hoặc tích điện âm như CM (carboxyl
methyl), SP (sulphoropyl)…Tuỳ theo nhóm chức tích điện gì mà chúng sẽ trao đổi ion trái
dấu với nhóm chức, ví dụ: DEAE trao đổi ion tích điện âm (-), CM hay SP thì ion trao đổi
tích điện dương (+).
Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái
dấu bị
giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động,
những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ái lực liên kết
giứ protein/E phụ thuộc vào mức độ tích điện của các phân tử trong mẫu và chúng được đẩy
ra và rửa chiết (eluted) ra khỏi gel nhờ sự thay đổi muối hay pH của môi trường. Ví dụ,
trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung d
ịch
tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó,
những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về
điện tích.
Sắc ký trao đổi ion thường dùng ở bước tinh sạch đầu tiên để sơ bộ phân tách các
protein khác nhau nhằm thu nhỏ thể tích mẫu khi việc tủa protein bằng các dung môi hữu cơ
hay ammonium sulfate còn nhiều bất tiện.

Ví dụ: Mẫu E
Hình6: Minh họa sắc ký trao đổi ion

Hình 7: Minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc
ký trao đổi ion
(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion â
m
với dung dịch đệm. Protein tích điện âm cũng ion
dương tương tác với nó
(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những io
n
âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion
dương tương tác với protein
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


11

Hình 9: Hình minh hoạ sắc ký lọc gel
urease đậu nành sau khi tinh sạch bằng phương pháp tủa phân đoạn sunfatamon qua thẩm tích
đối nước và qua cột trao dổi ion DEAE – cellulose, dùng hệ đệm phosphat pH7 1/15M, gradient
bằng muối NaCl nồng độ từ 0 – 1M.









Kết quả điện di cho thấy, hiệu quả tinh sạch cũng như kết quả tách phân đoạn qua cột sắc ký rất cao, đã loại bỏ
gần toàn bộ các protein tạp, và chỉ có một vạch sau chạy sắc ký là urease đậu nành (theo tài liệu của nghiên cứu).
Kết luận của thí nghiệm: urease đậu rựa (jackbean) là loại enzymheterogeneous, còn urease dậu nành (Glycine
max) là homogeneous.(Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Th
ị Cẩm Vi,
Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán công Tôn Ðức Thắng-Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7-2006)

b. Sắc ký lọc gel
Nguyên tắc: là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của E
có trong hỗn hợp để tách chúng ra, dựa trên mức độ di chuyển khác nhau của các phân tử đó
trong hệ thống lưới phân tử của gel sắc ký.
Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng
có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay
polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, molselect và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên
thị trường có sẵn nh
ững hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử
nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở

bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và
ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong
hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn nhữ
ng phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn,
quanh co nên sẽ ra sau cùng.











Hình7:
Sắc ký đồ trên DEAE-Cellullose
Hình 8:
kết quả điện di sau các bước tinh sạch
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


12

Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 dến G200 phục vụ trongviệc lọc phân tử cho
phép các chất có trọng luợng phân tử khác nhau lọtvào ở các nguỡng sau đây:
Các loại sephadex Trọng luợng phân tử
G. 10 0 - 700
G. 15 0 - 1.500

G. 25 hạt tinh (F) 100 - 5000
hạt thô (C)
G. 50 hạt tinh (F) 1500 - 30.000
hạt thô (C)
G. 75 3.000 - 70.000
G. 100 4.000 - 150.000
G. 150 5.000 - 400.000
G. 200 5.000 - 800.000
Các Molselect cũng có ký hiệu từ G10 dến G200 phục vụ trong việc lọc phân tử cho
phép các chất có trọng luợng phân tử khác nhau lọt vào ở các nguỡng sau đây:
Các loại Molselect Trọng luợng phân tử
G - 10 <700
G - 15 <1500
G - 25 100 - 5000
G - 50 500 - 10.000
G - 75 1.000 - 50.000
G - 100 1.000 - 100.000
G - 200 1.000 - 200.000
Kỹ thuật này áp dụng để loại muối thay cho phương pháp thẩm tích. Và trong quá trình
tinh chế protein enzyme, thì được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme. Phương
pháp lọc gel không áp dụng với phương pháp mẫu lớn vì vậy ít được dùng ở bước tinh sạch
ban đầu. Tuy nhiên nếu lượng mẫu được cô đặc lại thì vẫn có thể dùng phương pháp lọc gel.
Ví dụ
: Tinh sạch urease từ đậu nành

Sắc ký đồ trên gel acrylamide cho thấy hầu như tất cả các vạch trên mẫu trích ly đều xuấthiện ở mẫu đã qua
tinh sạch trên sephadex. Ðiều đó có nghiã trước và sau khi chạy sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-50 chưa có
hiệu quả lắm về mặt tinh sạch, có thể do Sephadex G-50 không phù hợp nên chưa thể loại bỏ một số tạp chất.Î
Việc chọn kích thước hạ
t gel là vô cùng quan trọng trong quá trình tinh sạch E. (Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch
urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán công Tôn Ðức Thắng-
Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7 -2006)

Hình 10: Sắc ký đồ của dịch trích ly từ
đậu nành khi qua cột SephadexG-50
Hình 11: Kết quả điện di mẫu đã
qua cột Sephadex, ở phân đoạn 4
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


13

c. Sắc ký ái lực
Phương pháp này cho phép tinh sạch nhanh chóng hợp chất hay E quan tâm. Nguyên tắc
của phương pháp là dựa trên sự tương tác đặc hiệu sinh học để tạo ra sự gắn kết đăc hiệu
giữa chất cần tách với gel sắc ký.
Đối với E,người ta sẽ gắn với gel một chất có ái lực đặc hiệu với E như: cơ chất,

cofactor, chất ức chế cạnh tranh, chất tương đồng (analogue) cơ chấ
t. Quá trình gắn này có
thể trực tiệp hay qua một cầu nối hay cánh tay đòn (spacer). Khi hỗn hợp protein chứa E đi
qua cột sắc ký ái lực, E và những chất có ái lực với nhóm chất đặc hiệu trên gel sẽ được giữ
lại, còn các chất khác sẽ đi qua.E sẽ được tách ra bằng cách thay đổi nồng độ muối, pH của
môi trường hay dùng mộy chất cạnh tranh với E.
Hiện nay, sắc ký ái lực được sử dụ
ng rất nhiều trong tinh sạch E và hợp chất sinh học
khác, tuy nhiên khó khăn lớn nhất của phương pháp này là tìmchất gắn kết thích hợp.
















d. Sắc ký lỏng cao áp
Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng
phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ
ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng
kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mị

n hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có
được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh.
4. Phương pháp dùng chất hấp phụ
Nhiều protein và enzyme gắn một cách chọn lọc vào các chất hấp phụ nhất định như
silicagel, bentonite, γ - aluminium hydroxid, hydroxyapatite và nhờ vậy, chúng có được làm
sạch với hiệu suất cao. Phương pháp hấp phụ chọn lọc - hấp phụ trong thể tích (thêm chất
hấp phụ trực tiếp vào dịch E) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc
tách và làm sạch E. Chất hấp phụ chủ yếu thu
ờng được dùng là hydroxyapatite cho hiệu quả
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


14

phân tách đặc biệt cao. Hấp phụ chọn lọc enzyme có thể thực hiện bằng một trong hai cách :
chất hấp phụ hoặc hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzyme. Quá trình hấp phụ thường
được tiến hành ở 0
o
C. Bằng cách đổi độ pH hoặc lực ion của dung môi thích hợp, các E
được hấp phụ có thể được chiết khỏi chất hấp phụ.
IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYME
Ðây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh
chế cuối cùng. Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường
hợp riêng biệt, ta tiến hành kết tinh chúng.
Chú ý:
là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là tinh khiết hoàn
toàn. Đặc biệt là các tinh thể protein E kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá
50% và có thể chứa các protein E khác.
Quá trình kết tinh protein E được thực hiện trong dung dịch (NH
4

)
2
SO
4
. Quá trình kết
tinh kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tinh khiết.
Thường ta là thêm muối (NH
4
)
2
SO
4
vào dung dịch protein E khá đậm đặc cho đến khi
làm vẫn đục nhẹ nhàng dung dịch. Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ
từ nồng độ muối trong dung dịch.
Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách:
+ Thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein enzyme theo từng giọt.
+ Thêm muối qua màng bán thấm.
+ Có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein E.
Trong quá trình kết tinh có th
ể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ. Ðể kết tinh protein E
được dễ dàng, ở những giai đoạn truớc đó, người ta thường tách từng phần các protein E
bằng các dung môi hữu cơ. Ðiều này liên quan đến việc các chất có bản chất lipid bị loại ra
khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh.
V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME
Sau khi nhận được một E ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết
hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra
bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau. Trong một số trường hợp
protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số
isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel. Vì thế n

ếu dùng nhiều phương pháp khác
nhau để kiểm tra độ sạch của E mà kết quả đều cho là đồng thể thì E đó được công nhận là
tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể thường dùng là xây dựng đồ thị về
độ hòa tan, điện di và siêu ly tâm.
1. Xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan
Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi một loại dung môi (nước hoặc dung
dịch muối) lắc với những số lượng E khác nhau. Sau đó lọc và xác định số protein trong
dịch lọc. Cuối cùng xây dựng đường đồ thị. Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein
thêm vào bị hòa tan và số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc
hay dịch ly tâm. Kết quả nhận được biểu diễn là m
ột đường thẳng. Sau đó dung dịch đạt
được bão hòa. Nếu protein đem hòa tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein
trong dịch lọc sẽ không tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn. Nếu trong mẫu có
một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão đối với protein ít hòa tan hơn, loại protein
thứ hai còn có thể hòa tan nữa.

[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


15

Kết quả là có một điểm bão hòa thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn. Nếu dịch
chiết có nhiều protein E thì sẽ có nhiều điểm uốn. Phương pháp này được Northrop và
Kunitz sử dụng rất có kết quả đến nay vẫn còn ứng dụng nhiều.

2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel
Là phương pháp tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách cho đi qua chất
nền là gel trong một điện trường.
Tốc độ di chuyển của protein trong điện trường:
V = Ez/f
(1)
V: Tốc độ di chuyển
E: Lực điện trường
z: Điện tích của protein
f: Hệ số ma sát, tuỳ thuộc vào hình
dạng và khối lượng protein và độ nhớt của
môi trường.
Đây là phương pháp để đánh giá quá
trình tinh sạch protein/E có hiệu quả hay
không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc
trưng của protein/E có tăng lên sau mỗi
bước tinh sạch, còn một cách là làm phát hiện các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước
tinh sạ
ch. Tuy nhiên, phương pháp này là khó áp dụng ở quy mô lớn.
Gel là trạng thái trung gian giữa pha gắn và lỏng, bởi vì gel giống như một cái ray phân
tử sẽ làm tăng sự phân tách, vì vậy, điện di luôn được thực hiện trên gel. Những phân tử nhỏ
hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn
hơn lỗ gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển
trong gel với nhiều vận tố
c khác nhau. Điện di protein được thực hiện trên một bảng
polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Gel polyacrylamide (PAGE), được tạo thành từ sự
polymer hóa acrylamide và sự liên kết chéo của methylenebisacrylamide, có tính trơ về mặt
hóa học và được tạo hình nhanh chóng.
Trong nhiều trường hợp, để khẳng định chắc chắn băng protein tinh sạch trên điện di đồ
là E cần quan tâm, người ta phải dùng đến phương pháp điện di gel hoạt tính. Thường dùng

nhất là đồng trùng h
ợp cơ chất trong gel polyacrylamide, sau khi điện di rửa gel bằng một
dung dịch thích hợp, sau đó ủ gel với dung dịch cơ chất trong điều kiện phản ứng thích hợp.
Băng protein nếu có hoạt tính sẽ chuyển cơ chất thành sản phẩm có màu khác với màu của
nền gel chứa cơ chất, nhờ đó dễ dàng nhận ra băng có hoạt tính E. Ví dụ:
Với protease, cơ
chất casein, sau đó nhuộm gel với coomassie thì vị trí có E sẽ không có màu (do E phân giải
cơ chất), tạo thành vệt sáng trên gel có cơ chất nhuộm màu xanh.
Hình 1
2
:
Đ
ường biểu diễn độ hòa tan protein
A: Protein đơn thể
B: Hỗn hợp 2 protein

A
B
Số lượng protein trong dịch lọc
Số lượng protein cho thêm
Hình 13: Minh hoạ phương pháp điện di
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


16

a. Điện di một chiều
Các protein/E có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên gel
polyacrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Một số chất biến tính protein như: SDS
(sodium dodecyl sulfate), LDS (lithium dodecyl sulfate), Ureùa, Formamide. Thường dùng

nhất là SDS.
Hỗn hợp protein có chứa E được hòa tan trong dung dịch SDS, một chất tẩy mang điện
tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-
thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide.
Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối
lượng của protein. Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản
thân protein ban đầu. Vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến
điện tích của phức hợp.
Phức hợp SDS-protein sau đ
ó sẽ là mẫu để chạy điện di. Và những protein/E trên gel sẽ
được nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như
Coomassie blue. Những đánh dấu phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm
phim chụp x quang lên miếng gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi.
Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu,
gần giếng. Tính di động của phần l
ớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ
lệ với khối lượng của chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu carbohydrate và protein
màng không tuân theo mối tương quan này.
SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ
khoảng 0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm
chí ít hơn (~0.02ug) vẫn có thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Những protein chênh
lệch về khối lượng khoả
ng 2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau khoảng 10 acid amin)
có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE.[2]
b. Điện di dựa vào điểm đẳng điện
Các protein/E còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin có
tính base và số acid amin có tính acid của chúng mà không cần biến tính. Điểm đẳng điện
của một protein (pI) là điểm pH mà ở đó điện tích thực của nó bằng 0. Tại điểm pH này,
tính di động của protein trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì z bằng 0(công thức
1). Mỗi

một protein có một pI riêng.
Ví dụ:
pI của cytochrome C, một protein vận chuyển ion có tính base cao, là 10.6, trong
khi pI của albumin huyết thanh, một protein có tính acid trong máu, là 4.8.
Khi ta cho hỗn hợp protein chạy trong điện trường trên một miếng gel với một khuynh
độ pH, không có sự hiện diện của SDS. Mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí
mà tại đó pH bằng pI của nó. Dựa vào hiện tượng này, ta có phương pháp phân tách protein
dựa vào điểm đẳng điện của protein. để tạo khuynh độ pH, trước hết là cho vào gel m
ột hỗn
hợp polyampholyte (những polymer nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn
hợp.
Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân biệt được
sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng có
thể được phân tách bằng phương pháp này.


[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


17

c. Điện di hai chiều
Đây là phương pháp có khả năng phân tách
cao do sự kết hợp SDS-PAGE với điện di dựa vào
điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được
chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện. sau đó, đặt
khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên
tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm
ngang. Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều
dọ

c. Kết quả là một mô hình các điểm được phân
tách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện,
chiều dọc theo khối lượng.
Những protein/E được phân tách từ tế bào ở
các điều kiện sinh lý khác nhau có thể phân tách
được bằng phương pháp này, sau đó cường độ của
tính hiệu sẽ được xác định. Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh
hay y
ếu tùy vào tình trạng sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này có một hạn chế là có rất
nhiều protein được phân tách nhưng lại không phân biệt rõ. Để khắc phục hạn chế này,
người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổ.
d. Capillary Electrophoresis (Điện di mao dẫn)


Phương pháp này được ứng dụng trong giám sát quá trình tinh sạch protein/E-protein/E
tinh sẽ cho một band đơn. Ngoài ra phương pháp này còn giúp xác định khối lượng phân tử
tương đối của protein/E.
3. Phương pháp siêu ly tâm
Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể của protein E. Dưới
tác động của lực ly tâm, một phân tử sẽ di chuyển qua một môi trường lỏng. Để biết được
tốc độ di chuyển của phân tử ta cần phải tính hệ số lắng (s).
 Vận tốc lắng của một phân tử phụ thuộc vào:
+ Khối lượng: một phân tử có cùng hình d
ạng cũng như tỉ trọng với các phân tử khác
nhưng nặng hơn sẽ lắng nhanh hơn.
Hình 14:
Hình minh hoạ phương
pháp điện di hai chiều
Hình 15:
Hình minh hoạ phương pháp điện di mao dẫn

[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


18

+ Hình dạng: cũng ảnh hưởng đến vận tốc lắng vì nó tác động đến độ nhớt. Hệ số ma
sát của một phân tử cuộn lại thì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnh dù chúng có cùng khối
lượng. Vì vậy, một phần tử dạng thẳng lắng chậm hơn những phân tử hình cầu dù chúng có
cùng khối lượng.
+ Tỉ trọng của dung dịch (p): các phân tử
lằng khi p < 1, nổi khi p > 1 và không di
chuyển khi p = 1.
 Các bước tiến hành: với tốc độ ly tâm rất lớn, bằng cách tăng số vòng quay ly tâm lên
hàng nghìn, hàng vạn vòng trong một phút. Ta có thể tách ra được các phân tử E có trọng
lượng phân tử khác nhau.Tốc độ kết tủa của protein E trong máy siêu ly tâm được xác định
bằng trọng lượng phân tử của nó.
Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào dung dịch. Do đó, để quan sát
tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm người ta gắn m
ột thiết bị quang học đặc biệt, vẽ các
đường ánh sáng của kết quả phân tích lên một màn. Nếu trong dung dịch có một loại protein
E thì trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị có một đỉnh. Nếu làm việc với hai hay nhiều
protein enzyme thì sẽ có hai hoặc nhiều đỉnh
Sau ly tâm mẫu được hút ra nhẹ nhàng theo từng phân lớp, hay đục lỗ nhỏ ở đáy ống ly
tâm để lấy từng phân lớp.
4. Kỹ thuật phân tích khối phổ (mass spectrometry – MS)
Với phương pháp phân tích này, các protein được phân cắt bằng một protease đặc hiệu
(thường dùng là trypsin) thành các peptide nhỏ, sau đó cho qua hệ thống phân tích khối phổ.
Nhờ hệ thống này, phổ các peptide được xác định khối lượng phân tử chính xác và kết quả
được so sánh với khối phổ của các protein trong ngân hàng dữ liệu quốc tế. Protein phân
tích được nhận dạng chính xác là loại protein hay E gì.

VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME
Ngoài ra sau mỗi bước tinh sạch, cần đánh giá quá trình tinh sạch E dựa vào những
thông số sau :
+ Protein tổng số:
lượng protein có trong một phân đoạn - bằng cách nhân nồng độ một
phần của phân đoạn với tổng thể tích của phân đoạn đó.
+ Hoạt tính tổng:
hoạt tính của E trong phân đoạn đó - tính bằng cách nhân hoạt tính E
có trong lượng mẫu được xét nghiệm với tổng thể tích của phân đoạn đó.
+ Hoạt tính riêng:
bằng hoạt tính tổng chia cho protein tổng số.
+ Yield:
hoạt tính còn lại sau mỗi bước tinh sạch được thể hiện bằng phần trăm hoạt
tính của dịch chiết thô với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu là 100%.
+ Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh sạch, được tính bằng cách chia hoạt tính riêng, được
tính sau mỗi bước tinh sạch, với hoạt tính riêng của dịch chiết ban đầu.
Thực tế, người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh sạch, mức độ tinh sạch tăng lên trong khi
yield lại giảm. kỹ thuật điện di, nếu ta nạp một lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản
gel ứng với một b
ước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trong
khi tỉ lệ lượng E mục tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng .
Vì vậy, mức độ tinh sạch và yield là 2 thông số để đánh giá quá trình tinh sạch. Một quá
trình tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch cao và chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số yield cao còn
mức độ tinh sạ
ch thấp có nghĩa là còn nhiều tạp nhiễm trong mẫu.

[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009


19

 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme
Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong E học, người ta không định lượng
E một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi
là hoạt độ) của E. Trong phán ứng có E xúc tác, sự hoạt động của E được biểu hiện bằng
cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản
ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết đượ
c chính xác mức độ hoạt động của E thông
qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Ðể xác
định hoạt độ của E ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương
pháp vật lý hoặc hóa học. Các phương pháp, so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt,
chuẩn độ được dùng phổ biế
n trong nghiên cứu định lượng các phản ứng E.
Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:
+ Ðo lượng cơ chất bị mất di hay lượng sản phẩm tạo thành trong một thời gian nhất
định ứng với một nồng độ E xác định.
+ Ðo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản
phẩm với một nồng độ E nhất định.
+ Chọ
n nồng độ E như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên
nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Ðơn vị hoạt độ E (U) là lượng E có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole
(1μmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 U = 1μmol cơ chất (10
-6
mol)/ phút.
Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat)
Katal (Kat) là lượng E có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giây
ở điều kiện tiêu chuẩn
1 Kat = 6.10

7
U
1
Và 1 U = microkatal
60
VII. TỔNG KẾT
Để thu được một chế phẩm E tinh khiết và vẫn đảm bảo hoạt tính xúc tác, thì quá trình
tách từng phần và tinh sạch E phải trải qua nhiều công đoạn khác nhau. Tuỳ theo nguồn
cho, loại E, mục đích sử dụng và điều kiện sẵn có mà ta lựa chọn phương pháp cũng như
trật tự các phương pháp sao cho đạt hiệu tinh sạch quả tốt nhất.
Trong từng bước tinh sạch các điều kiệ
n nhiệt độ, pH… phải luôn được kiểm soát ở
mức cho phép, nhằm tránh làm biến tính E cũng như mất hoạt tính. Và sau mỗi bước tinh
sạch cần kiểm tra hiệu quả tinh sạch cũng như hoạt độ của E, nhằm đánh giá hiệu quả của
từng phương pháp để đưa ra một quy trình tinh sạch hiệu quả cao đồng thời ít tốn chi phí.
Ngày nay, E được ứng dụng ngày càng rộng rãi hơn, nhưng giá thành ch
ế phẩm E vẫn
còn khá cao. Để giải quyết vấn đề này, cần tìm nguồn nguyên liệu thích hợp, hoặc tìm biện
pháp sử dụng E lặp lại nhiều lần, ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất cũng như thu
nhận E.






TÀI LIỆU THAM KHẢO
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009

20

1. Công Nghệ Sinh Học (tập ba) Enzyme và ứng Dụng-Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn
Nghĩa -Chương2: Các phương pháp nghiên cứu enzyme (trang 15-28).
2. Enzyme Học – Giáo trình điện tử -
- Chương 2: Phương pháp
nghiên cứu enzyme (trang 19-41)

3. Chromatographic Methods For Protein Purification - My Hedhammar, Amelie Eriksson
Karlström, Sophia Hober - Royal Institute of Technology, AlbaNova University Center, Dept. of
Biotechnology, SE-106 91 Stockholm, Sweden. (p. 3-23)
4. Nghiên Cứu Thu Nhận, Tinh Sạch Urease Từ Đậu Nành - Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm
Vi, Nguyễn Tấn Ðạt - Truờng Ðại học Bán công Tôn Ðức Thắng - Tạp chí phát triển KH&CN,
tập 9, số7 -2006.
5. Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius
Bocourti) -Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM
6. Sự phân b
ố, thu nhận và ứng dụng enzym protease -
7. Enzym – Wikipedia Tiếng Việt -
8.
Protein Purification - Joseph Conner
9. Tinh sạch protein – Dương Văn Cường –

10.
Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (27-12-2006) – V.T.M.Tâm