nghiên cứu khả năng tái sinhn chồi hoa mười giờ ( portulaca grandiflora ) qua trung gian mô sẹo

Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Chương 1. Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) là cây thân thảo thuộc họ rau sam, mặc
dù là một loài cây thân thảo phổ biến và dễ trồng nhưng chính nhờ tính đa dạng và
màu sắc sặc sỡ mà loài cây này mới giúp tôn lên vẻ đẹp của những khu vườn hay
khuôn viên, đặc biệt là lúc hoa nở rộ.
Nuôi cấy in vitro hoa mười giờ để khảo sát điều kiện sinh sống của hoa mười
giờ trong ống nghiệm khác thế nào so với điều kiện bên ngoài, ở bên ngoài môi
trường tự nhiên hoa mười giờ rất dễ trồng và thời gian phát triển cũng khá nhanh
nhưng khi tiến hành nuôi cấy in vitro mất khá nhiều thời gian thì mục đích chính là
khảo sát tập tính cũng như điều kiện sống của hoa mười giờ. Đây là loài cây thân có
nhiều lông nhỏ gây khó khăn trong việc tạo nguồn mẫu vô trùng. Đó là những bước
nghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu nuôi cấy hoa mười giờ ra hoa
trong ống nghiệm là một loại hình được khá nhiều người ưa thích vì nhìn rất đẹp, có
thể kinh doanh được, không phải chăm sóc như hoa ngoài tự nhiên mà cây vẫn tươi
tốt. Hoa mười giờ chính là đồng hồ sinh học vì cứ khoảng 8 – 10 giờ sáng là hoa nở
rộ, nghiên cứu này cũng để khảo sát vấn đề này xem vì sao hoa mười giờ lại có tập
tính này, cũng như hoa quỳnh nở vào lúc 12 giờ đêm, đó chính là điều đặc biệt của
loài cây này nhưng khi nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện không có oxy cây
vẫn phát triển tốt nhưng để cây ra hoa và nở cả ngày là điều không dễ chút nào vì nó
phá vỡ quy luật tự nhiên của cây, đó là cứ 8 – 10 giờ cây mới cho hoa nở. Đây là vấn
đề cần phải nghiên cứu khá lâu và mất nhiều thời gian.
Là loài cây rất phổ biến và dễ trồng nên nó có giá trị kinh tế không cao khi
chưa tiến hành nuôi cấy in vitro. Đây là bước đầu khai thác giá trị kinh tế của loài
cây này, mặc dù khá phổ biến nhưng đây cũng là một loại thuốc nam rất công dụng
cùng với một số cây thuốc khác trong họ của nó như loài rau sam rất tốt cho sức
khỏe.
1.2. Mục đích và yêu cầu
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 1
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu khả năng nuôi cấy mô cây hoa mười giờ nhằm tạo nguồn mẫu vô
trùng ban đầu để cung cấp mẫu thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là ra hoa trong
ống nghiệm.
1.2.2. Yêu cầu
Phải đưa được mẫu vào để tạo mẫu vô trùng, khảo sát mẫu ban đầu ở các môi
trường bổ sung chất điều hòa tăng trưởng
Chương 2: Tổng quan
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 2
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống
2.1.1. Khái niệm
• Kỹ thuật nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều là thuật
ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các cơ quan của thực vật trong ống
nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin,
đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng
(Dương Công Kiên, 2002).
• Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan
từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta
dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự
phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và
mô trong quá trình nuôi cấy.
• Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học
thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Nó là công cụ
nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. Điều quan trọng nhất trong vi nhân
giống là việc nghiên cứu vai trò và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật nhằm kích thích sự hình thành chồi với số lượng lớn phục vụ cho
công tác nhân giống.
• Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật vi nhân giống đã làm được một cuộc
cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tới

mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại. Vi nhân
giống đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với
nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây
dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Phương pháp này có những ưu điểm vượt
trội so với phương pháp truyền thống:
Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của
cây (trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn) mà
ngoài tự nhiên không thể thực hiện được.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 3
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn,
trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại.
Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền.
Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh
như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,…
Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện
tích rất nhỏ.
Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.
Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hoặc toàn đực (cây măng tây) theo
mong muốn.
Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen.
• Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đã
được đề cập ở trên thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm
cần phải được khắc phục:
Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao.
Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần
khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm.
Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con
tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình.

Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được
bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
• Hiện nay, vấn đề đáng quan tâm nhất trong việc áp dụng kỹ thuật vi nhân
giống vào sản xuất thương mại là giá thành sản phẩm tạo ra còn quá cao. Theo
Kozai và cộng sự (1992), nguyên nhân chính của vấn đề này là sự thất thoát
do nhiễm khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỷ lệ sống sót thấp của cây
trong giai đoạn chuyển ra vườn ươm, giá nhân công lao động chiếm 60 – 70%
tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sang
môi trường mới, giá thành trang thiết bị (thiết bị chiếu sáng, bình nuôi cấy,…)
và nguyên liệu cơ bản (đường, agar,…) còn khá cao. Việc cấy chuyền lặp lại
nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng và phát triển của thực vật, có khi
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 4
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
còn làm tăng tính bất thường về di truyền của tế bào. Tuy nhiên, hạn chế
nghiêm trọng nhất trong kỹ thuật vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của cây con
sau khi chuyển ra vườn ươm thường rất thấp do sự khác biệt lớn giữa điều
kiện môi trường in vitro và ex vitro.
2.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên.
Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy
đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung
chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng
thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi.
Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh.
Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường.
• Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân
hóa của các tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự
hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong

điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo.
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng
nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc
tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc
nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào
soma lại cao hơn.
• Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc
có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào
đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối.
Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường tế bào có khả
năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 5
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được
tách ra và trải trên môi trường thạch.
- Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng
cụm tế bào mô sẹo.
- Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn có khả
năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
• Nuôi cấy protoplast – chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống
và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có.
Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế
bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật).
Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung
hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng.
Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài
hay khác loài.
• Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành
mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.
2.1.3. Những vấn đề trong nhân giống vô tính in vitro
• Tính bất định về mặt di truyền
Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh
trưởng. Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại. Việc nuôi cấy mô sẹo
tế bào đơn thường tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Tần số
biến dị xảy ra còn phụ thuộc các yếu tố:
- Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy.
- Loại mô cấy.
- Số lần cấy chuyền nhiều hay ít, trong đó loại biến dị về nhiễm sắc thể sẽ
xuất hiện cao khi thời gian nuôi cấy kéo dài. Số lần cấy chuyền ít và thời
gian cấy chuyền giữa hai lần ngắn sẽ làm giảm khả năng gây biến dị.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 6
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
• Sự nhiễm mẫu
Do mẫu nhiễm virus hay vi sinh vật. Có thể giảm khả năng lại mẫu bằng cách:
- Sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh.
- Sử dụng các loại kháng sinh như: Amphostericin B, Gentamicin,
Vacomicin hoặc Penicillin với nồng độ phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy.
• Sự hóa thủy tinh thể
Hiện tượng thủy tinh thể là một dạng bệnh lý của cây, cây sẽ bị mất nước khi
chuyển cây từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài.
Nguyên nhân là do cây in vitro có lớp sáp ở bên ngoài biểu bì mỏng, tế bào
chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận các phân tử nước, về cấu tạo khí khổng
của cây thường có hình tròn thay vì hình elip như cây trong tự nhiên, khí khổng
mở suốt trong quá trình nuôi cấy và mật độ khí khổng cao. Ngoài ra nhu mô thịt
lá và lớp mô bảo vệ mặt ngoài của lá kém phát triển, tế bào chất kém đậm đặc,
diệp lục ít so với các cây bình thường nên khi đưa cây ra môi trường ngoài với
điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác, cây không thể thích nghi dẫn đến stress và

chết.
Có một số phương pháp hạn chế quá trình hóa thủy tinh thể như sau:
- Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường
trong môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao. Tuy
nhiên, điều này có thể làm giảm sự tổng hợp của diệp lục tố và ức chế sự
hình thành chồi.
- Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng và tiếp xúc với môi
trường cấy ít nhất.
- Ở một số loài có thể sử dụng chất ABA.
- Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy.
- Giảm C
2
H
2
trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh
sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.
2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 7
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh
vực như:
• Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp
(nuôi cấy tế bào trần).
• Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cấy huyền phù tế bào)
trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp.
• Chọn lọc tế bào có những đặc điểm mong muốn, cho phát triển thành cây con
thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).
• Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).
• Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại.
• Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.

• Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.
• Nuôi cấy quang tự dưỡng.
2.1.5. Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro cây thân thảo và cây thân gỗ
• Các loài cây thân gỗ ít có khả năng tái sinh hơn các loài cây thân thảo.
• Các nghiên cứu nhân giống trên cây thân gỗ được bắt đầu trễ hơn so với cây
thân thảo.
• Việc cảm ứng sự trẻ hóa ở cây thân gỗ khó hơn ở cây thân thảo.
• Tốc độ nhân giống cây thân gỗ thấp hơn cây thân thảo.
• Tác động của trạng thái hưu miên trên sự tăng trưởng của chồi và sự kéo dài
của thân cây thân gỗ theo từng thời kì trong năm.
• Cây thân gỗ dễ bị ảnh hưởng bởi các chất độc tiết ra trong môi trường nuôi
cấy.
• Mô của cây thân gỗ khó khử trùng hơn vì đại đa số mọc ở ngoài thiên nhiên.
• Cây thân gỗ và cây bụi thường được chọn lọc để nhân dòng sau khi cây đã
trưởng thành. Ở giai đoạn này các mô của cây thường rất khó hoặc không thể
sử dụng được trong nhân giống in vitro.
• Sự đa dạng về mặt di truyền của cây thân gỗ lớn hơn so với cây nông nghiệp
và các loại cây thân thảo khác, do đó sau khi nhân giống sẽ thu được nhiều kết
quả khác nhau khó kiểm soát.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 8
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
• Cây thân gỗ không thể trồng được trong nhà kính, vì vậy việc thu mẫu bị ảnh
hưởng rất nhiều bởi điều kiện khí hậu và các điều kiện tăng trưởng khác.
2.1.6. Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro và nhân giống in vivo
• Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.
• Có thể tạo được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo do nhân
giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô.
• Sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn
những cây được nhân giống vô tính in vivo vì những cây này đã được trẻ hóa
và sạch bệnh.

• Việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh do có sự chọn lọc
các đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuôi cấy đồng thời cũng có thể xử lý mẫu
cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.
Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau do
cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất.
• Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên
có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.
• Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống
in vivo và giảm các chi phí về năng lượng đối với các trường hợp các loại cây
cần được nhân giống trong nhà kính.
• Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn
dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh
năm.
• Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân
giống kế tiếp.
• Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy.
• Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng
gen.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 9
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
• Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai
soma.
• Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây
bất thụ đực, cây bất thụ do đột biến,… có thể được duy trì và nhân giống bằng
phương pháp nhân giống in vitro.
• Những bất lợi của phương pháp nhân giống vô tính in vitro:
- Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy.
- Tạo ra những cây không hoàn toàn đúng như mong muốn: mọc um tùm vì
một số cây còn giữ được khả năng trẻ hóa trong quá trình nuôi cấy.
- Đặc biệt, đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.

Trong một số trường hợp, có những loại cây tạo được rễ in vitro nhưng những
rễ này không phù hợp do đó những cây này sẽ tạo mới rễ sau khi được chuyển
ra trồng trong đất.
- Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số
cây.
- Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bị tấn công
bởi một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng. Vì vậy,
cần phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận.
- Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyền mô sẹo và huyền
phù tế bào được lặp lại nhiều lần.
- Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện.
- Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành
của cây tăng lên. Hiện nay, các kỹ thuật hiện đại đang được tiến hành như
tăng sinh tế bào trong các thiết bị lên men nhưng vẫn còn trong giai đoạn thí
nghiệm.
2.1.7. Các bước nhân giống in vitro
• Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy. Để
tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 10
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, mùa vụ lấy mẫu, chất lượng của
cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu cấy đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa
được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng
hóa học như calcium hypocloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủy
ngân,…
• Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân
giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo
thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của

cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường
nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ callus (mô sẹo). Trong môi trường
nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA
3
và các chất hữu cơ khác.
• Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.
Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi
trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp
với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá
trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và
được duy trì trong thời gian dài.
• Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn
bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra
môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào
đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện
tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện
in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ
C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung
auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.
• Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm
Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt
trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ ánh sáng thấp,… Sau
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 11
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có
thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng
trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt

về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Cây in vitro được nuôi cấy trong
điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra
đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng
có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất
nước và mau héo dẫn đến hiện tượng chết. Để tránh tình trạng này, vườn ươm
cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao. Cây con thường
được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được
ẩm, trong những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá
(thường 7 – 10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy
mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ
bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ
thấp để rút ngắn thời gian ra rễ.
2.1.8. Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro
Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro là một quá trình phức tạp vì:
• Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những
mối tương quan mới được hình thành.
• Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:
Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa
tế bào).
Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành
cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra.
Sự hình thành cơ quan.
Sự phát triển cơ quan.
• Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố: nguồn mẫu
cấy ban đầu, sự tăng trưởng của mẫu cấy trong điều kiện nhà kính hay ngoài
đồng ruộng, vị trí của mẫu cấy trên cây, thời điểm lấy mẫu cấy, hàm lượng
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 12
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
hormone nội sinh, kích thước mẫu cấy, phương pháp cấy, chất dinh dưỡng,
chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện sinh lý, một số hợp chất được tiết ra trong

quá trình nuôi cấy,…
Tất cả những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh rất phức tạp, chúng ta
không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý một số vấn đề
sau:
• Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau
(môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,
…).
• Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loài
khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau.
• Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài khác
nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết
định do đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng không nhiều.
• Sự hình thành rễ bất định thườn đối lập với sự hình thành chồi bất định. Nếu
cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều
thiếu sót. Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất
định trước sau đó cảm ứng tạo rễ.
2.1.8.1. Sự hình thành chồi bất định
• Sự hình thành chồi bất định được xem là một trong những phương pháp nhân
giống sinh dưỡng trong nuôi cấy mô. Ngày nay một số loài như Saintpaulia,
Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lilium, Ferine đang được nhân giống
bằng phương pháp này.
• Có nhiều điểm giống nhau giữa sự hình thành chồi bất định và rễ bất định: các
nhân tố có ảnh hưởng tích cực lên sự hình thành rễ bất định cũng thúc đẩy sự
hình thành chồi bất định. Điều này được thể hiện qua một số điểm sau:
Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng các
bộ phận của cây con (Anonymous, 1984).
Đường đóng vai trò rất quan trọng trong sự hình thành chồi và rễ.
Sự hình thành chồi hay rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 13
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

• Trong đa số trường hợp, ánh sáng thúc đẩy sự hình thành chồi bất định. Tuy
nhiên một số loài cây cần điều kiện tối để hình thành chồi bất định: chồi hoa
Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), các mẫu cấy từ cuống hoa Nerine
bowdemi (Pierik và Steegmans, 1985). Economou và Read (1986) cho rằng
các mẫu lá của Petunia hybrida tăng trưởng trên môi trường không có
cytokinin và được xử lý ánh sáng đỏ tạo ra nhiều chồi hơn những mẫu cấy
được xử lý ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên trên môi trường có BA, các mẫu cấy
được xử lý ánh sáng đỏ và đỏ xa tạo ra số lượng chồi bằng nhau và nhiều hơn
các mẫu cấy trên môi trường không có cytokinin.
• Nhiệt độ cao thường cần thiết cho sự hình thành chồi nhưng cũng có một số
trường hợp ngoại lệ đối với BegoniaI (Heide, 1965) và Streptocarpus
(Appelgren và Heide, 1972).
• Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành chồi bất định rất phức
tạp:
Một số cây không cần auxin hay cytokinin để hình thành chồi bất định như
Cardamine pratensis (Pierik và Segers, 1972), Streptocarpus (Appenlgren và
Heide, 1972). Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp cytokinin và auxin đều
có ảnh hưởng đến quá trình tạo chồi.
Hầu hết thực vật cần cytokinin để thúc đẩy tạo chồi trong khi auxin có tác
dụng ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Nitsch, 1968).
Một số loài cần auxin ngoại sinh cho sự tạo chồi như Lilium (Aartrijk,
1984), Hyacinth (Pierik và Steegmans, 1975).
Nồng độ cytokinin/auxin cao rất quan trọng cho sự tạo chồi ở nhiều loài
thực vật khác nhau, ví dụ như ở loài Begonia (Heide, 1965), Súp lơ (Margara,
1969).
• Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự tái
sinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của
hai chất điều hòa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog
và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 14

Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
thúc đẩy tạo chồi ở nhiều loài thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao
sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng).
• Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ
tăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1975; Nitsch và cộng sự, 1969).
Trong một số trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm
ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây Thuốc lá (Skoog và Tsui,
1948), Plumbago indica (Nitsch, 1968).
• Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex
(Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid
abscisic ức chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm
ứng sự hình thành chồi như ở cây Ipomoea batatas.
2.1.8.2. Sự hình thành rễ bất định
• Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô của
chúng còn giữ khả năng phân sinh.
• Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót
của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.
• Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền
loài, tuổi của mẫu, vị trí mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương,
số lần cấy chuyền, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng,
than hoạt tính, đường, agar, pH,…
2.1.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro
2.1.9.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển in vitro:
• Kiểu di truyền
Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thông
thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó
tái sinh (trừ khi chúng còn non). Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae,
Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ

SVTH: Trần Thị Thu Hiền 15
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
tái sinh nhất. Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên (các
giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu
như dễ tái sinh in vitro. Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn
cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi
bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có
thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy.
• Tuổi của cây
Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta
thường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô. Khi cây già đi, khả năng
tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn
như trong trường hợp cây bụi. Một vài ví dụ cụ thể chỉ ra sự khác nhau về khả
năng tái sinh và phân chia tế bào giữa cây già và cây non in vitro: Hedera
helix (Stoutemeyer và Britt, 1965), Lunaria annua (Bajaj và Pierik, 1974) và
Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974). Khi mô phân sinh và chồi
đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non
trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đôi khi qua nhiều lần cấy
chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và
phân chia tế bào. Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus
vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica.
• Tuổi của mô và cơ quan
Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng
nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá còn non
tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn
nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm. Khả năng tái sinh của những
loài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa
còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974),
Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica (Coumans và
cộng sự, 1979).

• Tình trạng sinh lý
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 16
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế
bào in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ
tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở
giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản
(Robb, 1957). Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông)
khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này
(vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển).
• Vị trí của mẫu cấy trên cây
Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh
trưởng và phát triển in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii,
ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát
triển trong môi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn
chồi nách. Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương
được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng
xảy ra tương tự đối với lily (Robb, 1957). Điều đáng lưu ý là những mô sẹo
phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như
rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.
• Kích thước mẫu cấy
Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để
tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời
khỏi cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích
thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa
nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi
trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt,
phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh
hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành lily đã được
Aartrijk (1984) chứng minh.

• Vết thương
Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái
sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 17
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
dưỡng và các chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. Ngoài
ra, có thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thường.
• Phương pháp cấy
Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau:
có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực
(cắm phần ngọn xuống môi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh
khi mẫu được cấy không cực (Pierik và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt
khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò
quan trọng. Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả
năng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trường. Như ở
trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974),
sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đó phương pháp cấy không
cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có
cực.
• Ảnh hưởng của nguồn carbon dioxide và ánh sáng
Ở vùng lạnh, những thay đổi trong quá trình sinh trưởng của mẫu cấy xảy
ra suốt mùa đông có thể giải thích dựa trên những thay đổi bức xạ. Khi giảm
1% ánh sáng sẽ làm giảm 1% năng suất trong nhà kính nhưng mối tương quan
này không đóng vai trò trong trường hợp với những cây con. Điều kiện ánh
sáng trong nhân giống những cây cấy ghép có thể đem lại nhiều lợi ích không
chỉ trong giai đoạn vườn ươm mà còn có lợi sau khi trong bên ngoài.
• Ảnh hưởng của nhân tố khoáng
Sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng phụ thuộc nhiều vào loại cây
thí nghiệm. Môi trường Murashige và Skoog (1962) là môi trường phổ biến
nhất vì hầu hết các loài cây có thể thích nghi được. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng

dung dịch dinh dưỡng không phải lúc nào cũng thích hợp cho sự sinh trưởng
và phát triển vì nồng độ muối khoáng trong dung dịch quá cao. Ví dụ cây
đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in vitro (Pierik và Seger, 1972).
Lloyd và McCown (1980) đã tìm ra một môi trường thích hợp cho một số loài
thân gỗ nhạy cảm với muối gọi là môi trường WPM (woody plant medium).
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 18
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
• Ảnh hưởng của pH
pH của môi trường nuôi cấy thường được điều chỉnh từ 5.5 – 6. pH dưới
5.5 thì agar không đông thành dạng gel hoàn toàn và trên 6 thì gel lại quá
cứng. pH của môi trường thường giảm từ 0.6 – 1.3 đơn vị sau khi hấp khử
trùng. Có một số trường hợp, sau một thời gian nuôi cấy, pH của môi trường
giảm dần do sự hình thành một số acid hữu cơ trong môi trường.
Điều chỉnh pH bằng cách dùng HCl hay NaOH 1N hoặc 0.1N và nhỏ từng
giọt vào trong môi trường, khuấy đều môi trường rồi mới đo. Luôn nhớ phải
điều chỉnh pH trước khi thêm agar.
2.1.9.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và
phát triển của thực vật
• Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúng
trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như
các chất diệt cỏ dại.
• Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế
bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều
hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng
dụng trong thực tế.
• Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường
xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các
thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng
trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc

biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin. Sự áp dụng loại và
nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:
Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu.
Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy.
Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.
Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.
Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây
mẹ: tuổi cây mẹ, thời gian thu mẫu trong năm.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 19
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C
10
H
9
O
2
N.
Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra
(IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA; NAA; 2,4-D;…). IAA
tổng hợp được sử dụng trong nuôi cấy mô nhưng nó dễ bị biến tính trong môi
trường nuôi cấy và nhanh chóng thoái biến ở trong mô. Tuy nhiên những đặc
tính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây IAA cùng với cytokinin sau
khi cảm ứng sự hình thành mô sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phôi khi hàm
lượng của nó trong mô giảm dần. IAA thường được sử dụng phối hợp với các
chất điều hòa sinh trưởng khác để kích thích sự phát sinh hình thái trực tiếp.
Tuy nhiên, tùy theo mục đích thí nghiệm mà người ta có thể sử dụng các hợp
chất giống auxin khác được tổng hợp và nó có những hoạt động hơi khác với
auxin như: IBA, 2,4 – D, NAA. 2,4 – D thường được sử dụng phối hợp với
cytokinin để cảm ứng sự tạo mô sẹo và huyền phù tế bào và nó sẽ được thay
thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái. IBA và NAA là

loại auxin thích hợp trong nuôi cấy chồi. IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt độ
và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA không ổn định trong môi
trường nuôi cấy cho dù nó được lọc qua màng lọc vô trùng. Nồng độ của IAA
có thể giảm đi 10 lần trong 4 tuần nuôi cấy ở trong tối nếu không được bổ
sung thêm, tốc độ phân hủy của auxin ở ngoài sáng xảy ra nhanh hơn đặc biệt
trong môi trường MS. IBA ổn định trong môi trường hơn là IAA, mức độ
giảm của IBA thấp. Còn NAA và 2,4 – D không bị biến tính trong môi trường
nuôi cấy. Ngoài ra, còn có một số auxin khác nhưng chúng rất ít được sử dụng
như: 2,4,5 – T, 4 – CPA, MPCA, NOA, Dicamba, Picloram.
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc
vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng
khác.
Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự
gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên
trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 20
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện
bằng một sự phóng thích ion H
+
. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách
nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K
+
.
Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng
hợp ARN ribosome.
Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình
hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát
triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi
cấy mô sẹo.

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của
chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát
hoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân
cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non. Nhưng trong
quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của các enzyme
auxin - oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng
tổng hợp ra chúng.
Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ
Thị Bạch Mai, 2004).
• Cytokinin
Cytokinin là một trong nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật.
Cytokinin ít có ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nó có hiệu quả
trong việc kích thích sự sinh tổng hợp protein.
Cytokinin được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng
trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi
cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin
được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA,
ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong
nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP. Các loại cytokinin tự nhiên như
zeatin và IPA ít được sử dụng trong các thí nghiệm vì giá thành cao, chỉ
thường sử dụng Kinetine và BAP.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 21
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diện
của auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin
cho phép tách rời nhiễm sắc thể.
Trong nuôi cấy mô, nếu lượng cytokinin không đủ thì sự phân chia của
nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. Khi cấy
chuyển mô sang môi trường mới có chứa cytokinin thì tế bào sẽ phân chia liên
tục sau giai đoạn nghỉ. Người ta còn cho rằng sự phân chia tế bào trong mô

sẹo xảy ra khi không có sự hiện diện của cytokinin trong môi trường nuôi cấy
là do tế bào đã tự tổng hợp được cytokinin cho nó
Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc
gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in
vitro. Tác dụng này của cytokinin đôi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp
với auxin. Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự
phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Cytokinin cũng có khả năng kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm
giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuôi cấy chồi của những loài cây lá rộng,
người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào môi trường nuôi cấy.
Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ
nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc
làm cho chồi chứa nhiều nước.
Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua
sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin.
Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh
mẽ sự thành lập chồi non, trái lại ở nồng độ cytokinin cao chúng thường cản
hoặc làm chậm sự tạo rễ. Đôi khi người ta cũng nhận thấy rằng cytokinin
cũng cảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tăng trưởng của rễ hoặc kích thích
sự tạo thành rễ bất định khi không có sự hiện diện của auxin. Trong hầu hết
các trường hợp, chỉ có nồng độ cytokinin thấp là có hiệu quả.
Người ta thường bổ sung cytokinin với nồng độ thấp vào môi trường nuôi
cấy để cảm ứng sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi đặc biệt là những cây lá
rộng. Tuy nhiên, cũng có vài bằng chứng cho rằng cytokinin lại cản sự sinh
phôi ở cây một lá mầm ví dụ như: cytokinin ngoại sinh 0.001 µM đủ để ngăn
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 22
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
cản sự sinh phôi ở Dactylis glomerata. Cytokinin nội sinh cũng có thể ngăn
cản sự tạo phôi ở một số loài thực vật.
Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa

chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các
chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi
ngọn.
Ảnh hưởng của cytokinin trên sự nuôi cấy mô và cơ quan phụ thuộc vào
loại cytokinin sử dụng, kiểu nuôi cấy, loài thực vật được nuôi cấy và mẫu cấy
được thu từ mô còn non hay mô đã trưởng thành.
Trường hợp duy trì mẫu cấy trong điều kiện nhiệt độ cao bất thường thì
làm giảm hiệu quả của cytokinin nhưng có thể làm tăng hiệu quả của auxin.
Hầu như sự tăng trưởng chồi không xảy ra ở 30
o
C.
Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế
bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi
cho nuôi cấy in vitro.
2.1.9.3. Ảnh hưởng của vitamin lên sự sinh trưởng và phát triển của thực
vật
• Vitamin thường có chức năng xúc tác trong các phản ứng enzyme. Vitamin
được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật là thiamine (vitamin
B1). Các vitamin khác như acid nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng có thể
được thêm vào môi trường nuôi cấy bởi chúng có thể tăng cường sự đáp ứng
của tế bào.
• Các dung dịch vitamin được bảo quản tốt nhất trong tủ lạnh và dùng 10 ml
cho 1 lít môi trường. Các dung dịch vitamin sử dụng trong các thí nghiệm.
• Hiện nay, trong quá trình pha chế môi trường ta thường thêm các dung dịch
vitamin vào môi trường trước khi hấp khử trùng. Tuy nhiên, trong các nghiên
cứu đặc biệt về vitamin thì ta nhận thấy rằng tốt nhất là nên lọc khử trùng các
dung dịch vitamin và sau đó thêm vào môi trường đã hấp khử trùng.
2.1.9.4. Ảnh hưởng của đường lên sự sinh trưởng và phát triển của thực
vật
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 23

Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
• Khi được nuôi cấy in vitro, thường thì các tế bào thực vật không có khả năng
quang hợp và do đó nó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động
biến dưỡng của tế bào.
• Trong nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần) thì lượng đường sử dụng
thường thấp, ngược lại trong nuôi cấy phôi và bao phấn thì dùng đường nhiều
hơn.
• Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản
ứng với các hợp chất amino. Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng,
thoái biến và hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và có phân tử lượng
cao, ức chế sự phát triển của tế bào.
2.1.10. Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô
• Có thể nói, khó khăn lớn nhất khi tiến hành nuôi cấy mô là phải tạo được thể
nhân giống in vitro vô trùng. Có nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng,
trong quá trình nuôi cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ
thống lọc khí trong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi
cấy.
• Mẫu cấy, các mảnh mô thực vật, dùng để nuôi cấy thường là nguồn nhiễm
chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc
giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số loài thực vật được bao phủ
bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng vì đây
là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngoài ra, những cây đã bị nhiễm ngay
trong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phương pháp khử trùng
thông thường để loại bỏ vi sinh vật được.
• Để giải quyết những vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng.
Để tăng cường hiệu quả khử trùng của các chất khử trùng, người ta thường
rửa sơ mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các
chất khử trùng, ngoài ra có thể dùng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt
động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vô trùng
3 – 5 lần.

• Một số chất khử trùng thường được sử dụng như:
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 24
Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh
Chlorur thủy ngân (HgCl
2
): đây là chất khử trùng rất hiệu quả, thường
dùng với lượng rất thấp từ 0.01% - 0.05%, chất này rất khó đào thải, vì vậy
cẩn thận khi tiếp xúc.
Sodium hypochlorite NaOCl: có trong các dung dịch tẩy trắng 5 – 20%.
Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3
– 5 lần. Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của
mô về sau.
Calcium hypochlorite Ca(OCl)
2
: nồng độ khoảng 5 – 10%, xử lý mô cấy từ
5 – 30 phút.
Ethyl hay isopropyl alcohol 70%: thường sử dụng để lau sạch các vật liệu
nuôi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau
khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)
2
trong khoảng 1 – 5 phút.
Nước oxy già (H
2
O
2
): là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ở
nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi
sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H
2
O

2
là rất độc đối với mô thực vật, do đó
phải rửa thật sạch.
Khí Clo (Cl
2
): thường sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô.
Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): chất này ít độc đối với mô thực
vật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chất
này.
Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: những kháng sinh này có
tác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy. Dung dịch kháng
sinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy.
Sodium dichloroiso cyanurate (dichloroiso cyanuric acid sodium salt)
(NADCC): chất này ít độc đối với mô thực vật, vốn rất dễ tổn thương bởi
Ca(OCl)
2
và NaOCl, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước vô trùng sau khi
xử lý bằng chất này.
Iso thiazolone biocide (PPM): là một loại sản phẩm được chào bán của
viện Plant Cell Technology (Washington DC.) và được quảng cáo là :”… có
khả năng ngăn chặn sự tạp nhiễm vi sinh trong nuôi cấy mô thực vật”. Cũng
đã có những thử nghiệm và khẳng định công dụng diệt trùng của chất này
nhưng nếu sử dụng với nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thực vật.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 25