ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 QUI TRÌNH THU NHẬN BROMELAIN TỪ DỨA VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CHẤT TẨY RỬA SINH HỌC

ĐỒ ÁN CƠNG NGHỆ 1

QUI TRÌNH THU NHẬN BROMELAIN TỪ
DỨA VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
CHẤT TẨY RỬA SINH HỌC
1.1

1.2

1.3

Mục lục
Chương I: Tổng quan
Giới thiệu tổng quan về dứa
1.1.1 Sơ lược về dứa
1.1.2 Đặc điểm sinh học của dứa
1.1.3 Phân bố
1.1.4 Tình hình chế biến và xuất khẩu dứa
1.1.5 Thành phần dinh dưỡng trong dứa
Tổng quan về enzyme
1.2.1 Định nghĩa về enzyme
1.2.2 Phân loại enzyme
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme
1.2.4 Sự khác nhau về chất lượng enzyme và thị trường enzyme công
nghiệp
1.2.5 Enzyme protease
1.2.5.1 Giới thiệu sơ lược
1.2.5.2 Protease vi sinh vật
1.2.5.3 Protease động vật
1.2.5.4 Protease thực vạt
1.2.5.5 Ứng dụng của enzyme protease

Enzyme Bromelain
1.3.1 Giới thiệu
1.3.2 Tính chất vật lí
1.3.3 Tính chất hóa học
1.3.3.1 Cấu tạo hóa học
1.3.3.2 Cấu trúc khơng gian
1.3.4 Hoạt tính của bromelain
1.3.4.1 Cơ chế tác động
1.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính
1.3.4.3 Các chất bảo vệ enzyme


1.4
1.5

1.6

1.3.5 Ứng dụng của bromelain
1.3.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.6.1 Nghiên cứu trong nước
1.3.6.2 Nghiên cứu ngoài nước
Phương pháp thu nhận enzyme bromelain
1.4.1
Tổng quan về chất tẩy rửa
1.5.1 Định nghĩa
1.5.2 Phân loại
1.5.3
Chất tẩy rửa sinh học
1.6.1 Định nghĩa
1.6.2 Chất hoạt động bề mặt sinh học

1.6.3 Cơ chế tẩy rửa
1.6.3.1 Tẩy rửa chất bẩn là chất béo
1.6.3.2 Tẩy rửa vết bẩn dạng hạt
1.6.4 Enzyme trong chất tẩy rửa sinh học
1.6.5 Nguyên liệu và phương pháp sản xuất

1.1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Giới thiệu tổng quan về dứa:

1.1.1 Sơ lược về dứa:
Tên gọi khác: Dứa, Thơm, Khóm, Khớm,…
Tên khoa học: Ananas comosus.
Họ: Bromeliacease.
Tên nước ngoài: Pineapples.
1.1.2 Đặc điểm sinh học của dứa:
Dứa là một thực vật nhiệt đới có quả ăn được, là lồi thực vật có giá trị kinh tế
cao nhất trong họ Bromeliacease.


Một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao từ 1.0 đến 1.5m (3ft 3in đến 4ft 4in
và đôi khi có thể cao hơn.Cây có thân ngắn, chắc nịch với những chiếc lá dài. Dứa
có từ 30 lá trở lên hẹp, nhiều thịt, hình lịng máng, dài từ 30 đến 100cm và có gai
nhọn dọc theo mép lá. Khi tạo quả, nó thường tạo ra tới 200 bơng hoa, mặc dù một
số giống đậu quả lớn có thể vượt quá con số này. Khi nó ra hoa, các quả mọng kết
hợp tạo thành nhiều quả, nhỏ gọn. Quả dứa thường được sắp xếp theo hai hình
xoắn ốc lồng vào nhau.
Dứa thực hiện quá trình quang hợp CAM, cố định carbon dioxide vào ban đêm
và được lưu trữ dưới dạng axit malate, sau đó giải phóng nó vào ban ngày để hỗ trợ

quá trình quang hợp.
Dứa ra hoa tự nhiên vào tháng 2- 3 và thu hoạch vào tháng 4, 5, 6.
Dứa bao gồm năm giống thực vật, trước đây được coi là các loài riêng biệt:
 Ananas comosus var. ananassoides
 Ananas comosus var. bracteatus
 Ananas comosus var. comosus
 Ananas comosus var. cương thi
 Ananas comosus var. parguazensis
1.1.3 phân bố:
Dứa thích hợp với khí hậu ẩm áp , nhiệt đồ 22- 27C. Nếu quá nóng và quá rét
cây ngừng sinh trưởng. Mặc dù ưa ẩm nhưng không chịu được ngập úng, Lượng
mưa hàng năm 1200- 1500mm là thích hợp, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến năng
suất. Trồng dày, thiếu ánh sáng quả nhỏ, khơng ngọt.
Đất đồi đốc, tránh nắng, dễ thốt nước hay đất phèn nhẹ đều có thể trồng được.
Dứa là cây chịu hạn, chịu phèn (pH 4,5 -5,5).
Dứa là cây bản địa của Paraguary và miền nam Brasil, hiện nay vẫn tìm thấy
những giống dứa hoang dại ở đây. Philippines vẫn là một trong những nước xuất
khẩu dứa hàng đầu trên thế giới.


Tại Việt Nam, đứa được trồng khá phổ biến, từ Bắc đến Nam và phân bố nhiều
nhất từ Phú Thọ đến Kiên Giang. Diện tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với
sản lượng khoảng 500.000 tấn. Trong đó, 80% ở phía Nam và Tiền Giang là tỉnh có
sản lượng dứa đứng đấu cả nước.
1.1.4 Tình hình chế biến và xuất khẩu dứa:
Theo tài liệu hội thảo của Viện Nghiên Cứu cây ăn Quả Miền Nam, trong
những năm gần đây sản lượng dứa xuất khẩu của thế giới dao động khoảng 12,15 –
13.7 triệu tấn/năm. Châu Á có sản lượng dứa xuất khẩu lớn nhất, chiếm 52% sản
lượng dứa thế giới, tiếp theo là Châu Mỹ (31%), Châu Phi (15,4%), Châu Âu và
Châu Đại Dương chỉ chiếm 1,4%.

Các sản phẩm chế biến của dứa được lưu thông trên thế giới dưới dạng hộp và
nước dứa. Dứa hộp dồm có dứa khoanh, dứa rẻ quạt, dứa miếng, dứa nghiền. Nước
dứa gồm nước dứa cơ đặc và nước dứa thường. Trong đó các nước sản xuất và xuất
khẩu dứa nhiều nhất là Philippines, Thái Lan, Dominica, Honduras, Mexico,
Costaarica, Malaysia,.. Còn các nước là thị trường tiêu thụ dứa chính trên thế giới
gồm: Nhật, Italia, Pháp, Đức, Hà Lan, Canada, Mỹ, Tây Ban Nha, Bỉ,…
Ở Việt Nam, theo Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nơng
Thơn (1996) thì diện tích trồng dứa tồn quốc đạt 36.541 ha. Trong đó, diện tích
của các tỉnh miền Bác là 9.675 ha (chiếm 26,48%), diện tích dứa của các tỉnh miền
Nam là 26.866 ha (chiếm 73,52%), trong đó diện tích dứa của các tỉnh Đồng Bằng
Sông Cửu Long lên đến 22.787 ha, chiếm đến 62,36% diện tích dứa cả nước. Một
số tỉnh trồng nhiều dứa trong nước là: Kiên Giang: 12.006 ha, Minh Hải: 4704 ah,
Tiền Giang: 3889 ha, Thanh Hóa: 3097 ha,…
Về sản lượng dứa tươi, những năm gần đây cả nước đạt 234.000 tấn/ năm (theo
Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 1996). Tốc độ
tăng sản lượng đạt khoảng 10,7%/ năm. Vào những nmw đầu thập niên 1990, khi
thị trường tiêu thụ chính của nước ta là Đơng Âu tan rã thì ngành dứa bước vào
giai đoạn suy thoái. Tuy nhiên, bất chấp sự cạnh tranh gay gắt của những nước xuất
khẩu dứa khác, sự mở rộng thị trường xuất khẩu và tốc độ tăng trưởng sản lượng
đều đặn trong những năm gần đây là những tín hiệu đáng mừng cho thấy ngành sản
xuất dứa của Việt Nam đang phụ hồi dần (Đường Hồng Dật, 2003).
Dứa tươi Việt Nam hầu hết được tiêu thụ ở thị trường nội địa cịn dứa chế biến
thì xuất khẩu là chính, thị trường nội địa chiếm tỷ trọng không đáng kể (2 – 5%).
Trong những năm gàn đây, các sản phẩm dứa chế biến của Việt Nam đã được xuất
khẩu đi nhiều nước với nhiều mặt hàng khá đa dạng . Theo số liệu của Tổng Công


Ty Rau Quả Việt Nam (VGETEXCO), năm 2000, đã xuất khẩu được 4.967 tấn,
năm 2001 đạt 5.269 tấn sản phẩm.
1.1.5 Thành phần dinh dưỡng trong dứa:

Quả dứa có hàm lượng axit hữu cơ cao (axit malic và axit xitric).
Dứa còn là nguồn cung cấp mangan dồi dào cũng như có hàm lượng Vitamin C
và Vitamin B1 khá cao.
Trong 100g phần ăn chứa 25 kcal, 0,03mg caroten, 0,08mg Vitamin B1,
0,02mg Vitamin B2, 16mg Vitamin C (dứa tây). Các chất khoáng: 16mg Ca, 11mg
phosphor, 0,3mg Fe, 0,07mg Cu, 0,4g protein, 0,2g lipid, 13,7g hydrat cacbon,
85,3g nước, 0,4g chất xơ.
Trong quả dứa có chứa enzyme bromelain, có thể phân hủy protein. Do vậy,
quả dứa được sử dụng trong chế biến một số món ăn như thịt bò cào, thịt vịt để
giúp thịt nhanh mềm và tạo hương vị đặc trưng.

1.2 Tổng quan về enzyme
1.2.1 Định nghĩa về enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học khơng độc hại, có hoạt lực xúc tác mạnh và có
bản chất là protein. Enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, rất cần thiết cho rất nhiều
q trình hóa học trong tế bào và sinh vật sống (Giáo trình hóa sinh, Bùi Xn
Đơng).
Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể
sống, đảm bảo cho các q trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành
với tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định. Pavlov đã nói:
“Hoạt động đầu tiên của enyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Khơng có
sự sống nào lại khơng có q trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa
của Anghen: “Sự sống, đó là phương thức tồn tại của thể protein”.
1.2.2 Phân loại enzyme
Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme
ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ
thống phân loại, mỗi enzyme thường có bốn số: số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự ha
chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme.
Tên của các lớp, tổ và nhóm như sau:

i.
Oxidoreductase: xúc tác phản ứng oxy hóa khử


ii.

iii.
iv.
v.
vi.

a. Dehydrogenase
b. Oxidase
c. Oxigenase
d. Peroxidase
Transferase: xúc tác phản ứng vận chuyển nhóm
a. Acyltransferase
b. Glucosyltransferase
c. Aminotransferase
d. Phóphotransferase
Hydrolase: xúc tác phản ứng thủy phân
a. Peptide hydrolase
b. Lipase
Lyase: xúc tác phản ứng tạo liên kết đôi
a. Pyruvate decarboxylase
b. Fumarate hydrolase
Isomerase: xúc tác phản ứng đồng hóa
Ligase: xúc tác phản ứng kết gắn giữa các phân tử

Theo Hội Đồng Enzyme Quốc Tế được thành lập năm 1955 bởi Hội Liên Hiệp

Hóa Sinh Quốc Tế (Hội Liên Hiệp Hóa Sinh và Sinh Học Phân Tử QT)
Tên gọi enzyme theo số EC (enzyme commission):
Gồm 4 phần: a,b,c,d.
(a) Số đầu tiên: chỉ nhóm, 1 trong 6 nhóm, (kiểu phản ứng xúc tác).
(b) Số thứ hai: chỉ phụ nhóm (kiểu cơ chất hay liên kết bị phân cắt).
(c) Số thứ ba: chỉ phụ phụ nhóm (kiểu chất cho hay chất nhận điện tử, hay kiểu
nhóm được vận chuyển).
(d) Số thứ tư: chỉ thứ tự của enzyme trong phụ phụ nhóm.
Thí dụ
Enzyme bromelain thân có số EC 3.4.22.32: được ly trích từ thân, rễ, lá của cây
dứa.
Enzyme bromelain quả có số EC 3.4.22.33: được ly trích từ quả, vỏ.
(Nguồn: />
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme


Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản
ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ enzyme
Ảnh hường của nồng độ cơ chất: Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ
enzyme được giữ cố định và nồng độ cơ chất thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc
phản ứng tăng khi nồng độ cơ chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng,
đường biểu diễn uốn cong và với nồng độ cơ chất cao thì vận tốc khơng cịn gia
tăng nữa và đường biểu diễn tiệm cận với giá trị Vmax.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme
và tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản
ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới
hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm dẫn đến mức triệt tiêu. Nếu đưa nhiệt độ lên cao
hơn mức nhiệt độ tối ưu, họat tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme khơng có khả
năng phụ hồi lại hoat tính.Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC, enzyme bị hạn chế hoạt động
rất mạnh, nhưng đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối

ưu.
Ảnh hưởng của pH: Sự thay đổi pH gây nên sự biên đổi ion hóa của các nhóm
chức năng trên chuỗi polypeptide của enzyme, do đó làm thay đổi diện tích cần
thiết cho sự tạp thành phức hợp enzyme - cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều
nguyên thủy của chuoix polypeptide của enxyme. Và sự thay đổi mức độ ion hóa
của cơ chất, điền này cho phép hoặc ngăn cản sự tạ thành enzyme – cơ chất trong
trường hợp ph phải ở dạng ion. Như vây, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào
pH mooit trường. Đó là vì pH mơi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ
chất, enzyme và trung tâm hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh
hưởng đến độ bền của enzyme. Mỗi enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất
acid (từ 1,5 – 2), hoặt rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ưu của đa số các enzyme vào
khoảng chung quanh giá trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tố ưu của một enzyme
cung không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và
nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ.
1.2.4 Sự khác nhau về chất lượng enzyme và thị trường enzyme công nghiệp
Nồng độ enzyme thấp là nguyên nhân gây khó khăn trong sản xuất enzyme. Ba
lĩnh vực sử dụng enzyme có mức yêu cầu về số lượng và chất lượng rất khác nhau.

Lượng sử dụng
Độ tinh khiết

Enzyme
cơng
nghiệp
Hàng tấn
Khơng tính khiết

Nguồn gốc

Vi

sinh

Enzyme
phân
tích
Mg-g
Tinh thể tinh khiết
Vi sinh vật, động
vật, vật, thực vật,

Enzyme
dược
phẩm
Mg-g
Tinh thể tinh khiết
Vi sinh vật, động
vật, thực vật,


thường ngoại bào thường nội bào
thường nội bào
Một số có khả Không phát triển Cho đến nay chưa
Tái sử dụng năng
nhưng có khả có khả năng
nhiều lần
năng
cao
Thấp
Trung bình

Giá sản xuất
Bảng 1.2 sự khác nhau về chất lượng enzyme (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
Ứng dụng

Doanh số 1996
Doanh số ước đốn
(triệu đơla)
2006 (triệu đô la)
Thực phẩm
170
214
Chất tẩy
160
414
Dệt
27
32
Da thuộc
11
13
Bột giấy
1
5
ứng dụng khác
3
8
tổng
372
686
Bảng 2.1.2 Thị trường enzyme công nghiệp

(Nguồn: C.Wrotnowski, Genetic & Engineering Newa, pp, 14 and 30, Feb. . 1997.)
1.2.5 Enzyme protease
1.2.5.1 Giới thiệu sơ lược
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết
peptide (-CO-NH-) của phân tử protein và peptide thành các acid amin tự do, một
ít peptide ngắn, pepton.
1.2.5.2 Protease vi sinh vật
Protease từ vi khuẩn: Protease serine từ vi khuẩn B. subtilis.
Protease serine từ nấm Aspergillus.spp.
Metalloprotease (protease kim loại).
Carboxyl protease (protease acid).
Enzyme rennet từ vi sinh vật.
1.2.5.3 Protease động vật
Protease
Pepsin
Chymosin
Trypsin

pH
1,5 – 4,0
5–6
6,5 – 9,0

Chất hoạt hóa
H+, proteaase
Ca2+
Endrkinase, Ca2+


Chymotrypsin

Carboxypeptidase
aminopeptidase
Bảng Protease động vật

7,0 – 8,5
6,0 – 8,5
6,5 – 8,0

Ca2+
Trypsin
-

1.2.5.4 Protease thực vật
Protease thực vật tập trung chủ yếu ở một số cây vùng nhiệt đới như đu đủ, dứa,
cây sung, articho và đậu tương. Tất cả protease thực vật đều cùng thuộc một nhóm
enzyme chứa gốc -SH trong tâm hoạt động. Thí dụ: papain từ mủ đu đủ, bromelain
từ dứa, ficin từ quả sung.
1.2.5.5 Ứng dụng của enzyme protease
Trong các loại enzyme thì enzyme protease có vai trị quan trọng hơn cả vì nó thủy
phân protein. Protein đóng vai trị vơ cùng thiết yếu đối với đời sống con người, nó
là thành phần dinh dưỡng cơ bản của người và vật nuôi, là nguồn cung cấp vật liệu
như da, lông, tơ phục vụ sản xuất nhằm nâng cao chất lượng cũng như gia tăng thời
gian bảo quản
Sản phẩm
Ứng dụng
Bia
Làm tan protein hạt, làm ổn định bia
Phomat
Tủa protein sữa và làm chín phomat.
Làm mềm thịt

Cắt một phần mơ liên kết.
Bánh mì
Tăng độ dẻo của gluten.
Bánh kẹo
Tăng độ dịn.
Da
Loại bỏ lơng, tóc, sắc tố, làm mềm da.
Chất tẩy rửa
Tẩy rửa vết protein.
Bảng ứng dụng protease trong công nghiệp.
Hiện nay chế phẩm rotease thương mại một phần có nguồn gốc từ động vật và thực
vật, nhưng chủ yếu là từ vi sinh vật (Nguyễn Tiến Thắng, 2004).
1.3

Enzyme Bromelain
1.3.1 Giới thiệu

Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromelacease, đặc biệt
là từ thân (EC 3.4.22.32) và trái dứa (EC 3.4.22.33). ở mỗi bộ phận khác nhau thì
bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.


Bromelain có trong tồn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là
nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein
để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide
Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfhydryl thủy giải protein. Khi
chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của bromelain thì thu
được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro
1.3.2 Tính chất vật lí
Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enyme

bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:
Trọng lượng phân tử: 33.200 – 33.500 Da
Hằng số sa lắng: 2,73 S
Thể tích riêng phần: 0,743 ml/g
Độ nhớt bên trong: 0,039 dl/gam
Hằng số khuếch tán: 7,77- 10 cm.sec
Tỷ số ma sát f/fo: 1,26
Sự hấp thụ Al%cm: 20,1acm
Điểm đẳng điện pI: 9,55
Bromelain trích từ quả là protease acid với điểm đẳng điện pI: 4,6
(Murachi, 1964; trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng)
Alfonso và cộng sự 1994 qua nghiên cứu thực nghiệm đã cho rằng bromelain thân
có trọng lượng phân tử 25.400kD.
1.3.3 Tính chất hóa học
1.3.3.1 Cấu tạo hóa học
Bromelain thân là glycoproteinbase gồm phần protein và phần phi protein.
Phần phi protein là một glucide, ở mỗi phân tử gồm 3 manose, 1 xylose, 1 fructose
và 2 glucosamine. Glucosamine là phần nối trực tiếp với mạch polipeptide của
phần protein. Sợi hydrate carbon liên kết hoán vị với polypeptide. Trong sợi
hydrate carbon này dường như một nửa sợi không liên quan đến cơ chế xúc tác của
phân tử.


Cấu trúc phần hydrate carbon của bromelain thân (Yasuda và ctv, 1970):

Hình cấu trúc phần hydrate carbon của bromelain thân
Tùy từng phương pháp thu nhận và phương pháp thí nghiệm, thành phần
bromelain thân và quả khác nhau. Bromelain quả (ép từ quả) là protease acid với
điểm đẳngg điện là 4,6: cấu tạo hơi khác so với loại enzyme treenn.
Bromelain thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321 – 144 acid

amin và 283 – 162 đối với bromelain quả.
Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu
-NH2 là valine và đầu carboxyl và glycine; còn đối cới bromelain quả, acid amin
đầu -NH2 là alanine. (Nguyễn đức lượng, 2004)
1.3.3.2

Cấu trúc không gian

Cấu trúc bậc một của bromelain theo Murachi và Bussain:

Bromelain cũng như papain, ficin đều là các protease có tâm hoạt động chứa
cystein với cầu nối -S-S- (disulfur) giữa 2 sợi polypeptide với nhau.
Tâm hoạt động -Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Ao.


Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu.
Bromelaon có một nhóm sulfuhydryl cần cho hoạt tính xúc tác với 5 cầu nối
disulfid ở mỗi phân tử. Ngoài ra trong bromelain thân cịn có sự hiện diện của
ZN2+ với hàm lượng 2 mg/gram enxyme có lẽ đóng vai trị duy trì cấu trúc khơng
gian của enzyme (Nguồn: Yasuda và ctv, 1970).
1.3.4 Hoạt tính của bromelain
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính bromelain kể từ 3 tháng trước khi chín. Trong đó
hoạt tính cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín, hoạt tính
bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn.
Một số nghiên cứu cho thấy bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ
chất khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain
mạnh hơn papain gấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai
enyme này tương đương nhau. Đối với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải
bromelain yếu hơn papain.
Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính

esterase ở bromelain hơn papain và ficin (Nguyễn Đức Trọng, 2004).
1.3.4.1

Cơ chế tác động

Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trị của nhóm -SH của cystein, nhóm
imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain.
Nhóm -SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của
cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt).
Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm amino
của chất nhận khác.
Cầu nối S-S có vai trị duy trì cấu trúc khơng gian của bromelain.
Casein và hemogolobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.
Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide
và acid amin. Protein kết hợp với nhóm -SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi
nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide.
ở giai đoạn đầu, Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm -SH của tâm
hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết


phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin,
carboxyl,..)
Enzyme-SH + Zn2+ -> enzyme-S-Zn + H+
Do vậy nhóm -SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc
khơng gian được bảo vệ ổn định.
1.3.4.2

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính

Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng

bởi các yếu tố nhưu: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion
kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch.
Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của
bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác:
bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của chất hoạt hóa,
thời gian phản ứng.
1.3.4.3

Các chất bảo vệ enzyme

Tác nhân bảo vệ có vai trị quan trọng trong q trình đơng khơ. Một chất bảo
vệ tốt phải bảo vệ tế bào ở nhiệt độ thấp trong suốt q trình lạng đơng, dễ làm khơ
và tạo hỗn hợp ổn định, dễ hịa tan lại vào nước. nhiều nhóm chức đã được kiểm
tra về khả năng bảo vệ của chúng: polyol, polysaccharide, disaccharide, amino
acid, protein, muối, vitamin, khoáng, acid hữu cơ. Tuy nhiên khả năng bảo vệ của
từng nhóm chức thay đổi đối với từng loại phân tử sinh học. Có 4 nhóm năng chặn
tác hại của q trình đông khô đã được nghiên cứu, kiểm tra:
Đường: trehalose, lactose, maltose, sucrose, fructose, glucose bổ sung với tỉ lệ
10%
Acid amin: natri glutamate (2,5%), dịch trích nấm men (4%).
Polyol: sorbitol (5%), mannitol (5%).
Dung dịch đệm phosphate.
Đường tái sắp xếp cấu trúc của nước trong phân tử protein khi hòa tan lại vào
nước và ngăn cản sự uốn cong, hợp chất bằng cầu nối hydro giữa các gốc phân cực
ủa protein.


Acid amin bảo vệ bằng cách phản ứng với nhóm carboxyl của protein và nhóm
amin của tác nhân bảo vệ nhờ đó mà nó ổn định cấu trúc của protein. Cystein ngăn
cản sự oxi hóa nhóm -SH thành cầu nối -S-SPolyol làm cho dung dịch chứa chúng nhanh chóng bị kết tinh trong q trình

đơng khơ nhờ vậy có thể bảo vệ được các phân tử sinh học (nguyễn đức lượng,
2002).
1.3.5 Ứng dụng của bromelain
Trong công nghiệp thực phẩm: sử dụng enzyme bromelain trong lên men nước
mắm ngắn ngày (Beddows và Ardeshir, 1979, Salem và ctv, 1995). Làm mềm thịt
(Melendo và ctv, 1996)
Trong y dược học: ngăn ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con (Mynott và tcv, 1996;
Chandler và ctv , 1998). Trợ tiê hóa (Nielsel và ctv, 1991). Điều trị các bệnh nhiễm
trùng (Jayaran và ctv,1991; Tanabe và ctv, 1996; Kelly, 1996; Maurer, 2001;
Anthony và Cichoke, 1998).
1.3.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.6.1 Nghiên cứu trong nước
ở nước ta có nhiều cơng trình cơng bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme
bromelain, các cơng trình cơng bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch
và khả năng ứng dụng của enzyme này. Một số công trình nghiên cứu về enzyme
bromelain như:
Phạm Thị Trân Châu và tcv (1987) nghiên cứu một số tính chất của enzyme
bromelain tách từ chồi dứa tây cho thấy trong chồi dứa có chứa hai protease và
bromelain có hoạt tính cực đại ở pH 6,5, nhiệt độ tối ưu là 60oC.
Lê Thị Thanh Mai (1997) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng
bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng
aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có
thể tinh sạch bromelin bằng phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao.
Nghiên cứu này còn cho thấy có thể sử dụng bromelain để rút ngắn thời gian chế
biến nước mắm.
Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng (2002) nghiên cứu các điều kiện
nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain từ nước dứa thô cho thấy có thể
thu nhận và tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột SPStreamline với hiệu suất cao.

Dương Thị Hương Giang và ctv (2005) nghiên cứu tinh sạch Bromelin từ phụ
phẩm vỏ dứa cho thấy có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp sắc ký gel mở
rộng với hệ thống cột Streamline 50 và gel trao đổi ion âm SPStreamline XL
(Pharmacia) với hiệu suất cao.
1.3.6.2

Nghiên cứu ngoài nước

Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu
nhận nhưng chưa tinh sạch.
Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp
phụ. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính
chất của enzyme cũng như protein. Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách
được Chymosin. Wurtz (1879) chiết tách được papain, Crassman và Ambros
(1926) chiết tách được bromelain…
Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm
papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu
của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri
và shark). Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất
so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao
hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%.
Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung
polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của
bromelain đƣợc tăng lên.
Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân
protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác.
Stein (2004) sử dụng enzyme protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại
Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao.

1.4 Phương pháp thu nhận enzyme bromelain

1.4.1
1.5 Tổng quan về chất tẩy rửa
1.5.1 Định nghĩa
1.5.2 Phân loại


1.5.3
1.6 Chất tẩy rửa sinh học
1.6.1 Định nghĩa
1.6.2 Chất hoạt động bề mặt sinh học
1.6.3 Cơ chế tẩy rửa
1.6.3.1 Tẩy rửa chất bẩn là chất béo
1.6.3.2 Tẩy rửa vết bẩn dạng hạt
1.6.4 Enzyme trong chất tẩy rửa sinh học
1.6.5 Nguyên liệu và phương pháp sản xuất

I. Mục đích:
- Trong số các chất gây ô nhiễm khác nhau, chất tẩy rửa là một chất
ơ nhiễm quan trọng có nguy cơ nghiêm trọng đối với hệ sinh thái
tự nhiên. Hơn nữa, chất tẩy rửa có thể đi vào các nhà máy xử lý
nước thải và có ảnh hưởng xấu đến hoạt động của chúng. Chúng


-

-

-

-

-

-

là một phần của cuộc sống con người và được tiêu thụ cho các
mục đích khác nhau, đặc biệt là mục đích vệ sinh.
Do đó các thành phần chất ty rửa có thể xâm nhập vào đất và các
vùng nước từ các nguồn khác nhau. Chất tẩy rửa ảnh hưởng đến
động thực vật và chúng có ảnh hưởng trực tiếp cũng như gián tiếp
đến hệ sinh thái.
Các nhà nghiên cứu khẳng định rằng các q trình hiếu khí có thể
phân hủy hầu hết các chất tẩy rửa nhưng quá trình phân hủy kỵ
khí là khơng thể vì các con đường trao đổi chất bị hạn chế và độc
tính của chúng
Nhu cầu về dứa ngày càng tăng góp phần tạo ra sản lượng dứa
khổng lồ, và do đó, một lượng lớn chất thải được tạo ra. Khoảng
80% các bộ phận của dứa, bao gồm ngọn, vỏ, lá, lõi và thân, bị loại
bỏ trong quá trình chế biến, vận chuyển và bảo quản dứa và cuối
cùng là chất thải.
Những chất thải này chứa độ ẩm cao, đường, albumin, lipid và
vitamin dễ bị vi sinh vật làm hỏng do đó góp phần gây ra các vấn
đề về môi trường. Chất thải chưa được khai thác và thường là đối
tượng chôn lấp. Lượng chất thải ngày càng tăng trong bãi chôn lấp
gây ra các vấn đề nghiêm trọng về mơi trường vì nó ức chế nhu
cầu oxy sinh học và hóa học của các hệ sinh thái, ô nhiễm địa điểm
và tăng nguy cơ mắc các bệnh truyền nhiễm. Chôn lấp, đốt, nhiệt
phân và khí hóa, ủ phân và phân hủy kỵ khí là những kỹ thuật phổ
biến trong việc quản lý các chất thải này.
Những chất thải này có thể được chuyển đổi thành các sản phẩm

có giá trị thơng qua các q trình sinh hóa khác nhau (lên men vi
sinh vật và phân hủy kỵ khí), nhiệt hóa (nhiệt phân, khí hóa, đốt và
thiêu hủy) và hóa lý (transesterification) để tạo ra năng lượng và
các sản phẩm sinh học.
Chất thải dứa là một nguyên liệu tiềm năng để sản xuất vật liệu
phân hủy sinh học do sự hiện diện của chất xơ. Sự hiện diện của


các hợp chất thơm bên trong chất thải dứa như 2-heptanol,
propanol và 3-hexanone làm tăng khả năng biến các chất thải này
thành tinh dầu. Hàm lượng đường cao, chất chống oxy hóa, các
hợp chất hoạt tính sinh học và enyme bromelain cùng sự hiện
diện của các nhóm carbonyl, hydroxyl, lignin, hemicellolose và
cellu bị mất, các sản phẩm phụ bên trong dứa đã làm tăng khả
năng sử dụng các chất thải này như sản xuất nhiên liệu sinh học và
khí sinh học
- Dứa là một phần chất thải hiện tại, tập dụng nguồn enzyme có
trong dứa để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
- Vì vậy, sản xuất chất tẩy rửa thân thiện với môi trường là một vấn
đề quan trong trên toàn thế giới
- Trước đây, chất thải của dứa cũng đã được tận dụng để tạo thành
chất chống oxy hóa phenolic, chất chống nhuộm và làm thức ăn
chăn nuôi.
II. Giới thiệu tổng quan về chất tẩy rửa:

1. Định nghĩa chất tẩy rửa:
- Sự tẩy rửa được định nghĩa là “làm sạch bề mặt của một vật thể rắn, với
một tác nhân riêng biệt, chất tẩy rửa, theo một tiến trình lý hóa khác hẳn
với việc hịa tan thơng thường”
- Chất tẩy rửa (detergent) là một chất hoạt động bề mặt hoặc một hỗn hợp của

các chất hoạt động bề mặt với tính chất làm sạch ở trạng thái dung dịch lỗng.

-

Là các hợp chất hữu cơ lưỡng tính - chứa nhóm kỵ nước (khơng phân cực)
và nhóm ưa nước (phân cực) một đầu tan trong nước vàmột đầu không tan
trong nước (tan trong dầu)

2. Phân loại chất tẩy rửa
Tùy thuộc vào điện tích của chất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặt là những hợp chất làm giảm sức căng bề mặt giữa hai
chất lỏng, giữa chất khí và chất lỏng, hoặc giữa chất lỏng và chất rắn. Chất hoạt


động bề mặt có thể hoạt động như chất tẩy rửa, chất làm ướt, chất nhũ hóa, chất
tạo bọt hoặc chất phân tán
- Chất tẩy rửa không ion
- Chất tẩy rửa ion
 Cation
 Anion
 Lưỡng tính
3. Cơ chế hoạt động của chất tẩy rửa:
- Dung dịch tẩy rửa trong nước làm giảm sức căng của nước, nước thấm sâu vào
xơ sợi.
- Quá trình lấy bẩn ra.
- Quá trình chống tái bám chất bẩn.
- Chất hoạt động bề mặt tạo bọt, chất bẩn không tan tập trung lên bề mặt bọt và
bị đây ra ngoài hay phân tán vào trong dung dịch ở dạng huyền phù, treo lơ
lửng.
4. Chất tẩy rửa sinh học:

- Chất tẩy rửa sinh học là một loại chất tẩy rửa được tìm thấy và phân tách từ
nguồn gốc “sinh học” như thực vật, vi sinh vật,..
- Hoạt động nhờ vào các enzyme được tạo ra từ công nghệ sản xuất enzyme
có khả năng tẩy sạch các chất bẩn bám
 Ưu điểm:
- An tồn, khơng chứa chất độc hại, khả năng phân hủy sinh học nên rất thân
thiện với môi trường.
 Nhược điểm:
- Khả năng tẩy rửa nhẹ hơn so với những chất tẩy rửa hóa học
- Được sử dụng thơng thường, có thể bị phụ thuộc vào nhiệt độ,…

III.Giới thiệu tổng quan về dứa:
1.
-

Định nghĩa:
Là một thực vật nhiệt đới có quả ăn được
Tên gọi: Dứa, Thơm, Khóm, Khớm
Tên khoa học: Ananas comosus
Họ: Bromeliacease


- Tên nước ngoài: Pineapples
- Dứa là cây bản địa của Nam Mỹ, tại Việt Nam được trồng khá phổ biến từ
Phú Thọ đến Kiên Giang

2. Đặc điểm:
-

Dứa là một loài cây thân thảo sống lâu năm.

- Cao từ 1 đến 1.5m
- Cây có thân ngắn, chắc nịch với những chiếc lá dài, có hình dạng giống mũi
mác và có mép lá với răng cưa hay gai
- Hoa mọc từ phần trung tâm của cụm lá, mỗi hoa có các đài hoa riêng và trở
thành mập chứa nhiều nước và phát triển thành dạng phức hợp gọi là quả
dứa
- Dứa ra hoa tự nhiên vào tháng 2-3 và thu hoạch vào tháng 4,5,6
3. Thành phần dinh dưỡng của dứa:
- Quả dứa có hàm lượng axit hữu cơ cao (axit malic và axit xitric)
- Là nguồn cung cấp mangan dồi dào cũng như có hàm lượng vitamin C và
vitamin B1 khá cao
- Có chứa enzyme bromelain, carbohydrate, protein,..
4. Ứng dụng:
….

III. Cơng nghệ enzyme:
1. Khái niệm:
- Enzyme là chất xúc tác sinh học khơng độc hại, có hoặt lực xúc tác mạnh và
có bản chất là protein enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, rất cầnthiết cho
rất nhiều q trình hóa học trong tế bào và sinh vật sống
- Công nghệ enzyme là một trong những lịch vực của công nghệ sinh học hiện
đại, đó là một ngành sản xuất ra các chế phẩm enzyme.
2. Bromelain:
- Là một loại enzyme có mặt trong tất cả các bộ phận của cây dứa, có nhiều
ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau


- Bromelain là một hỗn hợp của các enzyme phân giải protein sulfhydryl và là
một enzyme protease

- Do độc tính thấp, hiệu quả cao, tính khả dụng cao và tương đối đơn giản
trong việc thu nhận, nó là đối tượng được các nhà khoa học qua tâm không
ngừng.
- Protease (proteinase, peptidase, hoặc enzyme phân giải protein) là một
nhóm phức tạp của các enyme được tìm thấy trong nhiều loại sinh vật, bao
gồm cả thực vật, động vật và vi sinh vật. chúng thực hiện nhiều chức năng
thiết yếu trong các q trình khác nhau, chẳng hạn như tiêu hóa, kiểm sốt
tăng sinh, tăng trường và chết tế bào, điều hịa tổng hợp protein và thối
hóa. Chúng cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc sao chép và lây lan
của virut, vi khuẩn và kí sinh trùng.
- Bromelain, protease chính của Ananas comosus, được gọi là chất chiết xuất từ nước ngọt thô

-

-

-

thu được thương mại từ thân của quả dứa. Nó đã được biết đến về mặt hóa học từ năm 1876 và
công việc phân lập bromelain bắt đầu vào năm 1894 [12,13]. Về mặt hóa học sinh học,
bromelain là một hợp chất khơng độc, có giá trị chữa bệnh, được phân loại như một loại enzyme
tiêu hóa protein protease.
Một số nhóm đã cung cấp bằng chứng đáng kể về hiệu quả kháng khuẩn của bromelain trong
một loạt các thí nghiệm cổ điển sử dụng các lồi vi khuẩn khác nhau [98]. Dữ liệu do Zharfan [99]
cung cấp rất hấp dẫn vì nó cung cấp thơng tin cần thiết về tính chất kháng khuẩn của dịch chiết
dứa (Ananas comosus L. Merr) có chứa saponin và bromelain. Sử dụng Pseudomonas aeruginosa
đa kháng thuốc, các tác giả cho rằng chiết xuất dứa đã ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Zharfan
và cộng sự. [99] chấp nhận giả thuyết rằng bromelain, với tư cách là một enzym phân giải
protein, gây ra sự phân hủy protein do enzym ở màng bề mặt, cuối cùng làm suy yếu thành tế
bào, dẫn đến rò rỉ tế bào, sưng lên, phá vỡ trong màng vi khuẩn và làm hỏng tế bào. Tuy nhiên,

các tác giả nhấn mạnh rằng cơ chế hoạt động chính xác của bromelain đối với vi khuẩn Gram âm
vẫn chưa được hiểu đầy đủ.
Dữ liệu về hiệu quả kháng khuẩn của bromelain cho thấy hoạt tính tuyệt vời của nó đối với vi
khuẩn, đặc biệt phổ biến khi nhiễm trùng miệng — Enterococcus faecalis [100,101], Strepto
coccus mutans [101–104], Streptococcus sanguis [102], và Staphylococcus aureus [105] —chính
như viêm nha chu, nhiễm trùng ống tủy, áp xe quanh răng, hoặc sâu răng. Trong mọi trường hợp,
bromelain đã được chứng minh là có tác dụng kháng khuẩn mạnh, dẫn đến ức chế sự phát triển
và chết của vi khuẩn. Điều đáng chú ý là, như nghiên cứu từ Anjos et al. [106.107] cho thấy,
bromelain cũng có thể được ứng dụng trong ngành cơng nghiệp thực phẩm do tiềm năng kháng
khuẩn đáng kể của nó đối với các chủng Alicyclobacillus. Bromelain cho thấy hoạt động ức chế và
diệt khuẩn hiệu quả ở nồng độ thấp đối với các loài Alicyclobacillus.
Ataide et al. [108]. Các tác giả đã sử dụng nanocellulose của vi khuẩn có chứa bromelain. Đánh
giá hoạt động kháng khuẩn của bromelain đối với E. coli, S. aureus và P. aureoginosa cho thấy
hoạt tính kháng khuẩn đáng kể của nó. Hơn nữa, việc kết hợp vào nanocellulose của vi khuẩn
làm tăng hoạt tính kháng khuẩn.


-

Ahamed và cộng sự. [101] nêu vấn đề quan trọng là tăng hoạt tính kháng khuẩn của các dịch
chiết bromelain tùy thuộc vào quy trình tinh chế thích hợp. Các kết quả đáng kể thu được bởi
Amini et al. [109] và Hidayat và cộng sự. [110] cung cấp bằng chứng rằng q trình tinh chế hóa
lý thích hợp của chiết xuất bromelain ảnh hưởng đến hiệu quả của hoạt tính kháng khuẩn.

3. Ứng dụng:
- Công nghệ enzyme ứng trong nhiều lĩnh vực như y dược, công nghiệp, nông
nghiệp,
- Enzyme bromelain được sử dụng trong y dược, thực phẩm,..
- Enzyme bromelain phân hủy vết bẩn dạng protein trên vải
/>