Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis TS Đinh Thị Thu Hằng

HỌC VIỆN QUÂN Y

HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020

Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated
isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn
Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis

TS. Đinh Thị Thu Hằng
Hà Nội, T12 - 2020

1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Burkholderia pseudomallei và melioidosis
-

Gram âm hoại sinh, gây bệnh melioidosis - viêm phổi, đa áp-xe,
tử vong 40%.
Phân bố: bùn đất, nước các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
A. Whitmore (1911)
Melioidosis: cấp và mạn tính - triệu chứng khơng đặc hiệu, dễ
nhầm lẫn chẩn đốn, bỏ sót ca bệnh (“bệnh lao Việt Nam”).

“Bom hẹn giờ Việt Nam”

Wiersinga, W. J., et al. (2012). "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44.
Chen, Y. L., et al. (2014). PLoS Negl Trop Dis 8(5): e2877. 2

Áp-xe do melioidosis
White NJ (2003), Lancet, 361 (9370) , p1715–1722 3


Phân bố Melioidosis trên toàn cầu

-

Bắc Australia (viêm phổi ->tử vong phổ biến nhất (Currie B. J. 2015))
Đông Nam Á (Đông Bắc Thái Lan, bệnh nhiễm trùng tỷ lệ tử vong cao thứ 3, sau HIV/
AIDS và lao)
1 số vùng châu Á, châu Mỹ, châu Phi (Limmathurotsakul D. et al. 2010, 2012).
NC mô phỏng:165.000 ca melioidosis ở người/ năm, 89.000 ca tử vong/ 80 quốc gia
(Limmathurotsakul D. et al. 2016), (Gohler A. et al. 2017) -> khó khăn trong xét nghiệm.
Wiersinga, W. J., et al. (2012). "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44. 4
Rotz, L. D., et al. (2002). Emerg Infect Dis 8(2): 225-230.


B. pseudomallei gây bệnh
Độc lực: nội độc tố (phức hợp protein - lipopolysacharit)
Đường lây:
• Sol khí, tiếp xúc với đất ô nhiễm qua da trầy xước: thể phổi, ápxe
phủ tạng, NKH. Điều kiện thuận lợi cho lây nhiễm: tiếp xúc nhiều
với nước, bùn, động vật bị bệnh (ngựa, trâu, bò), suy giảm MD.
•

Trong đất, cánh đồng lúa, nước tù đọng, thường gặp mùa mưa lũ.

5
(Perumal Samy R. et al. 2017)

Phịng và điều trị
- Chưa có vắc xin, phịng khơng đặc hiệu
- Điều trị: Phẫu thuật làm sạch vết thương + Phối hợp thuốc
• Imipenem, doxycyclin, ceftazidim, …: 2 tháng tấn cơng, 3-6T
duy trì (thể nặng 12T).
• Thể phổi >6T, phẫu thuật cắt bỏ thuỳ phổi -loại bỏ các ápxe
phổi.
• Dễ tái phát, thời gian, kinh phí
=> Quân số, sức chiến đấu

6


B. pseudomallei và vũ khí sinh học
• B. pseudomallei được liệt kê trong danh mục các tác
nhân sinh học nhóm B, có tiềm năng sử dụng làm vũ khí
sinh học (VKSH).
• Hệ gen B. pseudomallei giống đến 99% so với B. mallei được SD làm VKSH bởi quân đội Đức, Nhật, Nga
• Quân đội Mỹ đã nghiên cứu B. pseudomallei để chế tạo
VKSH.

7


Hệ gen B. pseudomallei

Gene TTSS1
AF074878

NST số 1: 3.460 CDS
Trao đổi chất, tăng trưởng

NST số 2: 2.395 CDS
Thích ứng, tồn tại
Holden et al. (2004),10.1073/pnas.0403302101.

8


Các phương pháp xác định
Nuôi cấy: MT Ashdown - “tiêu chuẩn vàng”- 5-7 ngày

Huyết thanh học, miễn dịch: độ nhạy và độ đặc hiệu
không cao
PCR, real-time PCR: nguồn điện ổn định, PTN, nhân lực
- chưa đáp ứng thực tế hiện trường
9


Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP
(Loop mediated isothermal Amplification)
-

Khuếch đại DNA nhanh chóng - điều kiện đẳng nhiệt, sản phẩm là
DNA mạch vòm 109-1010 lần, hiệu quả cao (Notomi T. et al. 2000).

-

Bst DNA polymerase & 4 mồi được thiết kế đặc biệt, sản phẩm có
thể đánh giá bằng mắt thường về độ đục, màu sắc.

10


Ưu điểm của LAMP
•
•
•
•
•
•

Tiết kiệm
Độ nhạy, đặc hiệu cao
Dễ dàng thực hiện, thích hợp cho các loại tác nhân
Nhanh: khoảng 1-1,5 giờ
Thiết bị ổn nhiệt để duy trì nhiệt độ khơng đổi từ 60 - 65°C.
Khơng địi hỏi DNA tinh sạch cao.
=> Tiêu chí ASSURED test (affordable, sensitive, specific, userfriendly, rapid and robust, equipment-free and deliverable to
end users) - thực địa.
-

real-time LAMP: kết hợp =>giúp rút ngắn thời gian, đơn giản
hóa q trình phát hiện B. pseudomallei

11
(Kaneko H. et al. 2007, (Njiru Z. K. 2012)

Thế giới
•

Hơn 100 XN LAMP chẩn đốn mầm bệnh ở người và động
vật: virus Dengue (Parida M. et al. 2005), vi khuẩn lao (Geojith
G. et al. 2011), S. aureus (Lim K. T. et al. 2013), KST sốt rét
(Wu L. et al. 2015)... (Eiken Chemical Co. Ltd).

•

B. pseudomallei: Kỹ thuật LAMP gen đích TTSS1 và đánh giá
ở Đơng Bắc Thái Lan, ngưỡng: 38 copy/ phản ứng, mẫu lâm
sàng Se 44%, Sp 98,4% (Chantratita N. et al. 2008).

•

Năm 2016: LAMP với hóa chất đông khô chưa được mô tả chi
tiết (Michelle Wong Tzeling J. et al. 2016).

12


B. pseudomallei ở Việt Nam?
•

•
•
•
•

•

Đến 1973, có 343 ca melioidosis được ghi nhận trên lính Mỹ
tham chiến tại Việt Nam (Schulin T. et al. 2001)+ một số chó
nghiệp vụ. ~225.000 lính Mỹ có khả năng bị phơi nhiễm B.
pseudomallei khi trở về nước (Perumal Samy R. et al. 2017).
6 BN nhiễm B. pseudomallei ngoại thành Hà Nội (1993).
73 (+)/ 147 cánh đồng lúa miền Nam (1999).
Báo cáo các ca lâm sàng: BV Chợ Rẫy 2009-2011, 80 ca/ năm;
BV TƯ Quân đội 108 (2015), BV Bạch Mai (2016),…;
TT Trung&cs(2016) NC đặc điểm phân bố B. pseudomallei ở
Bắc Trung Bộ, real-time PCR: 77 chủng/ 70 BN.
Mưa lũ lịch sử, đến hết tháng 11/2020, ghi nhận số ca tăng đột
biến, 5 ca tử vong.
Quyết định 6101/QĐ-BYT 30/12/2019 HD chẩn đoán & điều trị bệnh Whitmore 

BV quân đội + địa bàn đóng quân, lân cận?
Công cụ phát hiện tại thực địa?

13


Đề tài cấp BQP: “Xây dựng QT và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán
nhanh tại hiện trường VK B. pseudomallei”. Mã số: 2019.75.027.
14


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Mẫu chủng
B. p

PCR,
cloning 

B. pseudomallei, B. cepacia,
P. aeruginosa

Giải trình
tự
Thiết kế mồi
gen TTSS1

Primer 3
PrimerExplorer V.5

GenBank 
PCR, real-time PCR

Thiết lập
LAMP

PP: Thực nghiệm mơ tả,
phân tích trong PTN.

Đánh giá 

real-time LAMP

• Độ nhạy, độ
đặc hiệu

• So sánh
15


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Gene TTSS1
AF074878

PCR: primer BpF/R, sản phẩm: 723 bp
BpF

qBpF qBpR

BpR

Real-time PCR: primer qBpF/R, probe qBp-Pr, sp: 105 bp

LAMP và Real-time LAMP: các set primer LAMP gồm 2-3 cặp
FIP/ BIP, F3/ B3, LB/LF vùng gene TTSS1 (The type III secretion system)
TTSS1

16


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nhân dòng thiết lập chứng dương gen TTSS1

723 bp

PCR TTSS1-orf11 trên gel agarose 1,2%

M: Marker 100bp (Thermo Scientific); 1: ĐC âm;
2- 6: Mẫu B. pseudomallei Bp1-Bp5
17


Thiết kế phản ứng TTSS1 real-time PCR
Phản ứng real-time 20 µl PCR tối ưu : QuantiTect probe PCR 1X; qBp (F1+R1)
0,2 µM; probe qBp 0,05 µM; mồi IC (F+R) 0,2 µM; probe IC 0,05 µM; 5 µl DNA.
Chu trình: (50oC/ 2 phút) (95oC/ 15m) (94oC/ 15s; 60oC/ 60s; 70oC/ 30s)x 45 chu kỳ.

Real-time PCR
LOD95%=14,6 copy/rxn,
độ tin cậy 95%.
PCR LOD: 500
copy/rxn

18


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thiết kế các bộ mồi LAMP
TT

1
2
3
4

1
2

3

Tên mồi
 
Bộ mồi 1
F3
B3

58,01
57,88

Bp-F3
Bp-B3

60,01
59,48

Bp-FIP

Bp-BIP
Bp-BIP-4T

5
6

To gắn mồi
(Ta: oC)

TCCTGCTCCCACACCG
CCGCTTGCGCGTCAT

CCACAGCAACGGAAAGAGCAGAFIP
GCTTGCGGCCGAGATC
GCCTCGATTGCGCGATCGCCBIP
TGTTGCTAGCGGATTGTCA
Bộ mồi 2, bộ mồi 3

Bp-FIP-4T
4

Trình tự (5’-3’)

Bp-LF
Bp-LB

CAATCTCACCAGCGTTCCA
CCGGCCTCAATTCATC
GCGCAGATGCCTGTCGATCACCGCCAACCTTTCCACA
GCGCAGATTGCCTGTCGATCATTTTCCGCAACCTTCCAACA
CGGCACAACCTGACAATCGCTTCCGCGAACCTGGACT
CGGCACAACCTGACAATCGCTTTTTTCCGCGAACCTGGAACT
TCGGTAACTCAGCGGATCC
CCTTTCCCTGGTTTGCTCG

 
 

Kích
thước (bp)

Nguồn

215

Chantratita
N. và cs,
2008 [13]

 
 

242

 

 

 

 

 

 

 

 

61,16
60,98

 
 

Tự
kế

thiết

19


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thiết kế phản ứng LAMP
Quan sát bằng mắt thường

Điện di
UV
1

2

3

20


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xác định ngưỡng phát hiện

Sự thay đổi màu khi bổ sung SYBR Green I

Sự phát quang sau khi chiếu tia UV

LOD: 4 copy/µl
ĐTT Hằng, CD Hưng, BT Huyền, và cs. NC phát triển kỹ thuật LAMP đa mục tiêu phát hiện VK B.21
pseudomallei trên mẫu lâm sàng. CNSH toàn quốc 2020: 730-736.


Thiết kế, thử nghiệm các phản ứng real-time LAMP
Bộ mồi 1

Hệ thống Genie III (OptiGene, Anh),
(45oC/3m), (65oC/30m), (98oC-> 80oC)/ramp rate 0,05oC/s),

Hệ thống RotorGene-Q
(65oC/ 1m)/30 chu kỳ; (80oC->98oC)/ 0,5oC/s

Đồ thị tín hiệu huỳnh quang phản ứng real-time LAMP xác định B.
pseudomallei
22
NC. Đối chứng âm là nước khử ion


Bộ mồi 2 và bộ mồi 3 (oligo 4T)

Hệ thống Genie III

Điện di sản phẩm của real-time LAMP gel agarose 2,0%.
1. Mẫu Bp1; 2, 4, 6. Mẫu Bc1, Bc2, Pa1 (Bộ mồi 2); 3, 5, 7.

Mẫu Bc1-4T, Bc2-4T, Pa1-4T (Bộ mồi 3).
23


Tối ưu và đánh giá phản ứng real-time LAMP
Tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng real-time LAMP (bộ 2,
máy Genie III)
Nồng độ
mồi
Peak value
(Mean,
phút)

0,2X

0,4X

0,6X

0,8X

1X

NA

24,45

22,37

21,38

20,15

Chú thích: Mean. Giá trị trung bình, NA. Không xác định
Giá trị mồi tối ưu là 1X với nồng độ cụ thể của 3 cặp mồi Bp-FIP/BIP,
Bp-F3/B3, Bp-LB/LF lần lượt là 1,6; 0,2; 0,4 µM.
LOD: 4 copy/ µl (6/6 lần lặp lại), CV<2,5%
24


Đánh giá trên các chủng đối chứng
Mẫu chứng

B. pseudomallei

VK khác

Tổng

Kĩ
Dương
thuật
tính
LAMP Âm tính

30

0

30

0

27

27

Tổng

30

27

57

• Độ nhạy: 100%
• Độ đặc hiệu: 100%