Nuôi cấy vi sinh vật

BÀI 1
CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NI CẤY VI SINH VẬT
I. Mục đích:
Bao gói dụng cụ: Biết cách bao gói ,làm nút bơng ,khử trùng dụ cụ bằng nồi hấp khử
trùng ở áp suất cao và bằng tủ sấy. Nắm vững yêu cầu ,nguyên tắc ,các bước thực hiện pha
chế và khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Phương pháp khử trùng: Làm chết hoàn toàn mọi mầm mống vi sinh vật, kể cả các
vi sinh vật có bào tử. Đây là khâu quan trọng nhất. Khi nghiên cứu vi sinh vật, cần thiết phải
khử trùng môi trường, dụng cụ, thiết bị để tránh sự phát triển lẫn lộn các hệ vi sinh vật
ngoại lai vào giống vi sinh vật đang nghiên cứu.
Pha môi trường: Là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì
thế oxi hóa khử ,áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của độ pH của mơi trường.
II. Ngun tắc:
Bao gói dụng cụ: để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, phải thật sạch và khơ,
khơng bị nứt mẻ. Cần cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo vơ trùng trong lớp
giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
Phương pháp khử trùng:
 Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường
 Tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, ni cấy chính xác.
 Khơng làm biến tính mơi trường, khơng làm biến tính một số chất trong môi trường
 Sau khi khử trùng, trong môi trường không sản sinh ra các chất độc gây chết vi sinh
vật nuôi cấy
 Phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng
 Bảo đảm an tồn đối với người sử dụng
Phương pháp làm mơi trường:
 Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh
dưỡng của từng loại vi sinh vật.
 Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên
cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường.
 Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật.

III. Tiến hành và phương pháp:


Cách làm nút bông: Dùng miếng bông không thấm nước cuộn lại, nhét vào miệng ống
nghiệm sao co vừa đủ chặt. Cách làm nút gòn này được áp dụng cho các chai lọ, bình cầu,
bình tam giác,... cách làm cũng tương tự như đối với ống nghiệm. Nhưng lượng gòn sử dụng
phải nhiều hơn và có thể được bọc bằng một lớp vải gạc. Về u cầu:
 Nút gịn có kích thước và độ chặt vừa phải
 Đầu nút phải trịn, gọn, phần ngồi lớn hơn phần trong ống nghiệm
 Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng
Cách bao gói dụng cụ: Với các dụng cụ sau khi làm nút bơng ,cần được bao gói phần
có nút bơng bằng giấy dầu hay giấy báo để khi hấp khử trùng nút bông không bi ướt và đảm
bảo điều kiện vô trùng tốt hơn. Cách làm như sau:
 Cắt các mãnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói
 Quấn giấy quanh phần đầu của nút bông
 Gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên
 Gập nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào hai bên .
 Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng phương pháp nhiệt khô
Các hộp petri , ống hút thủy tinh bền với nhiệt có thể dược khử trùng bằng phương
pháp sấy ở 170°trong 2 giờ trong tủ sấy. Trong trường hợp này, các ống hút cần được nhét
nút bông không thấm nước ở đầu hút. Hợp petri ,ống hút ,các dụng cụ cần khử trùng khác
được gói kín bằng giấy hoặc giấy nhơm trước khi sấy.
Khử trùng dụng cụ, môi trường bằng nồi áp lực: Phương pháp này được thực hiện
trong nồi vô trùng ở áp suất cao. Là thiết bị làm bằng kim loại, chịu nhiệt độ v à áp suất cao,
có khả năng tự động điều chỉnh áp suất và thời gian khử trùng theo yêu cầu của người sử
dụng
Pha chế môi trường (môi trường PGA,môi trường pepton lỏng ,môi trường Gause):
Cân, đong chính xác từng thành phần của mơi trường và pha chế đúng theo trình tự đã
hướng dẫn.
o Với mơi trường lỏng: các chất cân đong xong cho hòa tan vào nước.

o Với mơi trường đặc: là mơi trường lỏng có bổ sung thêm agar (1,5-2,5%). Cân hóa
chất hịa tan vào nước, bổ sung lượng nước vừa đủ theo công thức. Cho agar vào, đun
sôi và khuấy đều cho đến khi agar vừa tan.
Khử trùng mơi trường: Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi
trường mà chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau
Bảo quản và kiểm tra môi trường: Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ
mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0-5°C và không để môi trường bị khô. Trước
khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường người ta thường đặt chúng vào tủ ấm


37°C, trong 48-72h. Sau khi lấy ra quan sát loại bỏ các mơi trường có vi sinh vật phát triển
và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu.
IV. Thực hành, kết quả và nhận xét:
(Mỗi tổ pha 2 môi trường để thực hành sau đó sẽ dùng chung mơi trường với nhau)
 Thực hành bao gói và khử trùng các loại dụng cụ: ống nghiệm ,ống hút,que gạt,đĩa
petri,bình tam giác ,…
 Thực hành pha môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật:
 Môi trường PGA (potato glucose agar) dùng nuôi cấy nấm mốc. Dùng 60g khoai
tây,6g glucose ,6g agar,300ml nước cất,pH=6.5. Cân lượng cần thiết cho môi trường
đủ cho 300ml ,môi trường PGA. Khoai tây gọt sạch vỏ ,dùng dao cắt lát ,nấu sôi rồi
lọc lấy nước khiết .Cho glucose vào dung dịch chiết khoai tây và làm tan hoàn toàn .
Bổ sung lượng nước cho đủ theo công thức .Dùng agar vào ,đun sôi và khuấy đều cho
đến khi agar tan hồn tồn .Dùng phễu thủy tinh rót mơi trường vào ống nghiệm để
làm thạch nghiêng .Đậy ống nghiệm bằng nút bông. Khử trùng 1atm/15 phút .Sau khi
hấp vô trùng xong , lấy ra và để nghiêng một góc 20°. Để nguội cho môi trường đặc
lại.
 Môi trường pepton lỏng: nuôi cấy vi khuẩn. Dùng cao thịt 1.5g ,pepton 3g ,nước cất
300ml. Cân đúng thành phần trên cho vào trong cốc chứa 300ml nước cất . Đem đun
nhẹ cho tan đều . Dùng phễu thủy tinh rót vào mỗi ống nghiệm(25 ống nghiệm ).Đậy
nút bơng, gói giấy và hấp vơ trùng 1atm/15 phút.

 Môi trường Gause: để nuôi cấy xạ khuẩn. Dùng 6g tin bột tan ,0.15g K 2HPO4 ,0.15g
MgSO4.7H2O ,0.3g KNO3,0.15g NaCl , 0.03g FeSO4. Pha trong 2 bình tam giác 150ml
. Đậy nút bơng ,gói giấy và hấp vơ trùng.
KÊT QUẢ VÀ NHẬN XÉT: Môi trường PGA nghiêng (potato glucose agar)


Hình. PGA thạch nghiêng

BÀI 2
NI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT
I. Mục đích:
-

Nắm vững các nguyên tắc và mục đích của việc ni cấy vi sinh vật

-

Thực hiện được các thao tác cấy truyền từ ống giống sang các loại môi trường thạch
nghiêng, thạch đứng, thạch đĩa...

-

Theo dõi, quan sát và ghi nhận sự phát triển của vi sinh vật trên các loại môi trường
nuôi cấy

Dụng cụ:


-

Bút ghi ống nghiệm, gòn thấm

-

Que cấy vòng, que cấy móc

-

Đèn cồn, giá để ống nghiệm

-

Các ống mơi trường thạch nghiêng (Pepton, Hansen, PGA), thạch đĩa ( Pepton,
Hansen, PGA), môi trường lỏng ( Pepton, Hansen,PGA)

-

Các ống giống vi khuẩn ( E. Coli, Bac. Subtilis, Streptococus), nấm men
(Saccharomyces...), nấm sợi (Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus...)

II. Nguyên Tắt
Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm
Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để
Duy trì tốt các điều kiện ni cấy để vi sinh vật phát triển:
Để đảm bảo vi sinh vật phát triển tốt, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện
ni dưỡng. Có nhiều điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, nhưng đáng
chú ý nhất là những điều kiện sau
Nhiệt độ
Tùy lồi vi sinh vật, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chúng và duy trì sự ổn
định nhiệt độ đó. Dựa vào nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của vi sinh vật, người ta

chia chúng làm 3 nhóm sau đây:
Vi sinh vật ưa ấm có nhiệt độ tối thích 20-30ºC
Vi sinh vật ưa nóng có nhiệt độ tối thích 55-60ºC
Vi sinh vật ưa lạnh có nhiệt độ tối thích 10-15ºC
Để duy trì nhiệt độ thích hợp, ta sử dụng các tủ hoặc phịng ấm có bộ phận điều chỉnh
nhiệt độ tự dộng ln ln duy trì nhiệt độ ở mức nhất định nào đó
Độ ẩm
Để đảm bảo độ ẩm cho vi sinh vật phát triển ta có thể thực hiện bằng các cách sau:
Khi chuẩn bị môi trường phải đảm bảo đủ lượng nước
Phun nước vơ khuẩn vào phịng ni hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm
Điều kiện hiếu khí và yếm khí:
Ni hiếu khí
Cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy cho vi sinh vật có thể thực hiện bằng các biện
pháp:


Lớp mơi trường ni cấy có độ dày vừa phải ( 2-8cm) có thể ni trong ống nghiệm,
khay, bình tam giác
Các bình chứa canh trường được lắc thường xuyên trong q trình ni để cung cấp thêm
oxy cho vi sinh vật
Nếu ni cấy sâu trong mơi trường lỏng, thì phải tiến hành sục khí thường xun hay định
kỳ
Ni kỵ khí
Ngăn cách không cho vi sinh vật tiếp xúc với oxy bằng cách:
Sau khi cấy xong ta đổ lên bề mặt môi trường một lớp dầu paraphin, dầu vazolin hoặc lớp
thạch dày khoảng 2cm. Cách này đơn giản dễ áp dụng. Chú ý: dầu và thạch phải vô
khuẩn, dầu phải trung tính
Cấy đâm sâu trong mơi trường đặc
Ni cấy trong bình hút chân khơng, có thể dùng những ống nghiệm đặc biệtgieo cấy
xong hút hết khơng khí rồi hàn kín lại

Đun sôi môi trường 20-30 phút rồi làm nguội nhanh để đuổi hết oxy trong đó
Dùng hóa chất để loại trừ oxy của khơng khí trong dụng cụ ni
Có thể ni vi sinh vật hiếu khí cùng vi sinh vật kỵ khí. Phương pháp này thì khó áp dụng
III. Tiến Hành và Phương Pháp
Phương pháp chung của việc cấy chuyền
ví dụ: cấy chuyền từ ống nghiệm chứa giống sang ống nghiệm chứa mơi trường gồm các
thao tác chính sau:
Đốt đèn cồn lên
Tay trái cầm 2 ống nghiệm: ống giống nằm ở ngồi, ống mơi trường ở trong, giữ cả 2 ống
hơi nghiêng
Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy
Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bơng vào lịng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút bông ra và giữ
trên tay đến khi đậy lại
Hơ nóng để khử trùng khơng khí ở miệng 2 ống nghiệm
Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống
Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống nghiệm môi
trường để thực hiện thao tác cấy chuyền
Rút que cấy ra, khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông lại
Để các ống nghiệm vào giá, đốt lại que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ


Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, ngày cấy, tên môi trường vào thành ống nghiệm
Chú ý: Cách cấy chuyền này có thể tiến hành từ canh trường đặc ( hoặc lỏng) sang môi
trường đặc (hoặc lỏng)
Nếu ống giống là canh trường lỏng, ngồi việc dùng que cấy cịn có thể dùng pipet để hút
canh trường. Pipet phải được chuẩn bị và làm vô khuẩn trước ( rửa sạch, sấy khô, bọc giấy,
khử trùng). Khi dùng tháo giấy ra và dùng ngay. Dùng xong cắm pipet vào dung dịch khử
khuẩn
Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật hiếu khí

Thơng thường dùng que cấy vịng, trình tự tiến hành giống như trên. Nhưng sau khi lấy được
giọt canh trường vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiếp tục như sau:
Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm
Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ở đáy ống nghiệm
Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theo các kiểu như sau:
Theo kiểu hình chữ chi
Theo hình vịng xoắn
Theo đường vạch ngang song song

Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng
Phương pháp cấy trên đĩa petri
Có thể cấy trên đĩa petri theo một trong hai cách: dùng que cấy vòng, dùng pipet. Trong
phạm vi bài này chúng ta chỉ thực hiện theo cách dùng que cấy vòng và trình tự được thực
hiện như sau:
Để đĩa petri lên bàn


Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thư tự và yêu cầu vô trùng như đã nêu phần
trên
Tay trái hé mở nắp hộp vừa đủ để cho đầu que cấy vào
Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:
Theo hình chữ chi trên toàn bộ bề mặt thạch
Theo những đường song song
Theo 4 hình chữ chi ở bốn góc của đĩa thạch
Trong quá trình cấy, vì lượng vi sinh vật sẽ bị giảm dần theo đường cấy nên khi vi sinh vật
phát triển, càng gần cuối đường số khuẩn lạc càng thưa dần

Các kiểu cấy trên thạch đĩa
IV. Thực hành, kết quả và nhận xét:
5.1 E.coli

E.coli sau 3 ngày nuôi cấy bằng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch và ống nghiệm nghiên ở
môi peptone, các khuẩn lạc bắt đầu phát triển thành các đóm trịn trắng đục và phát triển đều
theo ria cấy khơng có dấu hiệu nhiễm các sinh vi sinh vật bên ngồi hình dạng khuẩn lạc
E.coli trịn khơng đều bề mặc khuẩn hơi bóng mép khuẩn lạc bằng phẳng kích thước khuẩn
lạc từ 1 đến 3 mm , tốc độ sinh trưởng vừa, môi trường trong. Suy ra ống giống tốt, thao tác
trong q trình ni cấy được đảm bảo vô trùng.
E.coli sau 6 ngày nuôi cấy bằng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch và ống nghiệm nghiên ở
môi peptone, các khuẩn lạc bắt đầu phát triển thành các đóm trịn trắng đục đậm hơn 3 ngày
đầu và phát triển đều theo ria cấy khơng có dấu hiệu nhiễm các sinh vi sinh vật bên ngồi
hình dạng khuẩn lạc E.coli khơng đều, bề mặc khuẩn hơi bóng mép khuẩn lạc bằng phẳng
kích thước khuẩn lạc từ 3 đến 7 mm, các bào tử E.coli bị rơi xuống trong q trình ni cấy


bắt đầu phát triển , tốc độ sinh trưởng vừa, môi trường bị đục dần. Suy ra ống giống tốt, thao
tác trong q trình ni cấy được đảm bảo vơ trùng.

Hình ảnh E.coli dưới đèn sau 3 ngày ni cấy

5.2 Aspergillus
Aspergillus sau 3 ngày nuôi cấy bằng phương pháp cấy điểm trên đĩa thạch và ống nghiệm
nghiên ở môi trường thích hợp PGA, các sợi nấm bắt đầu phát triển mạnh, dạng hình sợi
khơng đồng đều, có màu xám đen kích thước khoảng 5 đến 6 cm bề các sợi nấm hơi xù xì
gấp nếp, mép khuẩn lạc gợn sóng. Môi trường phát triển của nấm sợi bị đục, nấm phát triển
nhanh trong môi trường, không tạo ván trong môi trường.Khơng có hiện tượng nhiễm các vi


sinh vật khác ngồi mơi trường ni cấy. Suy ra môi trường nuôi cấy ổn định ống giống tốt,
thao tác trong q trình ni cấy được đảm bảo vơ trùng.

Hình ảnh Aspergillus được nuôi cấy qua 3 ngày.

Aspergillus sau 6 ngày nuôi cấy bằng phương pháp cấy điểm trên đĩa thạch và ống nghiệm
nghiên ở mơi trường thích hợp PGA , các sợi nấm phát triển mạnh và ổn định, dạng hình sợi
khơng đồng đều, khuẩn lạc có màu xanh đen kích thước khoảng 5 đến 6 cm phát triển khắp
đĩa petri, bề các sợi nấm hơi xù xì gấp nếp, mép khuẩn lạc gợn sóng. Mơi trường phát triển
của nấm sợi bị đục, nấm phát triển nhanh trong môi trường, khơng tạo ván trong mơi trường.
Khơng có hiện tượng nhiễm các vi sinh vật khác ngồi mơi trường ni cấy. Suy ra môi
trường nuôi cấy ổn định ống giống tốt, thao tác trong q trình ni cấy được đảm bảo vô
trùng.

5.2 Nấm men Saccharomyces
Sau 3 ngày nuôi cấy nấm men Saccharomyces bắt đầu có dấu hiệu bị nhiễm, xuất hiện 2
hình dạng khuẩn lạc, hình dạng đầu tiên của nấm men có khuẩn lạc hình trịn bán kinh khoản
2 đến 3 mm, kích thước khơng đều các khuẩn lạc có màu trắng đục bề mặc gồ gề, mép


khuẩn lạc mịn, dạng mỡ, hình dạng thứ 2 của vi sinh vật bị nhiễm có màu đèn khuẩn lạc có
hình sợi, mép khuẩn lạc có các sợi, bề mặc gồ gề, kích thước khuẩn lạc từ 2 đến 3 cm nghi
ngờ là nấm mốc. Môi trường phát triển trong, không bị vấn đục. Tốc độ phát triển vừa. Suy
ra môi trường nuôi cấy ổn định, thao tác nuôi cấy hoặc môi trường nuôi cấy không đảm bảo
kỹ thuật dẫn đến nhiễm nấm mốc.

Hình ảnh Nấm men Saccharomyces sau 3 ngày
nuôi cấy
Sau 6 ngày nuôi cấy nấm men Saccharomyces bị nhiễm, xuất hiện 2 hình dạng khuẩn lạc,
hình dạng đầu tiên của nấm men có khuẩn lạc hình trịn bán kinh khoản 2 đến 3 mm do bị
nấm mốc cạnh tranh chất dinh dưỡng, kích thước khơng đều các khuẩn lạc có màu trắng đục
bề mặc gồ gề, mép khuẩn lạc mịn, dạng mỡ, hình dạng thứ 2 của vi sinh vật thứ 2 nghi ngờ
là nấm mốc có màu đèn khuẩn lạc có hình sợi, mép khuẩn lạc có các sợi, bề mặc gồ gề, kích
thước khuẩn lạc từ 3 đến 4 cm, mốc bắt đầu phát triển dày lên và hút hết chất dinh dưỡng

trong môi trường dẫn đến khuẩn lạc của nấm men không phát triển được. Môi trường phát
triển trong, không bị vấn đục. Tốc độ phát triển vừa. Suy ra môi trường nuôi cấy ổn định,
thao tác nuôi cấy hoặc môi trường nuôi cấy không đảm bảo kỹ thuật dẫn đến nhiễm nấm
móc.

BÀI 3
QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI
I. Mục đích:
-Nắm vững cách sử dụng kinh hiển vi quang học, đặc biệt là kỹ năng sử dụng vật kinh dầu
-Biết cách làm tiêu bản ( tạm thời) quan sát một số đặc điểm của vi sinh vật dưới kính hiển
vi
- Nắm vững phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm quan sát cuống sinh bào tử nấm mốc
-Nắm vung nguyên tắc, các bước thực hiện khi làm tiêu bản cố định nhuộm màu và quan sát
được các đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kính hiển vi


Chuẩn bị dụng cụ:
-Kính hiển vi, dầu soi
-Đèn cồn, cồn 700 , 900
-Gịn thấm
-Que cấy vịng,Que cấy móc
-Phiến kinh và lá kinh sạch
-Hộp petri có chứa phiến kinh và lá kinh đã vô trùng
-Ống nghiệm chứa nước cất vô trùng
-200 ml môi trường PGA vô trùng
-Thuốc nhuộm xanh metylen 0,001%
-Mẫu cấy của vi khuẩn, nấm men, nấm mốc trên môi trường thạch đĩa
-Tiêu bản nhuộm đơn của vi khuẩn E.coli,nấm men,
-Tiêu bản phòng ẩm nấm sợi Aspergillus
-Thuốc nhuộm đơn, nhuộm bào tử, nhuộm gram

-Giá và mâm nhuộm
-Bình tia, giấy lọc, giấy thấm
-Đèn cồn, que cấy vòng
-Cồn 950 , HCL 0,5%, H2SO4 1%
-Dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn E.coli, nấm men
II. Nguyên tắc
Nắm vững nguyên tắc, các bước thực hiện khi làm tiêu bản cố định nhuộm màu và quan sát
vi sinh vật trên kính hiển vi .
Nguyên tắc về tiêu bản tạm thời có nhuộm màu: phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm
khơng hoặc ít độc với sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vẫn sống
và hoạt động sau khi nhuộm .
Nguyên tắc nhuộm màu tiêu bản :sử dụng thuốc có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và
kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng và bền
vững .
Tùy theo mục đích nguyên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế bào
mà chọn loại thuốc cho phù hợp .
Có 2 cách nhuộm chính :
+ Nhuộm đơn giản: chỉ dùng một loại thuốc nhuộm trên tiêu bản


+ Nhuộm phức tạp (nhuộm kép): dùng đồng thời hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên tiêu
bản .
Nguyên tắc nhuộm gram: dựa trên khả năng bắt màu của thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà
chia thành 2 nhóm lớn .
Nhóm giữ được phưc chất tạo thành giữa tím kết tinh và iod khi xử lí bằng cồn. Nhóm vi
khuẩn có tính chât này gọi là vi khuẩn gram dương .
Nhóm khơng giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh và iod khi xử lí bằng cồn.
Nhóm vi khuẩn có tính chất này gọi là vi khuẩn gram âm.
Nguyên tắc nhuộm bào tử: dựa trên cấu trúc của màng bào tử dày ,chắc,khó bắt màu nên
nhuộm cần phải dùng nhuộm thuốc nhuộm đặc ,xử lý tế bào chất bào tử dễ bắt màu hồng

bằng nhiệt axit.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Đối với vi khuẩn và nấm men
Cho một giọt nước vơ trùng lên phiến kính sạch
Dùng que cấy vịng lấy một vòng dịch vi khuẩn hoặc nấm men hòa vào giọt nước
Đậy lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ để thật nhẹ để tránh khơng tạo bọt khí
Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi
Quan sát ở vật kính 10x và 40x
Đối với nấm sợi và xạ khuẩn:
Cho vào đĩa petri một tờ giấy thấm ,rồi đặt vào một phiến kính . Đậy lại ,gói giấy và đem đi
khử trùng trong ống nghiệm
Mở hé nắp petri ở gần ngọn lửa đèn cồn , đổ thạch trong ống nghiệm lên phiến kính và chờ
đơng lại.
Lấy nước cất đã vơ trùng đổ vào phần giấy thấm , để nước thấm đều tờ giấy.
Dùng que cấy móc , khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm mốc rồi chấm lên phần thạch của phiến
kính trong phịng ẩm
Gói cả hai hộp lại và ni ủ ở nhiệt độ thường là 2-3 ngày(nấm mốc) ,5-7 ngày (xạ khuẩn )
Mở hộp petri và lấy phiến kính bên trong ra
Dùng giấy thấm lau mặt đáy phiến kính
Đậy lá kính lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát.
Tiêu bản giọt treo:
Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình trịn ở giữa
Bơi vazolin quanh phần lõm của phiến kính
Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính
Cẩn thận úp ngược lá kính lên trên chỗ lõm của phiến kính
Được quan sát dưới kính hiển vi
Nhuộm màu tiêu bản:
Chọn phiến kính sạch và khô. Nếu chưa sạch phải đem rửa lại

Lấy bút màu khoanh 1 vịng trịn (1-2cm2)lên một phía của phiến kính ,quay ngược phiến
kính lại và để lên giá
Dùng que cấy dòng lấy một giọt canh trường để vào vịng đã khoanh . Nếu canh trường đặc
thì dùng que cấy lấy một giọt nước vô trùng để lên vịng đã khoanh, sau đó lấy 1 ít khuẩn lạc
vi sinh vật hòa tan đều với nước
Nghiêng que cấy 10-15 độ , nhẹ nhàng dàn giọt canh trường ra khắp diện tích đã khoanh
,khơng sát mạnh .
Khử trùng que cấy và để vào giá
Để vết bôi khô tự nhiên
Đặc tiêu bản có vết bơi lên cầu thủy tinh
Đặt miếng giấy lọc phủ lên tồn bộ vết bơi
Dùng ống nhỏ giọt nhỏ thuốc nhuộm phủ đều vết bôi (chú ý không cho vết nhuộm nhiều quá
và trong thời gian nhuộm trên vết bơi ln ln có phủ đều một lớp thuốc nhuộm )
Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu bản và thuốc nhuộm
Thường nhuộm ở nhiệt độ phòng . Để tăng cường tác dụng của thuốc nhuộm hoặc rút ngắn
thời gian ta hơ nóng trên đèn cồn
Khi nhuộm xong , rửa vết bơi bằng cách nghiêng phiến kính ,dùng bình xịt cho nước chảy
nhẹ qua vết bôi cho đến khi nước chảy ra khơng cịn màu nữa
Dùng giấy thấm khơ tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn
Quan sát tiêu bản ở vật kính 40x rồi chuyển sang vật kính 100x có dầu.
Nhuộm Gram:
Đặt giấy lọc lên vết bơi và nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong 1-2 phút
Đổ hết thuốc đi , nhỏ dung dịch lugol lên để trong 1 phút sau đó rửa và thấm khơ
Nhúng vào cồn 95°trong 30 giây. Cần làm cẩn thận vì kết quả phụ thuộc nhiều vào động tác
này
Rửa nước ,thấm khơ
Xem tiêu bản ở dưới vật kính dầu
IV. Kết quả và nhận xét
4.1 Nấm mốc

4.2 Nấm men:


Hình ảnh của nấm men dưới kinh hiển vi 40x, được nhuộm gram (bên phải) và chưa được
nhuộm gram( bên trái). Nấm men đã được nhuộm gram
4.3 Tiêu bản phòng ẩm của nấm mốc


Hình ảnh của nấm mốc được làm tiêu bản phịng ẩm dưới kinh hiển vi 40x cho thấy
khuẩn lạc có màu xanh, có các bào tử bụi có hình dạng khác nhau được xếp thành
chuỗi.

4.4 E.coli