Sản xuất Insulin từ Protein tái tổ hợp(1)

SẢN XUẤT INSULIN TỪ PROTEIN TÁI TỔ
HỢP
I.

Tìm hiểu về Insulin
1. Nguồn gốc
- Insulin là một loại hormon quan trọng, giúp cơ thể
hấp thu glucose – một trong những thành phần chính
cung cấp năng lượng cho con người
- Nguồn gốc của Insulin:
+ Nguồn gốc động vật : từ tụy của bò hay lợn. Ngày
nay, Insulin được tinh chế bằng phương pháp sắc kí
độ tinh khiết hóa rất cao
+ Insulin người :
- Được sản xuất từ Insulin động vật qua các phương
pháp:
+ Bán tổng hợp từ Insulin lợn
+ Tái tổ hợp gen: là loại Insulin trung tính đơn thành
phần, được sản xuất bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNA,
sử dụng nấm men làm cơ thể sinh sản đến độ tinh
khiết hóa và chất lượng cao nhất, có cấu trưc giống
hệt Insulin tự nhiên của người, do vậy ít tạo kháng
thể và thời gian tác dụng ngắn hơn.
2. Cấu tạo
- Là một protein gồm 51 acid amin tạo thành 2 chuỗi
polypeptid. Ở hầu hết các loài, chuỗi A gồm 21 acid
amin, chuỗi B gồm 30 acid amin nố nhau bằng 2 cầu
nối S-S (disulfua)
- Trọng lượng phân tử khoảng 5800 – 6000 Dalton

- Mặc dù trình tự các acid amin khác nhau giữa các
loài nhưng 1 số đoạn nhất định của phân tử có tính
bảo tồn cao, các đoạn đó chứa 3 cầu nối đisulfua , cả
2 đầu của chuỗi A và các nhánh bên của đầu COOH
của chuỗi B. Sự tương đồng trong trình tự acid amin
dẫn đến cấu trúc 3 chiều của Insulin ở các loài khác
nhau rất giống nhau. Insulin chiết rút từ động vật có

hoạt tính sinh học cao hơn các lồi khác.
3. Phân loại
Có 4 loại Insulin :


-

Insulin
Insulin
Insulin
Insulin

có tác dụng nhanh
tác dụng bán chậm ( trung bình)
tác dụng chậm
hỗn hợp

4. Cơ chế
- Thời gian bán hủy 3-5 phút
- Bị phá hủy tại đường tiêu hóa bởi enzyme proteinase
tại dạ dày
- Hấp thu tốt bằng đường tiêm. Mức độ phụ thuộc vào

nồng độ Insuin, vị trí tiêm, độ sâu của mũi tiêm, vận
động
- Insulin bị chuyển hóa tại gan, thận, cơ. Trong đó 50%

II.

tại gan
- Đào thải qua thận
Sản xuất Insulin từ DNA tái tổ hợp
1. DNA tái tổ hợp:

Là DNA có thể tạo ra từ nhiều vật liệu di truyền khác nhau
(nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA cùng một loại hoặc các
loại khác nhau)
Là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ;
cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển
chúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất
các sản phẩm ( protein, enzym,), các tế bào, cơ thể có tính
trạng mới theo mong muốn.
Các bước kỹ thuật DNA tái tổ hợp:
B1: Có tế bào chứa đoạn DNA mong muốn và vec-tơ chuyển
gen mong muốn.
B2:Tách chiết DNA theo mong muốn ( phân lập gen)
Phân lập gen:
• Tách chiết DNA: tùy theo nguồn acid nucleic,có những kiểu
tách chiết khác nhau:


Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ
màng, loại bỏ protein bằng enzim, kết tủa và tinh sạch DNA

bằng hóa chất, dung mơi, dịch chiết thích hợp.
Đối với mơ, tế bào động thực vật, ngun tắc tách chiết DNA
như trên. Tuy nhiên chúng ta trực tiếp lấy các mẫu sinh phẩm
như lơng, tóc, thịt, máu, nước bọt., mơ thân , rễ, lá.
• Tách chiết RNA: quy trình tương tự tách chiết RNA, dịch
chiết sau khi làm sạch protein, sử dụng enzim phân hủy
RNA, kết tủa thu RNA.
• Định lượng DNA, RNA: sản phẩm sau khi tách chiết cần có
độ tinh sạch và hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng
phương pháp đo quang phổ để xác định chỉ số hấp phụ, tù
đó đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng cần thiết. Hoặc
dùng phương pháp điện di trên gel thạch xác định băng
DNA, RNA, suy ra độ tinh sạch và hàm lượng cần thiết cho
nghiên cứu.
B3: Cắt DNA plasmid và DNA có đoạn gen mong muốn ( enzym
cắt giới hạn và enzym nối)
- DNA plasmid: là DNA vịng khép kín, mạch vịng nằm
trong tế bào( nấm men, vi khuẩn) tính sao chép độc lập,
nhiều trình tự nhận biết của enzym giới hạn. Có gen
kháng chất kháng sinh .Ngồi ra, Phage (phagơ Lamda),
có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho cài các gen khác
nhau, giúp các gen này dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn
có khả năng và có khả năng sao chép nhanh.
- Enzym cắt giới hạn: là enzym có khả năng cắt gen từ hệ
gen nào đó, cắt vector tách dịng hoặc vector tái tổ hợp,
tạo điều kiện gắn các đoạn gen cần thiết.
- Enzym nối Ligase: sửa chữa liên kết photphodieste ( nối
phân tử DNA từ các nguồn khác nhau)
B4: Chộn chung DNA plasmid và đoạn gene mong muốn ( biến
nạp)

Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ: Biến nạp các tế
bào khả biến: Tự nhiên, cảm ứng hóa học, biến nạp xung điện.


Những tế bào chủ thường dùng: Vi khuẩn E.Coli, tế bào nấm
men, tế bào động vật,.. thường dùng vào mục đích cụ thể; như
nghiên cứu điều hịa hoạt động của gen, đột biến gen,..
B5: Bổ xung enzym nối ligase để tạoDNA tái tổ hợp hoàn chỉnh
B6: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen
B7: Sàng lọc và theo dõi sự hoạt động của gen được chuyển
vào trong tế bào chủ.
2, Ý nghĩa của sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất
insulin:
Sản xuất Insulin bằng công nghệ tái tổ hợp là một bước nhảy
vọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường.
Ngoài ra, một ý nghĩa khá quan trong khi sử dụng công nghệ
này để sản xuất Insulin, đó là hiệu quả kinh tế, khi sử dụng
công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ khá nhiều mà chất
lượng sản phẩm vẫn bảo đảm, chính là nhờ ý nghĩa sản xuất
sinh khối cao của tế bào nhân tham gia quy trình con nghệ DNA
tái tổ hợp.
3, Quy trình sản xuất Insulin bằng cơng nghệ DNA tái tổ hợp:
Ngày nay, có rất nhiều các phương pháp sản xuất insulin tái tổ
hợp được ra đời với mục đích phát hiện ra phương pháp sản
xuất isnulin có năng suất cao và hiệu quả sản xuất phải ngang
bằng hoặc vượt trội hơn so với những hệ thống sản xuất insulin
đã có từ trước đến nay. Hầu hết các phương pháp sản xuất
insulin thương mại đều dựa trên chủng nấm men
(saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn (E.coli) kết hợp với
gene để sản xuất ra insulin

Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp
miniproinsulin(MPI):


- \

.
• Hướng nghiên cứu mới:
- Sử dụng chủng vi sinh vật Pichia pastoris thay thế E.coli
Uư thế của P.pastoris:
+) Vi sinh vật đơn bào, dễ dàng nuôi cấy, dễ thao tác an tồn
với con người.
+) Có một promoter mạnh, sử dụng chất cảm ứng là methanol.


+) Phát triển ở pH 3÷ 7 do đó có thể điều chỉnh pH để giảm
thiểu tối đa hoạt động protase đối với protein tiết ra
+) Phát triển mật độ tế bào cao hơn nhiều lần so với S.
cerevisiae
+) Thành phần mơi trường đơn giản ,chi phí lên men thấp.

-Sự dụng Vector nhân dòng pCR2.1
-Vector biểu hiện pIC9K (Introgen)

1. Thiết kế và tổng hợp gen mã hóa cho MPI
- Trong nghiên cứu này,trình tư gen mã hóa insulin đã
được thay đổi so với cấu trúc của MPI, trong đó bao
gồm 53 amino acid: chuỗi B 29 amino acid, mini C 3
amino acid ( Asp-Gly-Lys), chuỗi A 21 amino acid. Sau
quá trình gáp cuộn, 3 amino acid nối với chuỗi A và B

sau đó 3 amino acid được cắt bỏ bằng tryipsin để có
được 1 insulin trưởng thành. Thr (b30) được thêm vào
sau khi sử lý trispin. Pro(b28) thay bằng Asp(b28)
His(b10) được thay thế bằng Asp (b10)
 Do có nhiều trình tự bị thay thế trong chuỗi amino
acid sử dụng phương pháp hóa học để tổng hợp
gen với khn mẫu mRNA người với cặp mồi đặc
chưng cho gen mã hóa insulin.
- 2 chuỗi olinucleotide mã hóa cho MPI sau khi được tổng
hợp hóa học. Tiếp tục Phân tích PCR để kéo dài 2 đoạn
oligonucleotide thành trình tư DNA mạch đơi hồn
chỉnh.
2. Nhân dòng trong E.coi DH5- alpha
- PMI và pCR2.1 được dòng hóa trong TA cloning kit ( tỉ lệ
sản phẩm PCR: Plasmid là 3:1) ở nhiệt độ 16 để qua
đêm với enzym nối ligase. Qúa trình nối này sẽ tạo ra
plasmid pCR2.1 có chứa MPI
- Plasmid pCR2.1 chứa MPI được biến nạp vào E.coli DH5alpha. Trong môi trường LB chứa Amp. Các khuẩn lạc
mang plasmid tái tổ hợp mọc lên có màu trắng và tiếp
tục đi phân tích PCR với cặp mồi m13F
- Khuẩn lạc cho kết quả dương tính được tách triết
plasmid được cắt bởi các enzym giới hạn EcoRI và NotI.
3. Tạo dòng tế bào E.coli DH5-alpha mang Plasmid pPIC9k chứa
MPI
- Plasmid pCR2.1 có chứa MPI và Plasmid pPIC9k được cắt
bởi enzym giới hạn. Nối đoạn cắt pCR2.1 có chứa MPI
vào Plasmid pPIC9k bằng enzym nối tạo ra plasmid tổ
hợp mới plasmid pPIC9k chứa MPI

- Tiếp tục, được cấy vào E.coli DH5-alpha và được nuôi
cấy trên môi trường LB lần 2 chứa Amp ủ ở 37. Sau đó
các khuẩn lạc được kiểm tra bằng phương pháp PCR với
cặp mồi AOX1-F và AOX1-R
4. Chuyển Plasmid có chứa gen mong muốn vào P. pichiapastoris


-

plasmid pPIC9k chứa MPI sử dụng enzym giới hạn cắt
tại vị trí HIS4 và điện biến nạp vào tế bào của nấm men.
Sau khi biến nạp tái tổ hợp tương đồng diễn ra giữa
plasmid pPIC9k và genome nấm men và sàng lọc trên
mơi trường MD.

- plasmid pPIC9k chứa MPI có chứa gen HIS4 có khả năng
tổng hợp histidine. Do đó tái tổ hợp tương đồng diễn ra
giữa plasmid pPIC9k và genome nấm men mới có thể
mọc trên mơi trường này.
- Các khuẩn lạc mọc trên MD được tách triết genomic
DNA để kiểm tra sự hiện diệc của MPI bằng PCR vời cặp
mồi AOXI-F/R
5. Sàng lọc tế bào có MPI cao
- Khuẩn lạc cho kết quả dương tính tiếp tục được nuôi cấy
môi trường YPD với nồng độ kháng sinh G418 tăng dần
nhằm sàng lọc chủng P. pastoris có nhiều bản sao mã
hóa cho MPI. Màng nitocelluse được áp lên màng nấm
men tiếp tục nuôi cấy qua đêm. MPI được nấm men tiết
ra sẽ bám trên màng. Kháng thể đặc hiệu Abcam đậm
hay nhạt sẽ là biểu hiện khả năng sinh MPI cao hay

thấp.
6. Nuôi cấy
a. Biểu hiện ở quy mô nuôi lắc


b. Biểu hiện ở quy mơ fermentor

7. Chuyển hóa MPI thành Insulin
- MPI sau khi tinh sạch được cắt bằng trispsin để loại bỏ
C- pepdide, đồng thời gắn thêm Thr(b30) để tạo thành
insulin hoàn chỉnh.
III. Ưu điểm, nhược điểm của insulin tái tổ hợp
1. Ưu điểm:


- Insulin tái tổ hợp có thể được điều chế trên quy mô lớn
mà không cần lo lắng về nguồn động vật.
- Có thể duy trì tính nhất qn của từng mẻ và chất
lượng cũng có thể được duy trì.
- Giúp ngăn chặn sự tàn ác đối với động vật.
- Các cơ hội phản ứng dị ứng đã được giảm thiểu.
- Các cơ hội lây truyền bệnh từ nguồn động vật đã bị vơ
hiệu hóa.
- Insulin tái tổ hợp gần như đã thay thế được insulin có
nguồn gốc từ động vật trên khắp thế giới.
2. Nhược điểm:
- Một số bệnh nhân tiểu đường phàn nàn về sự gia tăng
các đợt biến chứng hạ đường huyết
- Chi phí sản xuất có xu hướng cao
IV.

Ứng dụng của insulin:
- Điều trị bệnh đái tháo đường

Link tham khảo:
https://%3A%2F%2Fluanvan.net.vn%2Fluan-van%2Fsan-xuat-insulin-taito-hop-70163%2F%3Ffbclid%3DIwAR19W8Rj8e0D3bnEpOMt-


JWqMSYiorOu7ZDU5G74Sg6znH4MKO2tjly2Uf8&h=AT2Mxi5w5VaFS6Hs4p
u8vvN7rsgGdmHqpcQEbCvTYpKy6TDzJ8qnJUFga8p00WlIiYrFfHjWrg2dJ5kA8wYnY2taIb
14L9E3iYJkeDe3k87Sm8FPGQiBp_qTotzbcwIQbC_fd8Oar_kYCs
/>%E1%BA%A3n-xu%E1%BA%A5t-insulin-tai-t%E1%BB%95-h%E1%BB
%A3p?fbclid=IwAR3yJuJsoLKjRnQTn6u9dRAQwOuVcFx3di8agFCEklS4fnbUtiuuoN0b9g
/> /> />fbclid=IwAR01UdgzFR0jbrg2GdNYamgtFmdd25HSu6lwMXdNyiOXt7P68CF
APNI6VIo
/>