NGHIÊN CỨU LÊN MEN LACTIC TỪ NƯỚC ÉP DƯA HẤU - LỢI KHUẨN Lactobacillus plantarum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC

----------------

HOÀNG THU THỦY

NGHIÊN CỨU LÊN MEN LACTIC TẠO
ĐỒ UỐNG GIÀU PROBIOTIC TỪ
NƯỚC ÉP DƯA HẤU (Citrullus lanatus)
BẰNG LỢI KHUẨN Lactobacillus plantarum

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HÀ NỘI - 2022
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC

----------------


HOÀNG THU THỦY

NGHIÊN CỨU LÊN MEN LACTIC TẠO
ĐỒ UỐNG GIÀU PROBIOTIC TỪ
NƯỚC ÉP DƯA HẤU (Citrullus lanatus)
BẰNG LỢI KHUẨN Lactobacillus plantarum

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh học
Người hướng dẫn khoa học: TS. Phan Duệ Thanh

HÀ NỘI - 2022


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện luận văn tốt nghiệp, em đã nhận
được sự quan tâm, hỗ trợ từ thầy cô, các anh chị, gia đình và bạn bè.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Duệ Thanh, người đã tận tâm hướng
dẫn, quan tâm và giúp đỡ em trong suốt q trình học tập và thực hiên khóa luận tốt
nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh,
khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội đã góp ý, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để em có thể hồn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh/chị trong “Gia đình vi sinh”, “gia đình Mrs.
Thanh” đã ln giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn và thương yêu tới gia đình, bạn bè đã ln bên
cạnh và động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 4 năm 2022
Sinh viên
Hoàng Thu Thủy


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Cs

Cộng sự

OD

optical density – mật độ quang

ºBx

Độ Brix (Nồng độ chất khơ hịa tan)

°Th

độ Thưrner


DANH MỤC CÁC BẢNG


DANH MỤC CÁC HÌNH


MỤC LỤC


Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nước ép dưa hấu hấu (Citrullus lanatus) - được coi là thức uống rất giàu lycopene,
khoáng chất và vitamin. Việc sử dụng nước dưa hấu thường xuyên có thể làm tăng nồng
độ lycopene và beta-carotene trong máu. Các nghiên cứu cho thấy rằng những chất chống
oxy hóa mạnh này có thể có tác dụng bảo vệ chống lại các bệnh tim mạch và một số bệnh
ung thư, chẳng hạn như ung thư tuyến tiền liệt, bàng quang và cổ tử cung (Kyriacou và cs,
2018). Giá trị chất dinh dưỡng của nước dưa hấu có thể được tăng lên bằng cách bổ sung

thêm hoặc lên men nhờ các lợi khuẩn (probiotics).
Probiotics là nhóm những vi khuẩn có lợi cho sức khỏe, điển hình như nhóm vi
khuẩn lactic thuộc chi Bifidobacterium và Lactobacillus có trong hệ vi sinh vật đường
ruột. Probiotic mang rất nhiều lợi ích khác nhau như kiểm sốt vi khuẩn có hại, trợ giúp
đắc lực cho hệ miễn dịch của ruột… Với các cơng dụng trên, hiện nay, probiotic có thể
được sử dụng dưới dạng dược phẩm, hoặc thực phẩm lên men hay bổ sung probiotic như
sữa chua, sữa bột,.... Tuy nhiên, việc sử dụng các sản phẩm từ sữa bị hạn chế ở một số
người do khơng có khả năng dung nạp lactose. Nước trái cây có nguồn dinh dưỡng phong
phú như đường, khoáng chất, vitamin, được xem là một môi trường phù hợp cho sinh
trưởng của probiotic (Phạm Thị Nga, 2011).
Cho đến nay, ở Việt Nam một số nghiên cứu lên men lactic để tạo đồ uống giàu
probiotic trên các loại dịch quả khác nhau đã được thực hiện như nước cam ép (Nguyễn
Thị Thu Nga, 2011); nước cà chua (Hồ Thị Bích Phương, 2011); thanh long ruột trắng
(Nguyễn Thị Quỳnh Mai và cs, 2020). Nghiên cứu bổ sung probitic vào dịch chanh leo
lên men có độ cồn thấp được tiến hành bởi tác giả Huỳnh Phan Phương Trang (2018).
Một số sản phẩm nước trái cây bổ sung probiotic đã được thương mại hoá như Biola
(Phần Lan), Goodbely (Mỹ),...
Với mong muốn tạo được sản phẩm có lợi cho sức khoẻ người tiêu dùng từ nguồn
hoa quả dồi dào, sẵn có, em chọn đề tài nghiên cứu với tiêu đề “Nghiên cứu lên men

8
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
lactic tạo đồ uống giàu probiotic từ nước ép dưa hấu (Citrullus lanatus) bằng lợi
khuẩn Lactobacillus plantarum”.
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo được đồ uống lên men lactic chứa lợi khuẩn Lactobacillus plantarum từ nước
ép dưa hấu.

3. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá một số thành phần dinh dưỡng của dịch ép dưa hấu.
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và lên men tạo acid lactic của chủng vi khuẩn
Lactobacillus plantarum trong môi trường dịch ép dưa hấu.
Đánh giá cảm quan sản phẩm đồ uống lên men lactic chứa lợi khuẩn Lactobacillus
plantarum từ nước dưa hấu.

9
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về dưa hấu
1.1.1. Danh pháp và phân loại khoa học
Dưa hấu (tên khoa học là Citrullus lanatus) là một lồi thực vật thuộc họ Bầu bí
(Cucurbitaceae).
Bảng 1.1. Phân loại khoa học của dưa hấu

1.1.2.

Dưa
khoa học
Citrullus
là

một

vật có hoa

Giới

Thực vật (Plantae)

Ngành

Thực vật có hoa (Angiospermae)

Lớp

Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida)

Bộ

Bộ Bầu bí (Cucurbitales)

Họ

Họ Bầu bí (Cucurbitaceae)

Chi

Citrullus

Lồi

Citrullus lanatus

Nguồn

gốc

và

phân bố
hấu (tên
là
lanatus)
lồi thực
giống

như cây nho có nguồn gốc từ khu Tây Phi và được trồng để lấy quả. Dưa hấu ( Citrullus
lanatus) là một loài dây leo xoắn và dài thuộc họ thực vật có hoa Cucurbitaceae – Bầu bí.
Dưa hấu ban đầu đến từ sa mạc Kalahari, Nam Phi. Vì nó được tìm thấy mọc hoang
ở khắp vùng, sau đó lan rộng ra Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Ấn Độ, Đức,
Mỹ và Indonesia. Nó phát triển nhanh chóng ở nhiệt độ 20 ºC ‒ 30 ºC. Dưa hấu được coi
là một trong những loại trái cây phổ biến nhất được tiêu thụ ở Indonesia bởi vì ngon và
lành tính (Phạm Kim Phụng, 2020; Kyriacou và cs, 2018).

10
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
1.1.3. Đặc điểm hình thái

Hình 1.1. Hoa dưa hấu (camnangcaytrong.com)
Dưa hấu (Citrullus lanatus) là loại cây dây leo dài, góc cạnh mang lá thùy, gân phân
nhánh, hoa đực và hoa cái riêng biệt. Loại thực vật này thường đơn sắc với hoa đực
(staminate) xuất hiện xen kẽ với hoa cái (pistillate) theo tỉ lệ 7 đực (staminate) : 1cái

(pistillate) (Kyriacou và cs, 2018).

Hình 1.2. Hình dạng trái dưa hấu (Phương Mai, 2016)
Quả dưa hấu có hình trịn hoặc hình bầu dục hoặc thn dài với kích thước thơng
thường dao động từ 1,5 đến 15 kg. Vỏ có màu từ nhạt đến xanh đậm với các sọc có hoa

11
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
văn khác nhau. Thịt có thể từ trắng, xanh lá cây, vàng, cam đến đỏ (Kyriacou và cs, 2018;
Matsum và Nakai, 2009; Romdhane và cs, 2017).
1.1.4. Cấu tạo

Hình 1.3. Quả dưa hấu (camnangcaytrong.com)
Dưa hấu được cấu tạo bởi ba thành phần chính là thịt, hạt và vỏ. Thịt chiếm khoảng
68% tổng khối lượng quả, hạt khoảng 2% và vỏ khoảng 30%. Dưa hấu chứa khoảng 90%
nước, các loại vitamin (A, B, C và E), các khoáng chất (K, Mg, Ca và Fe) và acid amin
(citrulline và arginine). Đặc biệt, dưa hấu còn chứa một lượng lớn chất chống oxy hóa
như phenolic và lycopene (Romdhane và cs, 2017; Martins và cs, 2018).
1.1.5. Thành phần dinh dưỡng
Thành phần chủ yếu trong dưa hấu là nước và carbohydrate. Mặt khác, dưa hấu hầu
như khơng có protein hoặc chất béo, đặc biệt rất ít calories (cal). Trong các loại trái cây,
dưa hấu cung cấp lượng calories thấp nhất. Trong 100 gram dưa hấu chỉ cung cấp 16
KCal, thấp hơn so với các loại trái cây khác như quả mọng.
Giá trị dinh dưỡng ở dưa hấu trong 100 gram (theo Bảng thành phần thực phẩm Việt
Nam – NXB Y học) bao gồm:
•
•

•
•
•

Protein: 1,2 gram
Carbs: 2,3 gram
Đường: 6,2 gram
Chất xơ: 0,5 gram
Chất béo: 0,2 gram

12
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
Dưa hấu là một loại trái cây cung cấp nhiều vitamin và khoáng chất thiết yếu cho cơ
thể. Dưa hấu cũng chứa nhiều carotenoids, bao gồm beta-carotene và lycopene. Ngồi ra,
nó có chứa citrulline, một axit amin quan trọng (Phạm Kim Phụng, 2020). Dưới đây là
tổng quan về các chất chống oxy hóa quan trọng nhất của dưa hấu:
Vitamin C (~ 7mg): chiếm tỷ lệ lớn trong dưa hấu, đóng vai trị là một chất chống
oxy hóa giúp ngăn ngừa tổn thương tế bào từ các gốc tự do, giúp cải thiện sức khỏe làn da
và tăng cường chức năng của hệ miễn dịch.
Vitamin B5 (~ 0,221mg): hay còn gọi là acid pantothenic. Đây là một loại vitamin có
thể hịa tan trong nước, có rất nhiều trong các loại thực phẩm như lạc, sữa, phô mai, bông
cải xanh,...Loại vitamin này có tác dụng ngăn ngừa sự nhiễm trùng, lão hóa, tăng sức đề
kháng, giảm nguy cơ mắc các căn bệnh như hen suyễn hoặc bệnh tim.
Vitamin A: Trong dưa hấu có chứa beta-carotene (~ 303µg), khi vào cơ thể sẽ
chuyển hóa thành vitamin A. Loại vitamin này có vai trị vơ cùng quan trọng đối với sức
khỏe, bao gồm điều trị các căn bệnh về đường tiêu hóa, các vấn đề về da, ngăn ngừa bệnh
tiểu đường và ung thư.

Lycopene (~ 4532µg): là một loại carotenoids khơng bị chuyển đổi thành vitamin A.
Chất chống oxy hóa mạnh này tạo màu đỏ cho thực phẩm thực vật như dưa hấu hay cà
chua và có liên quan đến nhiều lợi ích sức khỏe.
Kali (~ 187mg): giúp kiểm sốt huyết áp và bảo vệ sức khỏe tim mạch.
Đồng (~ 80µg): là một khoáng chất quan trọng đối với cơ thể, có tác dụng ngăn ngừa
ung thư, chống oxy hóa và cải thiện các chức năng của hệ thần kinh.
Cucurbitacin E: là một hợp chất thực vật có tác dụng chống oxy hóa và chống viêm.
Citrulline: xuất hiện nhiều nhất trong phần vỏ màu trắng bao quanh ruột dưa hấu.
Citrulline khi ở cơ thể sẽ được chuyển hóa thành acid amin arginine. Cả hai chất này đều
có nhiệm vụ quan trọng trong quá trình tổng hợp oxit nitric, giúp giảm huyết áp bằng cách
làm thư giãn các mạch máu trong cơ thể. Mặt khác, arginine cũng rất cần thiết đối với một
số cơ quan như thận, phổi, gan, hệ thống miễn dịch và sinh sản.
1.1.6. Cơng dụng
13
Sinh viên Hồng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
Dưa hấu là một trong những loại trái cây yêu thích của nhiều người vào mỗi dịp hè
nóng bức. Dưa hấu thường được ăn trực tiếp, để dưới dạng đông lạnh, làm thành nước trái
cây hoặc nước sinh tố.
Loại quả này khơng chỉ có vị ngọt thanh mát mà cịn mang lại nhiều lợi ích nhất định
cho sức khỏe bởi chúng chứa nhiều thành phần dinh dưỡng thiết yếu, như vitamin,
khoáng chất và các hợp chất thực vật.
1.2. Tổng quan về probiotics
Probiotics là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tích cực đến sức khoẻ con người
hoặc động vật bằng cách thay đổi hệ vi khuẩn đường ruột của vật chủ ( Stavros và cs,
2016).
Tiềm năng probiotics của các chủng vi khuẩn khác nhau, ngay cả trong cùng một
loài, là khác nhau (Soccol và cs, 2010). Probiotics điển hình như nhóm vi khuẩn lactic

thuộc chi Bifidobacterium và Lactobacillus có trong hệ vi sinh vật đường ruột.
Bifidobacterium là vi sinh vật quan trọng trong hệ sinh thái hoạt động và phức tạp
của đường ruột của con người và các động vật máu nóng khác (Sgorbati và cs, 1995). Hệ
vi sinh của trẻ sơ sinh bị chi phối chủ yếu bởi vi khuẩn Bifidobacterium, sau đó, số lượng
vi khuẩn này giảm dần và chiếm 25% tổng số vi khuẩn đường ruột ở người trưởng thành
(Soccol và cs, 2010; Finegold và cs, 1983).
Lactobacillus phân bố ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trong đường tiêu hóa của
con người. Các nghiên cứu cho thấy rằng Lactobacillus hiếm khi liên quan đến các trường
hợp nhiễm trùng đường tiêu hóa, bởi vậy nên các chủng vi sinh vật này được sử dụng
trong công nghệ thực phẩm và được coi là vi sinh vật an toàn (Soccol và cs, 2010). Hơn
nữa, các chủng Lactobacillus nổi tiếng như những chất thúc đẩy sức khỏe, đặc biệt là ở
đường tiêu hóa của con người (Salminen và cs, 1996).
Ngày nay, thực phẩm chức năng ngày càng được phổ biến và phát triển. Sự hiện diện
của probiotic trong các sản phẩm thực phẩm thương mại mang lại nhiều lợi ích cho sức
khỏe. Điều này đã làm cho nền công nghiệp tập trung vào những ứng dụng khác nhau của
probiotic trong các sản phẩm thực phẩm và tạo ra những thực phẩm thế hệ mới chứa
14
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
probiotic (Siro và cs, 2008). Probiotic trong sữa như các sản phẩm sữa tươi và sữa lên
men dạng lỏng, sữa chua, phô mai… và probiotic trong rau, trái cây, ngũ cốc, thịt.
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều những sản phẩm probiotics được sản xuất từ
sữa đa dạng như sữa chua uống gồm Yakult, Probi, Betagen…; sữa chua truyền thống có
bổ sung probiotics… đã chiếm được thiện cảm từ phía người tiêu dùng.
Bên cạnh các sản phẩm probiotics phổ biến từ sữa thì sản phẩm probiotics có nguồn
gốc từ trái cây ngày càng được quan tâm vì nước trái cây chứa nhiều khống chất,
vitamin, chất xơ và chất chống oxy hoá (Lu và cs, 2008). Ưu điểm của nước trái cây là có
thể sử dụng được cả cho những người khơng có khả năng dung nạp lactose.

Nhiều sản phẩm nước uống probiotics từ nước trái cây như nước cam ép (Nguyễn
Thị Thu Nga, 2011), nước chanh leo (Huỳnh Phan Phương Trang, 2018) hay nước ép
thanh long ruột trắng (Nguyễn Thị Quỳnh Mai và cs, 2020), đã được nghiên cứu sản xuất.
Tuy nhiên, về mặt cảm quan, men probiotics có thể gây ra hương vị khơng mong
muốn cho sản phẩm. Do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện với mục đích làm giảm
cảm giác khó chịu về mặt hương vị của nước trái cây probiotic (Huỳnh Phan Phương
Trang, 2018). Hương vị không mong muốn do probiotics có thể bị che giấu bằng cách
thêm 10% nước trái cây nhiệt đới (Luckow và cs, 2004).
Ngoài ra, sản phẩm nước trái cây lên men bổ sung probiotics bắt đầu được nghiên
cứu trong thời gian gần đây (Stavros và cs, 2016). Nước trái cây lên men bao gồm các sản
phẩm nước uống có độ cồn thấp (thường 4,5 - 5,5%) khơng qua chưng cất và chứa acid
hữu cơ, chất khống, vitamin (Bates và cs, 2011).
1.3. Tổng quan về lợi khuẩn Lactobacillus plantarum
Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria) đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ cho thức
ăn và lên men thực phẩm. Chúng thường xuyên được ứng dụng trong quá trình lên men
của rau, trái cây, thịt và sữa. Một số các lồi vi khuẩn lactic có trong khoang miệng và
ruột của con người và do đó chúng cịn được sử dụng như “vaccine niêm mạc tiềm năng”.
Vi khuẩn lactic là một nhóm đa dạng của Gram dương, có khả năng sản xuất acid lactic.
(Behera và cs, 2018)
15
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
Trong đó, Lactobacillus có lẽ là chi chiếm ưu thế nhất và Lactobacillus plantarum
(L. plantarum) được xem là lồi có nhiều các chủng đa năng với các đặc tính hữu ích nhất
và thường được tìm thấy trong nhiều sản phẩm thực phẩm lên men như bột chua, sữa
chua, xúc xích lên men, phomat, kim chi…(biowish.vn).
L. plantarum là một vi khuẩn lactic có hình que, Gram dương, có thể phát triển trong
môi trường pH thấp 3,2 và nhiệt độ từ 15 – 45 ˚C, tham gia lên men đường để sản xuất

acid lactic, ethanol, acid acetic và carbon dioxide trong một số điều kiện nhất định.
L. plantarum lần đầu tiên được cơ lập từ nước bọt, có khả năng hố lỏng Gelatin, là
một trong những lồi vi khuẩn lactic có bộ gen khổng lồ và rất linh hoạt (biowish.vn).

Hình 1.4. Lợi khuẩn Lactobacillus plantarum (biowish.vn)
L. plantarum là mối quan tâm hiện tại đối với các nhà nghiên cứu và ngành cơng
nghiệp thực phẩm vì nó được coi là một probiotic an tồn và có khả năng tồn tại tốt trong
đường tiêu hóa của người. L. plantarum thường được sử dụng trong sữa và các loại nước
lên men vì có thể hỗ trợ trong việc khơi phục sự cân bằng hệ nội môi của đường ruột và
hạn chế số lượng vi khuẩn gây bệnh (Behera và cs, 2018).
Hoạt động đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn lactic là do các sản phẩm
được tạo ra trong quá trình trao đổi chất như acid lactic, acid acetic. Các acid hữu cơ này
ức chế sự phát triển của nhiều vi khuẩn Gram âm gây bệnh, nên thức uống sẽ có mùi vị và
hương vị nhất định tùy thuộc vào sự cân bằng giữa acid hữu cơ acetate và lactate (Behera
và cs, 2018; Huỳnh Phan Phương Trang, 2018).

16
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
1.4. Một số nghiên cứu chế biến sản phẩm lên men giàu probiotics từ hoa quả trong
và ngồi nước
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2011, tác giả Phạm Thị Nga đã thực hiện nghiên cứu sản xuất sản phẩm
probiotics nước cà rốt từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Kết quả đánh giá cảm quan
cho thấy, sản phẩm probiotic nước ép cà rốt có màu cam sáng, khơng bị phân lớp trong
q trình bảo quản và có mùi thơm tự nhiên của cà rốt. Nghiên cứu đã đề xuất được quy
trình sản xuất sản phẩm probiotics nước ép cà rốt từ vi khuẩn Lactobacillus platarum ở
quy mô pilot.

Năm 2011, tác giả Nguyễn Thị Thu Nga đã xác định được một số chỉ tiêu hóa lí của
nước cam ép (quả cam sành), kết quả cho thấy nước cam ép đạt các yêu cầu của quá trình
nghiên cứu và sản xuất sản phẩm probiotics. Tác giả đã xác định được điều kiện tối ưu
cho vi khuẩn Lactobacillus plantarum trong quá trình tạo probiotic nước cam ép là nồng
độ dịch lên men: 19% - 21%, nhiệt độ: 32.5 oC – 37.5 oC, thời gian: 48 – 72 giờ.
Năm 2018, tác giả Huỳnh Phan Phương Trang đã nghiên cứu “Thử nghiệm nước
chanh dây độ cồn thấp bổ sung probiotic từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum LY-78”.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, Lactobacillus plantarum LY-78 có khả năng kháng muối
mật, chịu acid, kháng khuẩn, phát triển tốt trên môi trường nước chanh dây lên men độ
cồn thấp với mật độ đạt 8 log CFU/mL qua 4 tuần bảo quản ở 4 ºC.
Năm 2019, tác giả Nguyễn Bảo Toàn và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đồ uống
probiotic từ nước ép dứa lên men với chủng vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacterium.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng vi khuẩn đều phát triển tốt trên nước dứa mà
không cần bổ sung các hợp chất dinh dưỡng. Fructose là loại đường ưa thích nhất đối với
cả vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacterium. Tổng hàm lượng phenol và khả năng chống
oxy hóa đều tăng nhẹ trong quá trình lên men và giảm xuống trong thời gian bảo quản.
Kết quả có thể là cơ sở tốt để phát triển nước ép dứa chứa probiotic.
Năm 2020, tác giả Nguyễn Thị Quỳnh Mai và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu lên
men lactic tạo đồ uống giàu probiotic từ thanh long ruột trắng. Nghiên cứu tạo được sản
phẩm có mật độ lợi khuẩn đạt 10,4 log. Lợi khuẩn có khả năng sống sót 94,39% sau 2 giờ
17
Sinh viên Hồng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
ở dịch dạ dày nhân tạo (SGJ, pH 2,0) và 77,19% sau 4 giờ ở dịch ruột nhân tạo (SIF). Sau
thời gian bảo quản 21 ngày ở 4 °C, mật độ lợi khuẩn giảm còn 9,91 log.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngồi nước
Năm 2007, tác giả Fazeli cùng cộng sự đã công bố nước ép dưa hấu chứa probiotic
có khả năng chống lại sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Salmonella, có thể là do chất

chuyển hóa được tiết ra bởi vi khuẩn lactic, đặc biệt là loại acid hữu cơ. Nghiên cứu kết
luận rằng tất cả các vi khuẩn lactic đều có thể ức chế sự phát triển của Salmonella
typhimurium. Kết quả là Salmonella typhimurium đã bị loại bỏ hoàn toàn trong nước ép
dưa hấu chứa probiotic sau 2 - 6 giờ.
Năm 2010, tác giả Wunwisa và cộng sự đã nghiên cứu về cảm quan của người tiêu
dùng đối với nước ép trái cây có chứa probiotics ở Thái Lan. Đánh giá cảm quan thu được
của 400 người tiêu dùng từ Bangkok thu được kết quả tích cực. Hầu hết người tiêu dùng
mua nước ép trái cây do hương vị của nó (96%) và giá trị dinh dưỡng (89%). Đa số người
tiêu dùng chấp nhận nước ép cam và nho có chứa probiotics (tương ứng là 82,3% và
84,3%). Hơn nữa, trên 86% người tham gia sẵn sàng thử và mua sản phẩm, phản ánh
tương lai tiềm năng cho thị trường nước trái cây có chứa probiotics.
Năm 2013, nghiên cứu của tác giả Zahra cùng cộng sự chỉ ra rằng nước ép dưa hấu
đỏ và vàng thích hợp để sản xuất nước trái cây lành mạnh nhờ lên men vi khuẩn lactic.
Tất cả các chủng đều có thể phát triển tốt. Tuy nhiên tế bào sống sót của L. plantarum ít
hơn các chủng khác sau 48 giờ.
Năm 2015, tác giả Darko và cộng sự đã nghiên cứu lên men tạo sản phẩm probiotic
từ nước ép táo bằng chủng Lactobacillus plantarum PCS 26. Nghiên cứu kết luận rằng
nước ép táo là mơi trường thích hợp để lên men bởi lợi khuẩn Lactobacillus plantarum
PCS 26, tạo thức uống probiotic có kết quả tốt về mặt cảm quan và thời hạn sử dụng. Kết
quả lên men tốt nhất đạt được sau 24 giờ, tại điều kiện pH ban đầu là 4,2. Bảo quản sản
phẩm ở 4 – 7 ° C.
Năm 2018, tác giả Horáčková và cộng sự đã nghiên cứu về nước ép trái cây có
probiotics. Nghiên cứu cho thấy nước ép dâu tây – táo khơng thích hợp để sản xuất sản
18
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
phẩm probiotic. Kết quả cho thấy số lượng tế bào Bifidobacteria, độ pH và hàm lượng
acid lactic và acid acetic không thay đổi trong nước ép dâu tây – táo sau 24 giờ nuôi cấy ở

nhiệt độ 37 °C.

19
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

2.2.

Đối tượng nghiên cứu
Dưa hấu ruột đỏ được thu mua từ các chợ đầu mối.
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum được cung cấp bởi Viện Vi sinh và Công nghệ
Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Bộ môn Công nghệ sinh học – Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư
phạm Hà Nội.
Thời gian: 3/2021 – 4/2022.

2.3.

Hóa chất và các nguyên vật liệu
Glucose (Công ty Dược Hà Nội, Việt Nam), sucrose (Việt Nam), peptone (Scharlau,
Tây Ban Nha), KH2PO4 (Xilong Scientific Co., Trung Quốc), thạch (Việt Nam),
MgSO4.7H2O (Xilong Scientific Co., Trung Quốc), NaCl (Xilong Scientific Co., Trung
Quốc), cao thịt (Schalau, Tây Ban Nha), CH 3COONa.3H2O (Đức), acid citric (Úc), cao
nấm men (Schalau, Tây Ban Nha), triamoniumcitrate (Xilong Scientific Co., Trung

Quốc), tween 80 (Xilong Scientific Co., Trung Quốc), MnSO4 (Xilong Scientific Co.,

2.4.

Trung Quốc), NaOH (Xilong Scientific Co., Trung Quốc).
Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị: Tủ cấy (ClassII Biohazard Safety Cabinet – Esco, Mỹ); Tủ ấm, tủ sấy
(Binder, Đức); Nồi khử trùng (SA – 300VF, Nhật); Máy ly tâm (Eppendorf, Đức); Máy
vortex (MS1 Minishaker IKA, Đức); Cân phân tích (Pressica, Mỹ); Máy chưng cất nước
(Hamilton, Anh).
Các dụng cụ: Micropipette, các loại đầu tip, giếng đo quang phổ 96, găng tay, bình
tam giác, ống nghiệm, ống falcon, ống Eppendorf, cốc thủy tinh, que trang, ống đong,

2.5.

phễu thủy tinh.
Mơi trường
Mơi trường hoạt hố giống sử dụng mơi trường de Mann, Rogosa and Sharp (MRS)
lỏng có thành phần gồm (g/L): glucose 20,0; cao thịt 10,0; cao nấm men 5,0; pepton 10,0;
tween 80 1,0; K2HPO4 2,0; CH3COONa 5,0; triamoniumcitrate 2,0; MgSO4 0,58; MnSO4
0,28; nước dẫn đến 1000 mL; pH mơi trường là 6.5.
20
Sinh viên Hồng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
Mơi trường MRS đặc là mơi trường có thành phần như trên nhưng được bổ sung 15
g agar trong 1 L môi trường.
Các môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121 °C, tương đương 1 atm, trong thời
gian 15 phút.

2.6.

Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến khả năng lên men
của L. plantarum trong dịch ép dưa hấu
2.6.1.1. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Chủng vi khuẩn L. plantarum sau khi được hoạt hố trong mơi trường MRS lỏng ở
30°C. Sau 48 giờ hút lấy 1 mL dịch giống và xác định mật độ quang ở bước sóng 610nm.
Bổ sung cùng lượng giống tương đương 10 6 tế bào/mL vào bình tam giác 250 mL chứa
100 mL nước ép dưa hấu đã được thanh trùng Pasteur ở 80 °C trong thời gian 10 phút với
pH ban đầu 5,0; 5,5; 6,0 và 6,5. Bình lên men được ni tĩnh ở 30 °C, trong thời gian 48
giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.6.1.2.

Ảnh hưởng của nồng độ chất khơ hồ tan

Chuẩn bị nước ép dưa hấu với hàm lượng chất khơ hồ tan 12, 14, 16, 18 °Bx bằng
cách bổ sung thêm đường sucrose.
Chủng vi khuẩn L. plantarum sau khi được hoạt hố trong mơi trường MRS lỏng ở
30°C. Sau 48 giờ hút lấy 1 mL dịch giống và xác định mật độ quang ở bước sóng 610 nm.
Bổ sung cùng lượng giống tương đương 10 6 tế bào/mL vào bình tam giác 250 mL chứa
100 mL nước ép dưa hấu đã được thanh trùng Pasteur ở 80°C trong thời gian 10 phút với
hàm lượng chất khơ hồ tan 12, 14, 16, 18 °Bx, giá trị pH ban đầu chỉnh theo kết quả
chọn từ thí nghiệm trước. Bình lên men được nuôi tĩnh ở 30 °C, trong thời gian 48 giờ.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.6.1.3.

Ảnh hưởng của thời gian lên men

Chủng vi khuẩn L. plantarum sau khi được hoạt hố trong mơi trường MRS lỏng ở

30°C. Sau 48 giờ hút lấy 1 mL dịch giống và xác định mật độ quang ở bước sóng 610 nm.
Bổ sung cùng lượng giống tương đương 10 6 tế bào/mL vào bình tam giác 250 mL chứa
100 mL nước ép dưa hấu đã được thanh trùng Pasteur ở 80 °C trong thời gian 10 phút với
21
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
kết hợp với thơng số về pH và hàm lượng chất khơ hồ tan chọn được từ kết quả các thí
nghiệm trước.
Bình lên men được ni tĩnh ở 30 °C, với thời gian lên men 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24
giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ và 48 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Các nghiệm thức được theo dõi đánh giá thông qua mật độ vi khuẩn sau lên men,
nồng độ chất tan, pH, acid tổng số và điểm cảm quan thị hiếu về vị.
2.6.2. Các phương pháp phân tích
2.6.2.1. Xác định pH
Sử dụng máy đo pH để bàn để xác định giá trị pH của dịch ép dưa hấu, trước và sau
quá trình lên men..
2.6.2.2.

Xác định hàm lượng chất khơ hồ tan

Sử dụng máy đo độ Brix cầm tay Total meter LH – T32 (Đài Loan) để xác định hàm
hàm lượng chất khơ hịa tan (tự bù nhiệt về 20 °C) trong dịch ép dưa hấu..
Lăng kính của máy đo độ Brix cầm tay Total meter LH – T32 đã được làm sạch, lắc
đều mẫu, dùng đũa thủy tinh hoặc ống nhỏ giọt vô trùng lấy và đưa 1 - 2 giọt mẫu lên
lăng kính dưới, đậy lăng kính trên lại.
Tổng hàm lượng chất khơ hồ tan (Brix) là đọc thang đo của khúc xạ kế và ghi kết
quả, hàm lượng chất khơ hịa tan.
2.6.2.3.

Xác định hàm lượng carbohydrate tổng số

Định lượng hàm lượng carbohydrate tổng số bằng phương pháp Phenol – Sulfuric
Acid (Nielsen, 2017).
Nguyên tắc: Các loại đường đơn, oligosaccaride và các dẫn xuất của chúng có mang
những nhóm có tính khử hoặc khơng mang nhóm có tính khử đều bắt màu vàng cam khi
gặp phenol và H2SO4 đặc. Phản ứng này rất nhạy, tạo màu sắc bền, cho phép xác định một
lượng nhỏ đường và cơ chất trong một hỗn hợp.
Các bước tiến hành:
Pha lỗng các dung dịch thí nghiệm đến nồng độ phù hợp để có thể phân tích. Bổ
sung 50 µL các mẫu dịch cần phân tích vào các giếng của đĩa 96 giếng, sau đó tiếp tục bổ
sung 150 µL H2SO4 đặc và nhanh chóng bổ sung 30 µL phenol 5% vào từng giếng. Đĩa 96
22
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
giếng sau đó được đun nóng cách thủy 90 oC trong 5 phút rồi làm nguội về nhiệt độ phịng
trong 5 phút, lau khơ rồi đo ở bước sóng A490.
Pha các dung dịch đường D – Glucose với các nồng độ (µmol/mL): 0,5 - 1 - 2 - 3.
Với cách làm như trên, xây dựng đường chuẩn D – Glucose đo ở bước sóng A490. Đồ thị
đường chuẩn được xây dựng nhờ phần mềm Microsoft Excel (hình 2.1) với hàm y =
0,3715x + 0,0403, R2 (hệ số tương quan) = 0.9594. Trong đó, x là hàm lượng đường D –
Glucose, y là giá trị A490 tương ứng.

Hình 2.1. Đường chuẩn D – Glucose đo ở bước sóng A490
2.6.2.4.

Xác định hàm lượng acid tổng số

Định lượng hàm lượng acid lactic theo phương pháp chuẩn độ xác định hàm lượng
acid tổng số (Tiêu chuẩn quốc gia TCVN, 2007).
Nguyên tắc:
Chuẩn độ trực tiếp các acid có trong mẫu bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) với
chỉ thị phenolphtalein và xác định hàm lượng acid có trong mẫu thơng qua phương pháp
xác định độ Thưrner.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ

23
Sinh viên Hồng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
Cân chính xác 0,4 g NaOH cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung thêm nước cất
cho đến khi đạt 100mL. Sau đó, pha lỗng phenolphtalein trong cồn 60° để thu được dung
dịch phenolphtalein 1%.
Phân tích mẫu thí nghiệm
Sau thời gian ni cấy tĩnh, dịch ni cấy vi khuẩn Lactobacillus plantarum được li
tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 °C và thu dịch nổi. Hút 5 – 10 mL dịch nổi vào
bình tam giác sạch (100 mL), thêm 20 mL nước cất trung tính và 3 giọt dung dịch
phenolphtalein 0,1% lắc đều cho đến khi dung dịch trong, rồi chuẩn độ bằng natri
hydroxit 0,1 N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt bền trong 30 giây.
Tính kết quả
Độ acid chung (X) tính bằng độ Thörner (°Th), độ acid chung (X) là số mL NaOH
0,1N trung hịa lượng acid tự do có trong 100 mL (tính bằng °Th). Hàm lượng acid tổng
số (X) của mẫu tính bằng g/100mL theo cơng thức: X =
Trong đó:
V - thể tích natri hydroxit 0,1N, mL;
V1 - thể tích mẫu hút để chuẩn độ, mL;

K - hệ số để tính ra loại acid tương ứng (độ chuẩn theo chất cần xác định):
Với acid lactic K bằng 0,009
2.6.3. Phương pháp vi sinh
2.6.3.1. Phương pháp giữ giống
Phương pháp cấy truyền định kỳ: Vi khuẩn Lactobacillus plantarum cấy định kì lên
mơi trường MRS đặc. Cấy truyền định kì trên mơi trường mới cứ 2 tháng 1 lần (Nguyễn
Lân Dũng, 2010).
2.6.3.2.

Phương pháp hoạt hóa giống

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum (L. plantarum) được hoạt hóa trên mơi trường
MRS lỏng. Lấy một vịng que cấy giống bảo quản, cấy vào bình tam giác 100 mL chứa 25
mL môi trường MRS lỏng đã vô trùng rồi nuôi tĩnh trong 48 giờ với điều kiện nhiệt độ ở
30 °C.
2.6.3.3.

Phương pháp xác định mật độ tế bào
24

Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC


Khóa luận tốt nghiệp
Mật độ tế bào được xác định theo hai phương pháp: Đếm số lượng tế bào khuẩn lạc
trên môi trường MRS rắn kết hợp với xác định giá trị OD (optical density – mật độ
quang) ở bước sóng 610 nm để xây dựng mối tương quan giữa mật độ tế bào và giá trị
OD610.
Xác định mật độ tế bào sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc xuất

hiện trên môi trường MRS vô trùng.
Hút 0,1 mL dịch lên men, pha loãng theo phương pháp tới hạn 10-1 - 10-6.
Lấy 0,1 mL dịch mẫu ở các độ pha loãng phù hợp đưa lên đĩa Petri chứa môi trường
MRS đặc vô trùng và trang đều. Các hộp lồng Petri được giữ ở nhiệt độ 30 oC trong 24
giờ. Mỗi độ pha loãng được cấy lặp lại trên 3 hộp lồng. Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên
mỗi hộp lồng được xác định. Số lượng tế bào vi khuẩn L. plantarum trong 1 mL dịch lên
men được xác định theo công thức sau:
N = A : V : Df
Trong đó, N là số lượng khuẩn lạc trên 1 mL dịch mẫu;
A là số lượng khuẩn lạc trung bình đếm được trên một đĩa Petri ở độ pha lỗng
nhất định;
V là thể tích dịch mẫu cấy trên một đĩa Petri;
Df: là độ pha loãng mẫu (10-n)
Xác định giá trị OD tương ứng ở bước sóng 610nm
Xác định sự tương quan giữa số lượng tế bào L. plantarum và giá trị OD ở bước
sóng 610 nm bằng máy đo quang phổ UV với mỗi độ pha loãng. Đồ thị đường chuẩn thể
hiện mối tương quan giữa mật độ tế bào trong 1 mL dịch nuôi cấy và giá trị OD 610 được
xây dựng bằng phần mềm Microsoft Excel. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa số
lượng tế bào/mL và giá trị OD 610 với là y = 103,32x + 21,628, trong đó y là số lượng tế
bào trong 1 mL dịch nuôi cấy và x là giá trị OD tương ứng. Hệ số tương quan R 2 =
0,9909, chứng tỏ tương quan giữa x và y là rất chặt chẽ.

25
Sinh viên Hoàng Thu Thủy – 68CLC