ĐỀ CƯƠNG CHI TIẾT

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

PHẠM TUẤN OANH

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC
VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN CỦA MỘT SỐ DÕNG
LẠC (Arachis hypogaea L.) CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO
CHỊU MẤT NƢỚC VÀ XỬ LÝ CHIẾU XẠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

PHẠM TUẤN OANH

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC
VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN CỦA MỘT SỐ DÕNG
LẠC (Arachis hypogaea L.) CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO
CHỊU MẤT NƢỚC VÀ XỬ LÝ CHIẾU XẠ

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hồng Mậu đã tận
tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành
luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Thị Thu Thủy (Khoa Sinh - KTNN) đã
nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm và hỗ trợ tơi trong suốt q trình thực
nghiệm và hồn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các kỹ thuật viên phịng Hóa sinh; Phịng Cơng
nghệ tế bào; Phịng Di truyền và Công nghệ gen (Khoa Sinh - KTNN - Trƣờng Đại
học Sƣ Phạm Thái Nguyên); Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen (Viện
Khoa học Sự sống - ĐH Thái Nguyên) và các cán bộ thuộc Viện Cơng nghệ Sinh
học đã giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Sƣ phạm
Thái Nguyên, Khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN và các thầy cô
giáo, cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình học tập và hồn
thành luận văn.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời những cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã
luôn động viên và ủng hộ tôi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu.
Tác giả

Phạm Tuấn Oanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




i

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Mục lục ........................................................................................................................ i
Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... iv
Danh mục các bảng ..................................................................................................... v
Danh mục các hình .................................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3
1.1. CÂY LẠC ............................................................................................................ 3
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây lạc ........... 3
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của hạt lạc........................................................................... 4
1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam .......................................... 5
1.2. TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT ...................................................................... 7
1.2.1. Hạn và tác động của hạn đến thực vật .............................................................. 7
1.2.2. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn ......................... 8
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
TRONG CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT .............................................. 10
1.4. MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY TRỒNG
VÀ CÂY LẠC ........................................................................................................... 12
1.5. CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN Ở THỰC VẬT ......................................... 14

1.5.1. Cysteine proteinase ......................................................................................... 14
1.5.2. Cystatin chất ức chế cysteine proteinase ........................................................ 15
1.5.3. Gen mã hóa cystatin ở thực vật và cây lạc ...................................................... 19
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................21
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................... 21
2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................................. 21
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ......................................................................................... 21
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 22
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................... 22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ii
2.2.1. Mơ hình nghiên cứu tổng qt ........................................................................ 22
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng ................................................... 23
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng hạt............................................................. 23
2.2.4. Khả năng chịu hạn của các dòng lạc đƣợc đánh giá ở giai đoạn hạt nảy
mầm bằng phƣơng pháp gây hạn sinh lý .................................................................. 24
2.2.5. Phƣơng pháp sinh học phân tử ........................................................................ 25
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 27
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................28
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NƠNG HỌC VÀ CHẤT LƢỢNG
HẠT CỦA MỘT SỐ DỊNG LẠC NGHIÊN CỨU ................................................. 28
3.1.1. Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm ........ 28
3.1.2. Chất lƣợng hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm ..................... 31
3.1.3. Đặc điểm nơng học của một số dịng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Sáu .......... 35
3.1.4. Nhận xét về đặc điểm nơng học, chất lƣợng hạt của các dịng lạc nghiên cứu...... 37
3.2. KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở GIAI ĐOẠN NẢY MẦM CỦA MỘT SỐ

DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU Ở THẾ HỆ THỨ NĂM TRONG ĐIỀU KIỆN
GÂY HẠN SINH LÝ ............................................................................................... 40
3.2.1. Hoạt độ của α - amylase trong điều kiện gây hạn sinh lý ............................... 40
3.2.2. Hàm lƣợng đƣờng trong điều kiện gây hạn sinh lý ........................................ 42
3.2.3. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm lƣợng đƣờng của
các dòng lạc nghiên cứu trong giai đoạn hạt nảy mầm ............................................ 43
3.2.4. Hoạt độ của protease trong điều kiện gây hạn sinh lý .................................... 44
3.2.5. Hàm lƣợng protein trong điều kiện gây hạn sinh lý ....................................... 46
3.2.6. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của protease và hàm lƣợng protein ở giai
đoạn hạt nảy mầm ..................................................................................................... 48
3.2.7. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc nghiên cứu trong điều
kiện hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm ................................................................ 48
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN Ở LẠC ...... 49
3.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số ............................................................. 49
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




iii
3.3.2. Kết quả PCR nhân gen cystatin ...................................................................... 50
3.3.3. Kết quả tách dòng gen cystatin ....................................................................... 51
3.3.4. Kết quả xác định trình tự nucleotide ............................................................... 52
3.3.5. Kết quả so sánh trình tự amino acid................................................................ 57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................59
CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ..............................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................61

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
ABA

Abscisic acid

bp

Base pair

CTAB

N- Cetyl- N,N,N- trimethyl amonium bromide

Cv

Hệ số biến động

cDNA

Complementary DNA

ĐC

Đối chứng

DNA

Deoxyribose Nucleic Acid

ĐVHĐ

Đơn vị hoạt độ

đtg

Đồng tác giả

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

HSP

Heat shock protein

IPTG

Isopropyl β – D –1 thiogalactopyranoside

ha

Hecta

Krad

Kilorad

Kb

Kilo base

kDa

Kilo dalton

LB

Luria – Bertani

LEA

Late embryogenesis abundant

LTP

Lipid transfer protein

MGPT

Môi giới phân tử

mRNA

Messenger Ribonucleic acid

Nxb

Nhà xuất bản

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

TAE

Tris acetate EDTA

TN

Thí nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lƣợng lạc trên thế giới từ năm 2005 – 2009 ........ 5

Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc ở Việt Nam từ 2005 – 2009 ............. 6
Bảng 3.1. Một số đặc điểm nơng học của các dịng lạc ở thế hệ thứ Năm ................ 28
Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất và chất lƣợng hạt của các dòng
lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm ............................................................. 32
Bảng 3.3. Đặc điểm nông học của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Sáu .......... 35
Bảng 3.4. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng lạc ở thế hệ thứ Sáu .......... 37
Bảng 3.5. Hoạt độ của α - amylase trong điều kiện gây hạn sinh lý .......................... 41
Bảng 3.6. Hàm lƣợng đƣờng tan trong điều kiện gây hạn sinh lý ............................. 43
Bảng 3.7. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm lƣợng đƣờng
tan ở giai đoạn hạt nảy mầm ..................................................................... 44
Bảng 3.8. Hoạt độ của protease trong điều kiện gây hạn sinh lý ............................... 45
Bảng 3.9. Hàm lƣợng protein trong điều kiện gây hạn sinh lý .................................. 47
Bảng 3.10. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ của protease và hàm lƣợng protein ở
giai đoạn hạt nảy mầm .............................................................................. 48
Bảng 3.11. Sự sai khác về trình tự nucleotide ở dịng R5.44, RM5.46 và ba trình
tự gen cystatin lạc đã cơng bố trên GenBank ........................................... 55
Bảng 3.12. Độ tƣơng đồng và độ sai khác của trình tự gen cystatin ở dịng lạc
RM5.46 và R5.44 với ba trình tự gen cystatin lạc cơng bố trên
Genbank .................................................................................................... 56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Mơ hình nghiên cứu tổng qt ....................................................................22

Hình 2.2. Vector pTZ57R/T ........................................................................................26
Hình 3.1. Khu vực thí nghiệm và một số dịng nghiên cứu ngồi đồng ruộng ...........33
Hình 3.2. Một số dịng lạc nghiên cứu và giống lạc L18 ở thế hệ thứ Năm ...............34
Hình 3.3. Hình ảnh quả và hạt của các dòng lạc nghiên cứu và giống L18 ở thế
hệ thứ Sáu ...................................................................................................39
Hình 3.4. Hoạt độ của α - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng phƣơng pháp
định tính ......................................................................................................42
Hình 3.5. Hoạt độ của protease ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng phƣơng pháp định tính .....46
Hình 3.6. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ
thứ Năm và giống gốc L18 .........................................................................49
Hình 3.7. Kết quả nhân gen cystatin ở dịng lạc R5.44 và RM5.46 .............................50
Hình 3.8. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α........51
Hình 3.9. Kết quả colony – PCR ở dịng lạc R5.44 và RM5.46 ..................................52
Hình 3.10. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI ............................52
Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide của gen cystatin ở dịng R5.44, RM5.46 và
ba trình tự gen cystatin lạc đã cơng bố trên GenBank ................................54
Hình 3.12. Mối quan hệ di truyền của gen cystatin ở dòng lạc R5.44 và RM5.46
với ba trình tự gen cystatin lạc đã cơng bố trên Genbank .........................56
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid của gen cystatin ở dòng lạc R5.44 và
RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc cơng bố trên Genbank .................57

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây cơng nghiệp ngắn ngày, có lịch sử canh tác
lâu đời, có giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cao. Lạc cịn là cây trồng có khả
năng thâm canh, cải tạo đất tốt, chống xói mịn và phù hợp với cơ cấu chuyển đổi
kinh tế nông nghiệp hiện nay [4].
Ở Việt Nam, lạc đƣợc trồng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc vào Nam, tuy nhiên
diện tích trồng cịn khá phân tán, năng suất và chất lƣợng chƣa ổn định. Một trong
những nguyên nhân ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng lạc là do biến đổi khí
hậu tồn cầu đang theo xu hƣớng sa mạc hóa, gây hạn hán kéo dài ở nhiều nơi. Vì
vậy, vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu và tuyển chọn đƣợc những giống lạc có năng
suất, chất lƣợng tốt và có khả năng chịu hạn, thích hợp với điều kiện khí hậu và thổ
nhƣỡng ở nƣớc ta [4], [18], [19].
Kỹ thuật chọn dòng biến dị soma đƣợc ứng dụng rộng rãi trong chọn tạo các
giống cây trồng có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi
trƣờng. Với nguồn biến dị cao (10-5 – 10-8), đa đạng về kiểu gen và kiểu hình, kỹ
thuật này cho phép tiến hành chọn lọc các dòng tế bào nhanh và hiệu quả hơn so với
các phƣơng pháp truyền thống. Ngoài ra, có thể nghiên cứu ảnh hƣởng của các tác
nhân bất lợi lên thực vật ở các mức độ khác nhau (gen, tế bào, mô, cơ quan nuôi
cấy, phân lập cây hồn chỉnh). Tính ƣu việt của kỹ thuật này đã đƣợc khẳng định
trên cây lúa [2].
Đối với cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy và đtg (2009), bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
tế bào thực vật, kết hợp gây mất nƣớc và xử lý mô sẹo bằng chiếu xạ đã chọn lọc
đƣợc một số dịng cây xanh từ mơ sẹo giống lạc L18. Các dòng lạc chọn lọc đƣợc
trồng và đánh giá qua các thế hệ đã tuyển chọn và phân loại các dịng theo nhóm có
triển vọng về năng suất, chất lƣợng hạt và có khả năng chống chịu hạn [20].
Để góp phần nghiên cứu bản chất của tính chống chịu ở thực vật, việc nghiên
cứu và phân lập các gen liên quan đến tính chống chịu là rất cần thiết. Qua đó, giúp
các nhà chọn giống phân tích và đánh giá hệ gen thực vật một cách nhanh chóng,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
xác định sự thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử và tìm ra chỉ thị phân
tử trong việc chọn giống cây trồng có khả năng chống chịu cao [2], [11]. Cystatin là
chất ức chế cysteine proteinase, liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng của
tế bào [31], [41], [46]. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cystatin có liên
quan đến khả năng chống chịu của thực vật đối với tác động bất lợi của các nhân tố
mơi trƣờng, giúp cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh [40], [42], [44], [52].
Để tiếp tục hƣớng nghiên cứu chọn lọc các dòng cây lạc mang các tính trạng
mong muốn, chúng tơi đã tiến hành đề tài: “Đánh giá một số đặc điểm nông sinh
học và phân lập gen cystatin của một số dòng lạc (Arachis hypogaea L.) có
nguồn gốc từ mơ sẹo chịu mất nước và xử lý chiếu xạ”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc dịng lạc có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu xử lý thổi khô và
thổi khô kết hợp chiếu xạ ƣu việt về một số đặc điểm nông sinh học và khả năng
chịu hạn ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu.
Xác định đƣợc điểm khác biệt về trình tự gen cystatin của dịng lạc có nguồn
gốc từ mô sẹo chịu xử lý thổi khô và thổi khô kết hợp chiếu xạ so với giống gốc ở
thế hệ thứ Năm.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của một số dịng lạc có nguồn gốc từ
mơ sẹo chịu xử lý thổi khô và chiếu xạ ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu.
3.2. Đánh giá chất lƣợng hạt của một số dịng lạc nghiên cứu thơng qua xác định
hàm lƣợng lipid và protein trong hạt tiềm sinh ở thế hệ thứ Năm.
3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng lạc nghiên
cứu trong điều kiện hạn sinh lý ở thế hệ thứ Năm.
3.4. Phân lập, tách dịng và xác định trình tự gen cystatin của dòng lạc chịu hạn tốt
và dòng lạc chịu hạn kém ở thế hệ thứ Năm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY LẠC
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây lạc
Cây lạc là loại cây thân thảo, thuộc học đậu (Leguminosae), chi Arachis,
phân họ cánh bƣớm phƣợng (Papillionaceae), bộ NST 2n = 40. Chi Arachis có 9
lồi. Lồi lạc trồng là Arachis hypogaea L. Loài Arachis hypogaea gồm nhiều kiểu,
dạng và biến chủng khác nhau [4].
Cây lạc có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Sau đó, lạc đƣợc đƣa sang Châu Phi, rồi
đến Châu Á, Châu Âu. Đến nay, cây lạc đƣợc trồng ở nhiều nơi trên thế giới. Ở Việt
Nam lạc du nhập từ Trung Quốc sang và đƣợc trồng vào khoảng thế kỉ thứ XIX [4].
Về hình thái, cây lạc có ba bộ phận chính: rễ, thân, lá.
Rễ lạc là bộ rễ cọc gồm một rễ chính ăn sâu và hệ thống rễ bên rất phát triển.
Giống các rễ các cây họ đậu khác, rễ cây lạc có nhiều nốt sần. Các nốt sần này do vi
khuẩn Rhizobium sống cộng sinh với rễ cây lạc tạo nên và có khả năng cố định nitơ
khí quyển để bổ sung đạm cho cây và đất [19].
Thân lạc lúc còn non có hình trịn, lúc già có cạnh và rỗng ruột. Trên thân có
lơng ngắn và nhiều lơng tơ. Chiều cao của thân cây lạc thay đổi tùy theo giống, kỹ
thuật trồng trọt và điều kiện ngoại cảnh. Thân lạc có chiều cao thay đổi trong phạm
vi 19 – 80cm. Hình thái thân cây là một đặc điểm để phân biệt các giống lạc [4].
Lá cây lạc thuộc loại lá kép hình lơng chim. Mỗi giống lạc đều có những đặc
điểm riêng về hình lá, mũi lá, màu lá, cỡ lá, hình lá kèm, tỷ lệ giữa chiều dài với
chiều rộng lá và tỷ lệ giữa cuống lá với trục lá [4], [18].

Hoa lạc thƣờng có màu vàng da cam, đơi khi có màu trắng, hoa mọc thành
chùm từ các nách lá. Cây lạc tự thụ phấn nghiêm ngặt, nhƣng có khoảng 2 – 3%
hiện tƣợng thụ phấn chéo xảy ra nhờ cơn trùng [19].
Quả lạc là quả khơ, có hình kén, một đầu có dính với tia, quả thắt ở giữa
ngăn các hạt, vỏ quả cứng có gân mạng, chứa từ 1 – 3 hạt. Hạt lạc nằm trong quả
hạt, gồm có 3 bộ phận: vỏ lụa, lá mầm và mộng [4].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




4
Về mặt sinh thái, cây lạc chịu ảnh hƣởng của nhiều nhân tố sinh thái: nhiệt
độ, nƣớc, độ ẩm, ánh sáng, đất và các chất khống. Nhiệt độ trung bình từ 25 –
30°C thích hợp cho cây lạc sinh trƣởng, phát triển và đạt năng suất cao. Nƣớc là yếu
tố chính đảm bảo cho sinh trƣởng và phát triển của cây lạc. Nhu cầu về nƣớc thay
đổi theo từng thời kỳ. Độ ẩm thích hợp cho cây lạc phát triển từ 60 – 70% [4].
Dựa vào thời gian sinh trƣởng, cây lạc đƣợc chia làm hai loại: giống chín
sớm có thời gian sinh trƣởng từ 90 – 125 ngày, giống chín muộn có thời gian sinh
trƣởng từ 140 – 160 ngày [4], [18], [19].
Lạc là loại cây trồng có giá trị về nhiều mặt: kinh tế, cải tạo đất, tăng vụ. Hạt
lạc là một trong những loài thực phẩm cung cấp lƣợng dinh dƣỡng cao cho con
ngƣời. Hạt lạc còn là mặt hàng nơng sản xuất khẩu có giá trị, đƣợc sử dụng làm
nguyên liệu trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, phomat. Dầu lạc đƣợc sử dụng
trong y học, kỹ nghệ dầu máy, sản xuất xà phòng. Các sản phẩm phụ của lạc (khô
dầu lạc, thân, lá) đƣợc sử dụng làm thức cho gia súc, phân bón [4]. Việc trồng lạc
góp phần cải tạo, bồi dƣỡng đất, chống xói mịn. Ngồi ra, lạc là nhóm cây ngắn
ngày, có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau nên đƣợc sử dụng làm cây xen
canh, gối vụ, làm tăng giá trị kinh tế trên một diện tích đất trồng [19].
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của hạt lạc

Thành phần hóa sinh hạt phụ thuộc vào giống cây, điều kiện canh tác, khí
hậu, đất đai, dịch bệnh, sâu hại....Hạt lạc thƣờng chứa 40,2 – 60,7% lipid; 20,0 –
33,7% protein; 2,0 – 4,3% cellulose; 6,0 – 22,0% đƣờng; 1,8 – 4,6 % chất khoáng,
và một số loại vitamin khác nhau. Trong 100g hạt lạc chứa 300 UI vitatmin B1 và
60 UI vitamin A, cung cấp 550 calo [4].
Lipid chiếm tỉ lệ cao nhất trong thành phần vật chất khô của hạt lạc. Thành
phần lipid bao gồm 80% các axit béo khơng bão hịa và 20% các axit béo bão hòa.
Thành phần các loại axit béo trong lạc thay đổi theo giống, điều kiện canh tác.
Protein trong hạt lạc có đặc tính chung của globulin, chứa chủ yếu là conarachin và
arachin. Trong hạt lạc có đủ 8 loại amino acid không thay thế nên là nguồn cung
cấp protein rất tốt cho con ngƣời [4], [18].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




5
Lạc là cây lấy dầu, nên việc đánh giá chất lƣợng các giống lạc phụ thuộc chủ
yếu vào hàm lƣợng lipid [17]. Bên cạnh đó, hàm lƣợng protein trong hạt cũng rất
quan trọng, không chỉ phản ánh phẩm chất giống mà còn liên quan đến khả năng
chống chịu của cây [8]. Tuy nhiên, lƣợng lipid và protein cao trong hạt lạc gây khó
khăn trong q trình bảo quản, làm ảnh hƣởng nghiêm trọng đến phẩm chất hạt. Đối
với hạt giống, việc giảm hàm lƣợng dầu trong hạt có ảnh hƣởng trực tiếp đến tỷ lệ
nảy mầm và sức sống của hạt [17].
1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam
Trong các cây lấy dầu, lạc có diện tích, sản lƣợng đứng thứ hai sau đỗ tƣơng
và đƣợc trồng khắp các châu lục [4].
Cây lạc đƣợc gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nƣớc trên thế giới và là cây
trồng quan trọng đối với các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Á, Châu Phi và

Nam Châu Mỹ [4], [19]. Trên 90% diện tích trồng lạc tập trung ở lục địa Á phi:
châu Á (60%), châu Phi (30%), châu Mỹ (5%), châu Âu (0,22%). Các nƣớc sản xuất
lạc lớn nhất gồm: Ấn Độ, Trung Quốc, Xênêgan, Nigiêria và Mỹ [18]. Về năng suất,
Mỹ là nƣớc có năng suất trung bình tƣơng đối cao, xấp xỉ 2,8 tấn/ ha, sau đó đến
Trung Quốc 2,6 tấn/ha, Argentina 2 tấn/ha. Trong khi đó, ở Châu Phi, năng suất lạc
chỉ đạt 0,7 - 0,8 tấn/ha. Sự khác biệt về năng suất lạc do sự khác biệt về điều kiện tự
nhiên, khả năng đầu tƣ và trình độ ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất lạc ở
các nƣớc trên thế giới [19]. Các số liệu về diện tích, năng suất, sản lƣợng lạc trên thế
giới từ năm 2005 đến 2009 đƣợc thể hiện ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lƣợng lạc trên thế giới từ năm 2005 – 2009
Chỉ tiêu/năm

2005

2006

2007

2008

2009

Diện tích (triệu ha)

24,05

21,62

22,47

23,96

23,95

Năng suất (tấn/ha)

1,60

1,54

1,65

1,57

1,52

Sản lƣợng (triệu tấn)

38,44

33,19

36,98

37,65

36,46

( Nguồn: FAOSTAT, 2009) [53]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




6
Bảng 1.1 cho thấy sản xuất lạc trên thế giới giai đoạn 2005 - 2009 tƣơng đối ổn
định về diện tích, sản lƣợng với năng suất trung bình khoảng 1,5 – 1,6 tấn/ha [53].
Ở Việt Nam, lạc là một trong những mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực
với khối lƣợng lớn và giá trị cao [19]. Việt Nam đứng thứ 5 về sản lƣợng lạc hàng
năm ở Châu Á, sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Indonesia. Trong 7 nƣớc trồng
lạc ở Đông Nam Á, Việt Nam đứng thứ 3 về diện tích trồng lạc, sau Myanmar và
Indonesia, đồng thời có khối lƣợng lạc xuất khẩu lớn nhất chiếm 45,13% (đạt
33,800 tấn) [19].
Ở Việt Nam, cây lạc đƣợc trồng ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nƣớc và
đƣợc chia làm 5 khu vực chính, bao gồm: Đồng bằng sơng Hồng, Trung du và miền
núi phía bắc, Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ,
Đồng bằng sơng Cửu Long. Trong đó, khu vực Bắc Trung Bộ và Dun hải miền
trung có diện tích trồng lạc, năng suất và sản lƣợng cao nhất nƣớc (năm 2008, diện
tích trồng lạc của khu vực này đạt 111,2 nghìn ha, sản lƣợng đạt 204,0 nghìn tấn
[54]. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc ở Việt Nam đƣợc cập nhật trong những
năm gần đây, từ năm 2005 đến 2009 đƣợc thể hiện ở bảng 1.2. Bảng 1.2 cho thấy,
diện tích gieo trồng lạc ở Việt Nam năm 2009 đạt 249,2 nghìn ha (giảm 1,08 lần so
với năm 2005), nhƣng năng suất tăng 1,17 lần so với năm 2005 (đạt 2,11 tấn/ha)
[53]. Năng suất lạc tăng cao cho thấy Việt Nam đã ứng dụng tốt các tiến bộ kỹ thuật
vào trong sản xuất, lai tạo và tuyển chọn đƣợc những giống lạc cho năng suất cao và
phù hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng của Việt Nam (Trạm Xuyên, Sen Lai,
V79, MD7, L02, L05, L14...) [4], [19].
Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc ở Việt Nam từ 2005 – 2009
Chỉ tiêu/năm

2005

2006

2007

2008

2009

Diện tích (1000 ha)

269,6

246,7

254,5

255,3

249,2

Năng suất (tấn/ha)

1,81

1,87

2,00

2,08

2,11

Sản lƣợng (1000 tấn)

489,3

462,5

510

530,2

525,1

(Nguồn: FAOSTAT, 2009) [53]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




7
1.2. TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT
1.2.1. Hạn và tác động của hạn đến thực vật
Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nƣớc của thực vật do
môi trƣờng gây nên trong suốt cả quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hƣởng
đến sinh trƣởng và phát triển [2]. Khái niệm "khô hạn" dùng để chỉ hiện tƣợng mất
nƣớc của cây. Hiện tƣợng mất nƣớc có thể do tác động sơ cấp, là kết quả của sự

thiếu nƣớc trong môi trƣờng, hoặc là tác động thứ cấp đƣợc gây ra bởi nhiệt độ
thấp, sự đốt nóng hay tác động của muối [2], [8].
Những loại cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tƣơng đối
ổn định trong điều kiện khô hạn đƣợc gọi là cây chịu hạn. Khả năng của thực vật có
thể giảm thiểu mức tổn thƣơng do thiếu hụt nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn. Đặc
tính chịu hạn của thực vật đƣợc hình thành trong quá trình tiến hóa dƣới tác động
của chọn lọc tự nhiên [2],[11].
Ảnh hƣởng của hạn trƣớc hết là đến sự mất nƣớc của tế bào và mô. Sự thiếu
hụt nƣớc càng lớn thì ảnh hƣởng càng xấu. Thiếu nƣớc nhẹ chỉ ảnh hƣởng đến quá
trình sinh trƣởng. Thiếu nƣớc nặng hơn gây nên biến đổi hệ keo nguyên sinh chất
theo cùng hƣớng với sự già hóa của tế bào, làm cho cây bị héo. Khi bị khô, nguyên
sinh chất bị đứt gẫy cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thƣơng và chết [2]. Hạn ảnh
hƣởng đến hai quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây là giai đoạn cây non và
giai đoạn ra hoa, do đó làm giảm năng suất cây trồng [11]. Phản ứng của cây đối với
hạn là sự đóng của khí khổng, giảm tỉ lệ thốt hơi nƣớc của mơ, giảm quang hợp và
tăng tích lũy ABA, proline, manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm ascobat,
glutathion....và sự tổng hợp protein mới [50].
Cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn tƣơng đối ở một thời kỳ sinh trƣởng nhất
định. Thiếu nƣớc ở các thời kỳ khác nhau đều ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, phát triển
của cây lạc và làm giảm năng suất [18].
Ở thời kì nảy mầm, nƣớc là nhân tố quan trọng thứ hai sau nhiệt độ ảnh
hƣởng đến thời gian nảy mầm, tỷ lệ mọc và mức độ đồng đều của hạt nảy mầm [4].
Nhiệt độ thích hợp nhất từ 32 – 33oC, độ ẩm đất khoảng 70 – 80 % [4], [18].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




8

Từ thời kỳ cây con đến thời kỳ ra hoa, cây lạc có khả năng chịu đƣợc hạn
nhƣng khả năng này chỉ xảy ra khi các hoạt động sinh lý mạnh mẽ nhƣ ra hoa, hình
thành quả đã diễn ra [19]. Thiếu nƣớc trong thời kỳ ra hoa làm giảm số hoa, đợt rộ
khơng đƣợc hình thành, thời gian ra hoa kéo dài, tỷ lệ hoa có ích giảm do quá trình
thụ phấn bị cản trở. Tuy nhiên, nếu đƣợc tƣới nƣớc kịp thời, lƣợng hoa nở hàng
ngày có thể đƣợc phục hồi và quá trình nở hoa trở lại bình thƣờng [4].
Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ chất khơ
tích lũy cao nên cần lƣợng nƣớc lớn nhất. Nếu thiếu nƣớc trong giai đoạn này làm
giảm số quả chắc, giảm trọng lƣợng hạt, dẫn đến giảm năng suất [4], [19].
Đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về khả năng chịu
hạn trên một số loại cây trồng: lúa [2], đậu tƣơng [8], lạc [1], [10], [16].
1.2.2. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn
Hai cơ chế bảo vệ thực tồn tại trên môi trƣờng thiếu nƣớc gồm cơ chế tránh
mất nƣớc và cơ chế chịu mất nƣớc. Cơ chế tránh mất nƣớc phụ thuộc vào khả năng
thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ và chồi nhằm giảm thiểu tối đa sự
mất nƣớc hoặc tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thơng qua tích lũy các chất
hòa tan, các protein và axit amin nhằm duy trì lƣợng nƣớc tối thiểu trong tế bào. Cơ
chế chịu mất nƣớc liên quan tới những thay đổi sinh hóa trong tế bào nhằm sinh
tổng hợp ra các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nƣớc [47].
Khả năng nhận nƣớc của cây phụ thuộc vào bộ rễ. Hình thái và chức năng
của bộ rễ thƣờng liên quan đến khả năng chịu hạn của cây trồng cạn. Do đó, đặc
điểm của bộ rễ là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong việc tuyển chọn giống
cây trồng có khả năng chịu hạn. Bộ rễ có hình thái khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu
giúp cho cây hút đƣợc nƣớc ở những tầng đất sâu và cho năng suất ổn định trong
điều kiện khó khăn về nƣớc. Ở các loại cây trồng khác nhau, bộ rễ phát triển đa
dạng nhằm khắc phục hiện tƣợng thiếu nƣớc [2], [11].
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào thực vật có liên quan trực
tiếp đến khả năng cạnh trạnh của tế bào rễ cây đối với đất. Khi áp suất thẩm thấu
tăng lên giúp cho tế bào rễ cây thu nhận đƣợc những phân tử nƣớc trong đất, giúp
cho thực vật có thể vƣợt qua đƣợc tình trạng hạn cục bộ [11].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




9
Khi cây bị mất nƣớc dần dần, chất hòa tan đƣợc tích lũy tăng dần trong tế bào
chất, nhằm chống lại mất nƣớc và tăng khả năng giữ nƣớc của chất ngun sinh. Khi
phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn cho thấy có hiện tƣợng tăng lên
về hoạt độ enzyme, hàm lƣợng ABA hàm lƣợng proline, nồng độ các chất hòa tan sắc
tố nhƣ betain, nồng độ ion K+, các loại đƣờng tan, axit hữu cơ...đồng thời giảm phức
hợp CO2, giảm tổng hợp protein và axit nucleic [2], [11], [35].
ABA là hormone thực vật có liên quan đến các quá trình sinh lý, sinh trƣởng
và phát triển, đáp ứng với stress của thực vật bậc cao. ABA có vai trị điều chỉnh sự
trao đổi nƣớc trong cây, hạn chế sự mất nƣớc của cây và giúp cây thích nghi đƣợc
với điều kiện khơ hạn. Khi cây bị hạn, hàm lƣợng ABA trong cây tăng lên giúp cây
tăng khả năng đáp ứng với điều kiện khô hạn [11].
Thành phần hoá sinh hạt nhƣ protein tan, đƣờng tan, enzyme… không chỉ
là cơ sở để đánh giá chất lƣợng hạt mà còn thể hiện khả năng chống chịu của cây
trồng [2], [8].
α - amylase xúc tác quá trình phân giải tinh bột thành các phân tử có khối
lƣợng thấp, cuối cùng thành glucose, mantose. Nhiều nghiên cứu cho thấy có mối
tƣơng quan thuận giữa hàm lƣợng đƣờng tan và hoạt độ của α - amylase. Sự gia tăng
hoạt độ của α - amylase, làm tăng hàm lƣợng đƣờng tan trong tế bào, cung cấp cho
quá trình nảy mầm của hạt, sự sinh trƣởng của mầm, tăng áp suất thẩm thấu trong tế
bào và bảo vệ cấu trúc tế bào khỏi tác động của các điều kiện cực đoan [8], [16].
Protease đóng vai trị quan trọng trong cơ thể sống và nhất là trong thời kỳ
nảy mầm của hạt. Protease tham gia vào quá trình phân giải protein dự trữ trong hạt,
cung cấp amino acid cho thời kỳ phát triển đầu tiên của cây, tham gia vào quá trình
vi xử lý phân tử protein và hoạt hóa các enzyme. Protease tham gia phân giải

protein lạ hoặc bị biến tính khi gặp điều kiện cực đoan (lạnh, mặn, hạn, tác động cơ
học...[26].
Trần Thị Phƣơng Liên (1999) khi so sánh phổ điện di hoạt tính protease của
các giống đậu tƣơng chịu nóng, chịu hạn khác nhau đã nhận thấy protease của các
giống đậu tƣơng nghiên cứu rất đa dạng, có hoạt tính cao, có khả năng phân giải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




10
hoàn toàn protein dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho cơ thể mới. Xử lý
nhiệt độ cao không ảnh hƣởng đến protease ở một số giống chịu nóng, nhƣng ảnh
hƣởng đến các giống chịu hạn [8].
Nghiên cứu cơ chế phân tử của tính chống chịu chủ yếu đi vào hai hƣớng
tiếp cận chính:
- Khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác động của điều kiện cực đoan: Nghiên cứu
sự biểu hiện và chức năng của các chất, các gen tƣơng ứng liên quan đến sự bảo vệ
các enzyme, các cấu trúc trong tế bào, đồng thời đào thải các chất bị biến tính có
khả năng gây độc cho tế bào khi gặp điều kiện cực đoan. Những nhóm chất đƣợc
quan tâm đến là protein sốc nhiệt (HSP), trong đó có các chất MGPT, ubiquitin,
protease.
- Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: Nghiên cứu các chất có khả năng
tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bảo để cạnh tranh nƣớc với mơi trƣờng xung
quanh. Những nhóm chất đƣợc chú ý đến gồm: ion K+, amino acid, proline, estoine,
các chất đƣờng: glucose, sucrose, fructose, mannitol.. Ngoài ra cịn có các chất:
glycine betaine, β – alanine betaine. Sản phẩm của các gen liên quan đến khả năng
bảo vệ của tế bào khỏi tác động của các điều kiện cực đoan [2], [8], [11].
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

TRONG CHỌN DÕNG CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đang đƣợc xem là công cụ mới cho
việc cải tạo tính chống chịu ở thực vật. Quá trình ni cấy mơ và tế bào thực vật tạo
ra nguồn biến dị cao (10-5 - 10-8), nếu kết hợp xử lý đột biến thì tần số có thể tăng
lên gấp 10 lần. Các biến dị soma này phong phú và đa dạng về kiểu gen và kiểu
hình. Vì thế có thể tiến hành chọn lọc đƣợc những dịng tế bào khác nhau về các đặc
điểm sinh lí, sinh hóa nhanh và hiệu quả hơn các phƣơng pháp chọn giống truyền
thống. Các tính trạng đƣợc chọn lọc có thể di truyền cho các thế hệ sau thông qua
sinh sản hữu tính và trở thành tính trạng ổn định của giống khi đáp ứng đƣợc yêu
cầu tạo giống. Đồng thời, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho phép nghiên cứu cho
phép nghiên cứu tìm hiểu và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu thơng
qua nghiên cứu ảnh hƣởng của các tác nhân bất lợi lên thực vật ở các mức độ khác
nhau (gen, tế bào riêng rẽ, tế bào mơ, cơ quan ni cấy, cây hồn chỉnh) [2].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




11
Hiện nay đã có một số cơng trình nghiên cứu cải thiện hoặc nâng cao khả năng
chống chịu của cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nhƣ chịu hạn lúa [14].
Adkins và đtg (1995) bằng việc bổ sung PEG8000 vào môi trƣờng nuôi cấy
mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105 đã chọn đƣợc dòng lúa chịu hạn có những
tính trạng nơng học quan trọng và khả năng chịu hạn đƣợc duy trì và ổn định ở thế
hệ R2 [23].
Nguyễn Thị Tâm và đtg (2009) tiến hành đánh giá một số đặc điểm hóa sinh
của các dịng lúa chọn lọc thế hệ thứ 4 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc giống
lúa Khang Dân. Kết quả cho thấy hàm lƣợng protein, đƣờng tan, lipid của hầu hết
các dịng chọn lọc có xu hƣớng tăng cao hơn so với giống gốc. Tác giả đã chọn lọc
đƣợc dịng R4.05 có hàm lƣợng protein cao nhất và dịng R4.05 có hàm lƣợng

đƣờng tan đạt cao nhất. Phân tích thành phần amino acid trong protein dự trữ của
hạt đã xác định đuợc sự có mặt của 17 loại amino acid với hàm lƣợng khác nhau,
bao gồm các amino acid khơng thay thế. Các dịng chọn lọc tiếp tục đƣợc đánh giá
về khả năng chịu hạn để chọn lọc dòng ƣu việt [15].
Vũ Thị Thu Thủy và đtg (2011) bằng kỹ thuật xử lý mất nƣớc mô sẹo và gây
đột biến bằng chiếu xạ liều 2 krad kết hợp với thổi khô 9 giờ giống lạc L18 đã thu
đƣợc 167 dịng mơ, từ đó tạo ra 198 dịng lạc. Đánh giá các đặc điểm nông sinh học
qua 5 thế hệ, tác giả đã thu đƣợc 7 dịng có sự ổn định các tính trạng về chiều cao
thân chính, số quả/cây, số quả chắc/cây tốt hơn so với giống gốc. Phân tích một số
đặc điểm nơng học, chỉ tiêu năng suất, chất lƣợng hạt ở thế hệ thứ năm và sự sai
khác hệ gen của 7 dòng chọn lọc đã tuyển chọn 3 dòng ƣu việt về năng suất, chất
lƣợng hạt. Các dòng ƣu việt trên đƣợc tiếp tục đánh giá, theo dõi về các tính trạng
liên quan đến khả năng chịu hạn của cây lạc [20].
Đinh Thị Phòng và đtg (2004) bằng phƣơng pháp chọn dòng biến dị soma đã
tạo đƣợc 2 dịng lúa DR1, DR2 có khả năng chịu lạnh và chịu hạn tốt. Dịng DR2
đƣợc cơng nhận là giống lúa quốc gia năm 1998. Tiếp tục sử dụng phƣơng pháp
chọn dòng tế bào mang biến dị soma từ giống lúa CR203, tác giả đã chọn đƣợc
dòng lúa DR3 có triển vọng, tính chịu hạn đƣợc cải thiện so với giống gốc CR203
thông qua hàm lƣợng proline tăng 1,4 lần [14].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




12
1.4. MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY TRỒNG
VÀ CÂY LẠC
Đặc tính chịu hạn của thực vật đƣợc hình thành trong q trình tiến hóa dƣới
tác động của chọn lọc tự nhiên. Nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lí, hóa sinh và

cấu trúc tế bào nhận thấy hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở tất cả các mức độ khác
nhau, trong các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển khác nhau. Điều này chứng tỏ tính
chống chịu của thực vật là một hệ đa gen, nhiều gen quy định, biểu hiện trong các
giai đoạn phát triển khác nhau của cây. Ngày nay, trên thực tế vẫn chƣa tìm đƣợc
gen giữ vai trị chính quyết định tính chịu hạn, mà chỉ tìm thấy các gen liên quan
đến đặc tính này [8], [11].
* Gen liên quan đến tăng cường áp suất thẩm thấu
LEA là loại protein đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn trong giai đoạn muộn
của q trình hình thành phơi và liên quan đến điều kiện mất nƣớc của tế bào. LEA
điều chỉnh quá trình mất nƣớc sinh lý khi hạt chín, đồng thời hạn chế sự mất nƣớc
bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra nhƣ nóng, lạnh, muối cao. Mức
độ phiên mã của gen LEA đƣợc điều kiển bởi ABA, độ mất nƣớc của tế bào và áp
suất thẩm thấu trong tế bào [43]. Ngày nay, nhiều gen LEA đã đƣợc nghiên cứu,
phân lập, và xác định chức năng. Dramé và đtg (2007) đã phân lập mRNA của gen
LEA trên cây lạc dài 556 nucleotide [29]. Hundertmark và đtg (2008) đã xác định
đƣợc 51 gen mã hóa cho protein LEA từ hệ gen của cây Arabidopsis và đƣợc phân
loại thành 9 nhóm riêng biệt. Bằng phƣơng pháp định lƣợng Real Time PCR, các
tác giả đã tìm thấy bằng chứng về sự biểu hiện của cả 51 gen LEA này ở các giai
đoạn phát triển của thực vật, trong các cơ quan và các tác nhân bất lợi, hormone.
LEA phản ứng với ABA, nhiệt độ thấp, lạnh hoặc hạn [34].
Khi tế bào bị mất nƣớc, proline đƣợc tích lũy nhiều trong tế bào chất làm hạn
chế sự mất nƣớc và tăng khả năng giữ nƣớc của chất nguyên sinh. Khả năng điều
chỉnh áp suất thẩm thấu của proline thể hiện ở khả năng giữ nƣớc và lấy nƣớc vào tế
bào. Proline cịn có khả năng thay thế nƣớc ở nơi xảy ra có phản ứng sinh hóa, khả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
năng tƣơng tác với lipid và protein màng, ức chế sự phá hủy của các phức
protein...[2], [11].
P5CS (pyrroline - 5 - carboxylase) là một trong những enzyme chức năng,
tham gia vào q trình tổng hợp proline. Proline đóng vai trị quan trọng trong quá
trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong cơ thể thực vật. Gen P5CS biểu hiện mạnh
mẽ làm tăng hàm lƣợng proline, có vai trị tăng cƣờng áp suất thẩm thấu của tế bào
và cây trong điều kiện khơ hạn. Gen mã hóa cho enzyme P5CS đã đƣợc nghiên cứu
và tách dòng ở nhiều loại cây khác nhau. Nhiều dòng cây trồng đã đƣợc chuyển gen
P5CS nhằm tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi nhƣ hạn, mặn,
lạnh... [11].
* Gen liên quan đến khả năng bảo vệ thành tế bào
Gen LTP có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận chuyển
phospholipid qua màng. LTP xúc tác sự vận chuyển lipid qua màng tế bào, tham gia
vào cấu tạo lớp sáp, lớp biểu bì, làm tăng độ dày của lớp màng tế bào, giúp thực vật
có thể giảm mất nƣớc, phản ứng bảo vệ chống bệnh của cây và thích nghi với những
biến đổi của môi trƣờng. Khi gặp điều kiện cực đoan của môi trƣờng, các nhân tố
nhƣ hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đƣờng truyền tín hiệu… sẽ điều
khiển gen LTP hoạt động, tổng hợp nên protein tƣơng ứng giúp cây tăng khả năng
chống chịu và hạn chế tác động của các nhân tố bất lợi của môi trƣờng [28], [32].
Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu và đtg (2003) nhận thấy rằng hàm lƣợng mRNA
của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress muối, stress hạn hay khi hàm lƣợng ABA
ngoại bào tăng lên [37].
* Các gen liên quan đến chất bảo vệ tế bào: Môi giới phân tử, các protein
sốc nhiệt (HSP).
HSP chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có ở hầu hết các loài thực
vật. HSP đƣợc tổng hợp thêm trong điều kiện môi trƣờng cực đoan nhƣ hạn, nhiệt
độ cao, muối cao. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự
phá hủy do stress nóng và mở rộng giá trị ngƣỡng chống chịu nhiệt độ cao [49].
Kumar và đtg (2007) đã phân lập đƣợc mRNA của gen mã hóa HSP ở cây lạc dài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




14
450 bp. Đoạn mRNA này có kích thƣớc 17,3 kDa, và đƣợc công bố trên GenBank
với mã số DQ294615.1 [58]. Đoạn mRNA của gen mã hóa protein sốc nhiệt đã
đƣợc Bi và đtg (2008) phân lập thành công. Đoạn mRNA này đƣợc phân lập từ hạt
lạc và có kích thƣớc 533 nucleotide (GenBank: mã số DQ889543) [59].
* Các gen mã hóa sản phẩm điều khiển q trình phiên mã
Đây là các gen có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen liên
quan đến tính chịu hạn thông qua việc bám vào đoạn DNA điều kiển (cis acting
element) trên vùng khởi động (promoter) của gen và tƣơng tác với RNA
polymerase, tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức
năng...Có nhiều yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn của thực vật
nhƣ: DREB, bZIP, MYB... Gen DREB (dehydration responsive elemen binding) ở
cây lạc đã đƣợc tác giả Liu (2008) tách từ lá (GenBank: mã số FM955398) dài 687
nucleotide, mã hóa phân tử protein tƣơng ứng dài 221 amino acid [60].
Cystatin là một loại protein phổ biến trong cơ thể động vật, thực vật và vi
sinh vật… Cystatin tham gia ức chế hoạt động của enzyme tham gia vào quá trình
phân cắt phân tử protein là cysteine proteinase. Gần đây, nhiều nghiên cứu chỉ ra
rằng cystatin có liên quan đến khả năng chống chịu của thực vật dƣới tác động bất
lợi của các nhân tố mơi trƣờng, giúp cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh [31],
[41], [42], [52].
1.5. CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN Ở THỰC VẬT
1.5.1. Cysteine proteinase
Cysteine proteinase có vai trị thiết yếu trong quá trình sinh trƣởng và phát
triển của thực vật, sự già và chết theo chƣơng trình của tế bào, tích lũy và huy động

protein dự trữ trong hạt, cung cấp đạm cho sự phát triển của cây non. Ngồi ra,
cysteine proteinase cịn liên quan đến khả năng chống chịu với những tác động bất
lợi của môi trƣờng [31], [41].
Cysteine proteinase là enzyme tham gia phân cắt chuỗi peptide ở vị trí bên
trong mạch polypeptide (endopeptidyl hydrolase). Trung tâm hoạt động của
cysteine proteinase có chữa nhóm SH (hay cịn gọi là thiol, sunfuhydryl). Nhóm SH

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




15
có khả năng phản ứng cao, tham gia vào nhiều biến đổi hóa học quan trọng nhƣ ion
hóa, oxyl hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, ankyl hóa... Nhóm SH có vai trò quan
trọng đối với hoạt động của enzyme. Khi chức năng của nhóm SH bị khóa, hoạt
động của enzyme sẽ bị ức chế [8], [31], [41].
Cysteine proteinase đƣợc kí hiệu với tiếp đầu ngữ C với hơn 40 họ và đƣợc
xếp vào ít nhất là 6 họ chung. Hầu hết các cysteine proteinase thực vật thuộc họ
papain (C1) và họ legumin (C13). Các thành viên khác của cysteine proteinase gồm:
caspases (C14) và calpains (C2), ubiquitin C – terminal hydrolase (C12) và ubiquitin
– specific proteinase (C19) [31].
Ở động vật có xƣơng sống, cysteine proteinase liên quan đến hệ thống phân
giải protein của lysosome và giữ vai trò ngoại bào trong một vài q trình trao đổi
chất. Ở động vật khơng xƣơng sống, cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa. Đối với
động vật chân đốt, cysteine proteinase giữ vai trị tiêu hóa và liên quan đến hệ thần
kinh [31], [41].
Ở thực vật, cysteine proteinase đƣợc tìm thấy chủ yếu trong khơng bào và
thành tế bào, và vẫn chƣa rõ liệu cysteine proteinase trong lục lạp có liên quan đến
q trình thối hóa protein trong lục lạp [31]. Lindhal (1995) chỉ ra rằng cysteine

liên quan đến màng thylakoid chịu trách nhiệm cho sự phân hủy trung tâm phản ứng
của hệ thống quang hóa II ở cây rau Bina [36]. Cysteine proteinase cịn đƣợc tìm
thấy trong môi trƣờng ngoại bào [41].
1.5.2. Cystatin chất ức chế cysteine proteinase
Cystatin là protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase. Các protein này
có liên quan về cấu trúc và chức năng với cysteine proteinase [42]. Cystatin tồn tại
trong vi sinh vật, động vật [27] và thực vật [52], [22]. Cystatin đƣợc mơ tả lần đầu
tiên ở lịng trắng trứng gà và sau đó đƣợc gọi là cystatin lịng trắng trứng [27].
Các cystatin mối liên quan về mặt tiến hóa và tạo thành “siêu họ cystatin”.
Cystatin đƣợc chia thành bốn họ nhỏ là stefin, cystatin, kininogen và phytocystatin.
Các họ này khác nhau về trình tự tƣơng đồng của các axit amin, số lƣợng liên kết
disunfide và khối lƣợng phân tử của protein [24], [31], [41].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




16
Cystatin họ 1, cịn gọi là stefin, khơng chứa liên kết disulfide hoặc nhóm
carbonhydrate trong thành phần cấu tạo. Stefin có khối lƣợng phân tử khoảng
11kDa, gồm khoảng 100 gốc axit amin [31].
Cystatin họ 2, còn gọi là cystatin, chứa khoảng 120 - 126 axit amin, khối
lƣợng phân tử khoảng 13,4 - 14,4 kDa. Cystatin họ 2 chứa 4 gốc cysteine đƣợc bảo
tồn tạo thành hai liên kết disulfide và hầu hết khơng đƣợc glycosyl hóa [31].
Cystatin họ 3, cịn gọi là kininogen, là họ cystatin lớn hơn so với hai họ cịn
lại, có khối lƣợng phân tử khoảng 60 - 120 kDa [45]. Kininogen gồm khoảng 355
axit amin, chứa các cầu nối disulfide và đƣợc glycosyl hóa. Kininogen có chức năng
quan trọng trong q trình đơng máu [41].
Hầu hết các cystatin họ 1 và họ 3 đều chứa pentapeptide Gln-Val-Val-AlaGly và trình tự tƣơng đồng Gln-X-Val-Y-Gly ở các cystatin họ 2 [25]. Trình tự PheAla-Val đƣợc định vị gần đầu C và dipeptide Pro-Trp ở gần đầu N, là trình tự bảo

thủ của cystatin họ 2 nhƣng khơng tìm thấy ở cystatin họ 1 và họ 3. Vùng
pentapeptide và dipeptide có vai trị quan trọng trong việc gắn kết với cysteine
proteinase [45].
Cystatin họ 4 (còn gọi là phytocystatin) [45], [46] gồm hầu hết các chất ức
chế cysteine proteinase của thực vật [22], [40]. Phytocystatin có độ tƣơng đồng cao
với các thành viên của họ cystatin, nhƣng không chứa cầu nối disulfide và các gốc
cysteine giống stefin [48].
Phytocystatin đƣợc tìm thấy ở thực vật một lá mầm nhƣ lúa [22], ngô [40] và
thực vật hai lá mầm nhƣ đậu tƣơng [64], cây dẻ [42]...
Phytocystatin là chất ức chế mạnh của cysteine proteinases (hay CPs
proteinase) ở thực vật [39]. Cystatin đóng vai trò nhƣ cơ chất để xâm nhập vào
trung tâm hoạt động của enzyme cysteine proteinase và ngăn chặn sự đi vào của các
cơ chất protein khác. Về cấu trúc, phytocystatin là chất ức chế cạnh tranh thuộc họ
enzyme phân hủy (hay Cys protease). Phytocysatatin gồm có các vùng bảo thủ cao
sau: gốc Gly ở gần đầu N, vùng trung tâm Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly (Xaa là axit amin
bất kỳ) và cấu trúc kẹp tóc Pro-Trp bậc 2 gần đầu C [31]. Các vùng bảo thủ cao này

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên