Nghiên cứu nhân giống in vitro cây khôi nhung (ardisia sylvestris pitard)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG


TRÀ THANH LIN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY KHƠI NHUNG
(ARDISIA SYLVESTRIS PITARD)

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

Đà Nẵng- 2021


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG


TRÀ THANH LIN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY KHƠI NHUNG
(ARDISIA SYLVESTRIS PITARD)

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số: 7420201
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
Giảng viên hướng dẫn: TS. Võ Châu Tuấn

Đà Nẵng - 2021


LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các dữ liệu trình bày trong
khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả nghiên cứu của tôi và chưa từng được công bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác trước đây. Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm nếu vi phạm
bất kì quy định nào về đạo đức khoa học.

Tác giả

Trà Thanh Lin

i


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn
quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư
phạm – Đại học Đà Nẵng.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Châu Tuấn – thầy giáo đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt q trình tơi thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Sinh – Môi trường đã giúp
đỡ, động viên tơi trong suốt q trình tơi thực hiện đề tài khố luận của mình.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã ln động viên,
khích lệ tơi cả về vật chất lẫn tinh thần để tơi có thể đạt được kết quả tốt nhất.

Đà Nẵng, tháng 05 năm 2021

Sinh viên thực hiện

Trà Thanh Lin

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................ vii
TĨM TẮT ........................................................................................................................ viii
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................................2
3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học ..........................................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn...........................................................................................................2
4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4
1.1. Giới thiệu về cây Khôi nhung .......................................................................................4
1.1.1. Đặc điểm sinh thái .....................................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm sinh học ......................................................................................................4
1.1.3. Giá trị dược liệu .........................................................................................................5
1.1.4. Sự tạo mô sẹo .............................................................................................................5
1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến nhân giống in vitro thực vật ..........6
1.2.1. Điều kiện nuôi cấy .....................................................................................................6
1.2.2. Môi trường nuôi cấy ..................................................................................................6

1.3. Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro các loài thuộc chi Ardisia, họ Đơn nem ........9
1.3.1. Nghiên cứu trên thế giới ............................................................................................9
1.3.2. Nghiên cứu trong nước ............................................................................................10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............11
iii


2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................11
2.2. Nguyên liệu nghiên cứu ..............................................................................................11
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................11
2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu vật ..............................................................................12
2.3.2. Phương pháp tái sinh chồi in vitro từ mẫu thân .......................................................12
2.3.3. Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro ....................................................................13
2.3.4. Phương pháp tạo rễ in vitro – Tạo cây in vitro hồn chỉnh .....................................13
2.3.5. Phương pháp xử lí thống kê .....................................................................................13
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................14
3.1. Đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu vật .........................................................................14
3.2. Ảnh hưởng của TDZ và IBA đến khả năng tạo chồi in vitro từ callus mẫu thân khôi
nhung..................................................................................................................................15
3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro khôi nhung .................17
3.4. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro cây khôi nhung ...........................20
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................................23
1. Kết luận ........................................................................................................................23
2. Đề nghị ...........................................................................................................................23
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................24
PHỤ LỤC...........................................................................................................................26

iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BA

: 6-benzyl adenine

BAP

: 6-benzylaminopurine

Cs

: Cộng sự

NAA

: 1-Naphthaleneacetic acid

ĐHST : Điều hòa sinh trưởng
IBA

: Indole 3-butyric acid

L

: Lít

MS

: Murashige và Skoog (1962)

TDZ

: Thidiazuron

v


DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Ảnh hưởng thời gian khử trùng bằng NaClO 5% đến hiệu quả
khử trùng mẫu thân cây khôi nhung sau 4 tuần nuôi cấy.

14

3.2

Ảnh hưởng của TDZ và IBA đến khả năng phát sinh chồi in
vitro từ callus mẫu thân cây khôi nhung sau 6 tuần nuôi cấy.

16

3.3

3.4

Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro từ
callus sau 10 tuần nuôi cấy.
Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro sau 4 tuần
nuôi cấy.

vi

18

20


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số hiệu
hình
1.1

Tên hình
Thân, hoa và quả cây khơi nhung ngồi tự nhiên tại khu Bảo
tồn thiên nhiên Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng.

Trang

5

2.1

Cây khơi nhung ngồi tự nhiên và mẫu thân.

11

2.2

Sơ đồ quy trình nghiên cứu.

12

3.1

Chồi in vitro tái sinh từ callus trên các môi trường sau 6 tuần
nuôi cấy.

17

3.2

Cụm chồi in vitro từ callus trên các môi trường sau 10 tuần
nuôi cấy.

18

3.3

Chồi tạo rễ in vitro của cây khôi nhung sau 4 tuần nuôi cấy.

21

vii


TĨM TẮT
Khơi nhung có tên khoa học là Ardisia silvestris Pitard, thuộc chi Ardisia họ
Myrsinaceae, là một loại thảo dược quý, lá của cây khôi nhung được sử dụng rộng rãi như
một loại dược liệu có tác dụng trong việc điều trị dạ dày tá tràng, làm giảm bớt ợ chua,
nóng rát vùng thượng vị, kích thích lên da non và làm lành dạ dày, tá tràng. Thực trạng
hiện nay cho thấy nhu cầu sử dụng lá của cây khôi nhung ngày càng tăng dẫn đến hiện
tượng khai thác quá mức làm cho số lượng cây trong tự nhiên giảm nhanh. Mặc dù cây
khơi nhung có khu phân bố rộng, nhưng số lượng cá thể ít do khả năng tái sinh hạt kém và
bị khai thác làm dược liệu với số lượng lớn nên mất nguồn hạt để tái sinh. Nghiên cứu nhân
giống in vitro cây khôi nhung bằng phương pháp nuôi cấy in vitro nhằm tạo được số lượng
cây lớn trong thời gian ngắn là việc làm thật sự cần thiết.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra, khử trùng mẫu thân cây khôi nhung bằng ethanol 70%
trong 1 phút, sau đó khử trùng bằng dung dịch NaClO 5% trong 8 phút cho hiệu quả khử
trùng tốt nhất, nuôi cấy mẫu thân trên môi trường MS đã cho tỷ lệ mẫu phát sinh callus là
54,33% sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 0,25
mg/L TDZ + 0,5 mg/L IBA là mơi trường thích hợp để hình thành chồi in vitro từ callus
thân cây khơi nhung, với tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 55,55%, sau 6 tuần ni cấy. Mơi trường
MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 1 mg/L BAP là mơi trường thích hợp để nhân
nhanh chồi in vitro của cây khôi nhung, với tỷ lệ mẫu phát sinh cụm chồi là 91,10%, hệ số
nhân chồi đạt 8,2 chồi/mẫu, chiều cao đạt 5,42cm sau 10 tuần ni cấy. Mơi trường MS có
3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 0,7 mg/L NAA thích hợp để tạo rễ in vitro. Sau 4 tuần
nuôi cấy, tỷ lệ ra rễ là 100% đạt (4,64 rễ/chồi, chiều dài 5,2 cm/rễ).

viii

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Khơi nhung có tên khoa học là Ardisia silvestris Pitard, thuộc chi Ardisia họ
Myrsinaceae, (Lý Đức Long, 2020). Cây mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía bắc và một
số tỉnh miền Trung như: Lào Cai (Sapa), Lạng Sơn (Hữu Lũng), Quảng Ninh, Vĩnh phúc
(Tam Đảo), Hà Tây (Ba Vì), Ninh Bình (Cúc Phương), Hịa Bình, Thanh Hóa (Lang Chánh,
Ngọc Lạc, Thạch Thành), Nghệ An (Quì Châu), Quảng Trị, Thừa Thiên Huế (Phú Lộc),
Quảng Nam – Đà Nẵng. Ngồi ra cây cịn phân bố ở Trung Quốc (Hải Nam, Quảng Tây),
(Lý Đức Long, 2020). Lá của cây khôi nhung được sử dụng rộng rãi như một loại dược
liệu có tác dụng trong việc điều trị dạ dày tá tràng, làm giảm bớt ợ chua, nóng rát vùng
thượng vị, kích thích lên da non và làm lành dạ dày, tá tràng, (Phạm Bá Tuyến, 2014). Các
nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lá cây khơi nhung cịn có tác dụng chống oxy hóa và chống
tăng sinh tế bào in vitro, tác dụng kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư, (Lê Anh Sơn,
2017).
Hiện nay, nhu cầu sử dụng cây khôi nhung làm thuốc ngày càng tăng, dẫn đến việc
khai thác quá mức, làm cây trong tự nhiên suy giảm nhanh chóng. Mặc dù cây khôi nhung
phân bố rộng, nhưng số lượng cá thể ít do khả năng tái sinh từ hạt kém và cây trưởng thành
bị khai thác làm dược liệu với số lượng lớn nên mất nguồn hạt để tái sinh. Mặt khác, rừng
tự nhiên ngày càng thu hẹp, làm mất các sinh cảnh sống thích hợp, cây khơi nhung đang bị
rơi vào tình trạng nguy cấp, đe dọa tuyệt chủng và đã đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996,
2007) với cấp V, “sẽ nguy cấp” và được khuyến cáo “chỉ khai thác có mức độ và giữ lại
những cây con chưa đến tuổi thu hái. Cấm khai thác loài này trong các vườn quốc gia, có
thể tổ chức gây trồng để lấy nguyên liệu làm thuốc”.
Khu Bảo tồn Thiên nhiên Sơn Trà, Đà Nẵng có hệ động, thực vật rất đa dạng và
phong phú. Hệ thực vật ở Sơn Trà có tính đa dạng cao về họ, chi, lồi. Tuy trong một diện
tích nhỏ (chỉ chiếm 0,014% diện tích của cả nước) nhưng số họ thực vật chiếm 37,83%
tổng số họ thực vật của Việt Nam, số chi chiếm 19,13% tổng số chi của Việt Nam, số loài
chiếm 9,37% số lồi của của Việt Nam. Đặc biệt có đến 329 loài cây dược liệu thuộc 253
chi, 108 họ của 5 ngành thực vật bậc cao có mạch, một số lồi có thể khai thác được là

Bách bộ, Thiên mơn, Mãn kinh tử, Sầu đâu rừng.Ngồi ra cịn một số lồi cây thuốc có giá
trị khác như: Ngũ gia bì, Khơi nhung, Kim ngân nhưng với số lượng cá thể không nhiều.
Khôi nhung, được xem là một cây thuốc quý ở khu Bảo tồn Thiên nhiên Sơn Trà-Đà
Nẵng, cần nhanh chóng bảo vệ và phát triển nguồn gen loài cây này tại đây. Theo nghiên
cứu của (Lê Viết Mạnh, 2018), số lượng cây khơi nhung tại Bán đảo Sơn Trà cịn lại là
1


tương đối thấp; cây tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt nhưng tỉ lệ hạt nảy mầm rất thấp (chỉ
đạt 18%). Vì vậy, vấn đề đặt ra là cần phải có giải pháp hiệu quả trong phát triển nguồn
cây giống và gây trồng loại cây này trong tự nhiên. Nhiều kết quả nghiên cứu và ứng dụng
cho thấy, kỹ thuật nhân giống in vitro được xem là phương pháp hữu hiệu trong bảo tồn và
nhân nhanh giống nhiều loài cây thuốc quý, nó cho phép sản xuất với số lượng cây giống
lớn, chất lượng đồng đều, sạch bệnh trong thời gian rất ngắn, giải quyết các hạn chế trong
phương pháp nhân giống truyền thống (nhân giống bằng hạt). Kỹ thuật này khơng những
giải quyết được những vấn đề khó khăn đang gặp phải trong việc bảo tồn và nhân giống
cây khôi nhung tại Bán đảo Sơn Trà –Đà Nẵng mà còn giúp chủ động sản xuất lượng lớn
cây giống có chất lượng cao, tạo nền tảng vững chắc để sản xuất nguồn dược liệu khôi
nhung ở nước ta.
Xuất phát từ các cơ sở trên đây, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống
in vitro cây khôi nhung (Ardisia sylvestris Pitard)”.
2. Mục tiêu đề tài
Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây khơi nhung với hệ số nhân giống
cao, chất lượng cây tốt.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về nhân giống in vitro cây khôi nhung có
nguồn gốc từ Bán đảo Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng, góp phần làm phong phú hơn cơ sở
dữ liệu về quy trình kỹ thuật nhân giống cây khơi nhung tại Việt Nam.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở tốt cho sản xuất nhanh cây giống khơi
nhung, góp phần bảo tồn và phát triền bền vững nguồn gen cây thuốc tại Bán đảo Sơn TràĐà Nẵng
Góp phần đưa cây khơi nhung trồng sản xuất trên quy mơ hàng hóa tại nhiều vùng
sinh thái ở khu vực miền Trung và Tây Nguyên.
4. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát các điều kiện khử trùng mẫu vật khôi nhung, tạo nguyên liệu in vitro khởi
đầu.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh chồi in vitro
cây khôi nhung.
2


- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
cây khôi nhung.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo rễ in vitro, tạo cây
khôi nhung in vitro hoàn hỉnh.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây Khơi nhung
1.1.1. Đặc điểm sinh thái
Khơi nhung có tên khoa học là Ardisia silvestris Pitard, thuộc chi Ardisia họ
Myrsinaceae, tên tiếng Việt là Khơi tía, Cơm nguội rừng, lá khơi tía, Đơn tướng qn, (Lý
Đức Long, 2020). Khơi nhung được liệt kê trong Sách Đỏ Việt Nam (1996, 2007) với cấp
đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) và khuyến cáo “chỉ khai thác có mức độ và giữ lại những cây
con chưa đến tuổi thu hái. Cấm khai thác loài này trong các Vườn quốc gia. Có thể tổ chức
gây trồng để lấy ngun liệu làm thuốc”.

Khơi nhung là lồi cây ưa ẩm và ưa bóng thường mọc ở khu vực ven suối (có độ cao
từ 300 – 600 m), chủ yếu là trạng thái rừng IIa, nhiệt độ 20 – 24°C, độ ẩm 81 - 84%, tổng
lượng mưa/năm từ 1.195,6 mm - 1.648,9 mm, độ che sáng từ 50 – 70%. Đất nơi khơi nhung
phân bố có màu từ xám nhạt đến xám đen, tầng đất mặt rất tơi xốp, nhiều mùn. Ở nước ta,
Khôi nhung phân bố ở Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc,
Hà Nội, Hịa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, từ Nghệ An vào tới Quảng Nam và Đà Nẵng,
(Lý Đức Long, 2020).
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Khôi nhung là cây thân gỗ nhỏ, cao 0,5-2,0 m, thân khơng có lơng, có thân rễ bị,
rỗng xốp, có vỏ màu xám, ít phân nhánh hay khơng phân nhánh, gần trên ngọn có nhiều
lá. Lá mọc so le, phiến lá thon ngược, dài đến 25-40 × 6-12 cm, đầu nhọn hoặc tù, giảm
dần và men xuống gốc, đáy từ từ hẹp thành cuống có cánh, màu lục sẫm ở trên, nhạt màu
hơn ở dưới hoặc có màu đỏ tím, bìa có răng nhọn mịn, đều nhau; có lơng màu nâu trên các
gân, nhiều hơn ở mặt dưới, gân bên 28-35 đơi, gân cấp 3 hình mạng nổi rõ ở mặt dưới, (Lê
Viết Mạnh, 2018).
Thời gian ra hoa vào tháng 4 – 7. Hoa mọc thành chùm, dài 10-15 cm, hoa rất nhỏ,
chùm kép ngoài nách lá, cọng hoa 10-12 mm, lá đài cao 1,5 mm, cánh hoa 3 mm, màu
trắng pha hồng tím 5 lá đài 5 cánh hoa. Lá đài hình tam giác hoặc thn, nhọn, hợp ngắn
ở gốc, có điểm tuyến và lơng mi. Cánh hoa màu hồng, hình mác, dài 3 mm, đầu tù hoặc
nhọn, có điểm tuyến. Nhị ngắn hơn cánh hoa, bao phấn hình mác nhọn, chỉ nhị rất ngắn.
(Lê Viết Mạnh, 2018).
Bầu hình trứng, vịi mảnh, đầu nhụy hình chấm (Lê Viết Mạnh, 2018).
Quả mọng, hình cầu, khi chín màu đỏ, có điểm tuyến, đường kính 7-8 mm. Hạt đơn,
hình cầu, lõm ở gốc. Tái sinh bằng hạt và chồi. Có quả tháng 9-12 và 1-2 năm sau, (Lê Viết
4


Mạnh, 2018).

Hình 1.1. Thân, hoa và quả cây khơi nhung ngoài tự nhiên tại khu Bảo tồn thiên nhiên

Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng (Lê Viết Mạnh, 2018).
(A). Thân cây khôi nhung, (B). Hoa cây khôi nhung, (C). Quả cây khôi nhung.
1.1.3. Giá trị dược liệu
Theo tài liệu y học cổ truyền, trong lá khơi nhung có thành phần chủ yếu là tannin,
các glycosid có tác dụng trung hịa, làm giảm sự gia tăng acid của dạ dày, chống viêm giảm
đau, đặc biệt có tác dụng làm se vết loét, kích thích lên da non và làm lành vết thương trong
đường tiêu hóa. Khơi nhung được dùng để điều trị bệnh viêm loét dạ dày tá tràng, làm giảm
ợ hơi, ợ chua, nóng rát vùng thượng vị (Quỹ Châu Á, 2012).
Ngoài việc sử dụng trong điều trị bệnh đau dạ dày, lá khôi nhung thường được dùng
kết hợp với Bồ Công Anh, Khổ Sâm, Cam Thảo tạo thành những bài thuốc nam nhằm điều
trị một số chứng bệnh như: kém ăn, trướng bụng, thể trạng yếu, mệt mỏi (Phạm Bá Tuyến,
2014). Bài thuốc nam có chứa thành phần từ lá Khơi cịn được dùng điều trị những cơn đau
vùng thượng vị, đau từng cơn, đau lan ra hai bên sườn, đau xun ra sau lung. Lá khơi
nhung đặc biệt có tác dụng mạnh mẽ trong điều trị bệnh đau dạ dày, dùng cho những bệnh
nhân bị viêm loét dạ dày tá tràng.
1.1.4. Sự tạo mô sẹo
Trong nuôi cấy in vitro, mơ sẹo là đám tế bào khơng phân hóa, có đặc tính phân chia
mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong q trình tạo cơ quan. Do đó, các phần
non của cơ thể thực vật dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của
một auxin mạnh (như 2,4-D) được áp dụng riêng rẽ hay kết hợp với auxin khác hay với
cytokinin. Ngược lại những mảnh cơ quan trưởng thành thường khơng có khả năng tạo mới
cơ quan, cũng như khơng có khả năng tạo mô sẹo (Bùi Việt Trang, 2000).
Sự tạo mô sẹo in vitro, nhờ auxin, thuộc về một trong ba quá trình (Bùi Việt Trang,
2000):
5


Sự phản phân hóa của tế bào nhu mơ (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan): nhu mô mộc
và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
Sự phân chia của tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe-mộc). Các tế bào tượng tầng

của phần lớn dicot dễ phân chia dưới tác động của auxin, thậm chí khơng cần auxin ngoại
sinh như ở các cây cỏ hay dây leo.
Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Quá trình này được ưu tiên
áp dụng ở monocot, vì các cây này khơng có tượng tầng điển hình như các cây dicot, và
các tế bào nhu mơ khó phản phân hóa (so với dicot)
Sự tạo mơ sẹo liên quan đến tình trạng sinh lý của mơ cấy, liên quan tới việc sử dụng
auxin riêng lẻ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ của auxin (Bùi Việt Trang,
2000).
1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến nhân giống in vitro thực vật
1.2.1. Điều kiện nuôi cấy
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó là ánh
sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
+ Ánh sáng
Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh
sáng và chất lượng ánh sáng. Với đa số các lồi cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8 –
12h/ngày. Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mơ ni cấy.
Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mơ sẹo trong khi cường độ thấp gây nên
sự tạo chồi (Ammirato, 1990). Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất
lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy. Nhìn
chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mơ ni cấy là từ 2000 – 4000 lux. Trong phịng
thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 – 3000 lux.
+ Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp ni cấy mô 20 – 27°C. Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh
trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hơ hấp hay hình thành tế
bào và cơ quan.
+ Độ ẩm
Trong các bình ni cấy thì độ ẩm tương đối ln bằng 100% nên ta không cần phải
quan tâm nhiều đến độ ẩm khi ni cấy mơ (Lê Văn Hồng, 2008).
1.2.2. Mơi trường ni cấy
Chất dinh dưỡng được cung cấp cho tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro lấy từ môi

6


trường nuôi cấy. Thành phần cấu tạo nên môi trường ni cấy được chia thành 4 nhóm:
nước cất (95%), mơi trường cơ bản bao gồm nguồn cacbon và chất khoáng, chất điều hoà
sinh trưởng và các chất khác như agar, agarose.Vì vậy, vấn đề việc lựa chọn mơi trường
thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy
mô rất quan trọng.
Sự sinh trưởng và phân chia của tế bào thực vật bị tác động mạnh mẽ bởi sự điều
chỉnh của nguồn Cacbon, Photphat, Nitơ và các chất điều hoà sinh trưởng (Eibl, 2009).
+ Nguồn Cacbon
Các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người
ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất cacbon nhất định để cung cấp năng nượng
cho tế bào và mơ (Lê Văn Hồng, 2008). Thơng thường, saccharose (2 –5%) được sử dụng
phổ biến nhất trong nuôi cấy mô thực vật. Saccharose sẽ được enzyme ngoại bào thuỷ phần
tạo ra các đường đơn là glucose và fructose trong q trình ni cấy (Eibl, 2009).
+ Nguồn Nitơ
Nhu cầu nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô. Thông thường, nguồn
nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4+ và NO3-. Trong đó, việc hấp thụ NO3của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4+. Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện
tượng “kiềm hóa” mơi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả hai nguồn nitơ với tỷ
lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất.
+ Nguồn Photphat
Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó tham gia vào việc vận
chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng.
Trong môi trường nuôi cấy, photpho được cung cấp dưới dạng mono hay
dihydrogenphosphate potasium hay sodium.
Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi
cấy in vitro. Đây là môi trường giàu dinh dưỡng, gồm các khoáng đa lượng, vi lượng cần
thiết cho sự phát triển của cây. Các nguyên tố đa lượng: bao gồm sáu nguyên tố: nitơ (N),
phốt pho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S), tồn tại dưới dạng muối

khống, là thành phần của các mơi trường dinh dưỡng khác nhau, được sử dụng ở nồng độ
trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Mơi trường ni cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/l nitrate và
kali. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng
1 – 3 mmol/l (Lê Văn Hồng, 2008). Nhóm ngun tố vi lượng: Fe, Cu, Bo, Zn, Mn, Co,
I…là các nguyên tố rất quan trọng cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai
trị quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều
so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây
7


Nói chung, nồng độ thường được sử dụng đối với Cu và Co là 0,1 µmol/L, Fe và Mo là 1
µmol/L, I là 5 µmol/L, Zn là 5 – 30 µmol/L, Mn là 20 – 90 µmol/L được bổ sung vào môi
trường nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm (Lê Văn Hồng, 2008).
+ Các vitamin
Mặc dù cây ni cấy mơ có thể tự tổng hợp được vitamin, nhưng khơng đủ cho nhu
cầu của cây. Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin nhóm B được bổ sung vào
môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các vitamin
inositol, B1 (thiamin) và B6 (pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong
môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1 – 10 mg/l. Linsmaier và Skoog đã khẳng
định vitamin B1 là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào và rất quan trọng
đối với nuôi cấy mô sau khi nghiên cứu kĩ lưỡng sự có mặt của nó trong mơi trường MS.
+ Dung dịch hữu cơ
Có thành phần khơng xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men0...được bổ sung
vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mơ sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã
được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1994. Trong nước dừa thường chứa các acid amine,
acid hữu cơ, đường, ARN và DNA. Đặc biệt trong nước dừa cịn có chứa những hợp chất
quan trọng cho nuôi cấy mô như: myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính auxine, các gluxid
của cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Chất làm thay đổi trạng thái môi trường
Agar (thạch) là một loại polysacharid của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6 –

12g/l. Độ thống khí của mơi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi
cấy. Nồng độ thạch dao động trong khoảng 6 – 10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy (Nguyễn
Văn Uyển, 1993).
+ Các chất điều hoà sinh trưởng
Các phytohormon là những chất có tác dụng điều hồ sinh trưởng ở thực vật. Các
phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: auxine, cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid.
Sự phối hợp hay lựa chọn nồng độ các chất kích thích sinh trưởng sẽ là yếu tố quyết định
đến sự thành cơng của q trình ni cấy. Auxin có vai trị kích thích sự tăng trưởng và
kéo dài tế bào. Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào…Đặc điểm chung của các
auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như:
tăng trưởng chiều dài thân, long (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và
phân hóa mạch dẫn. Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi…Trong
mơi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mơ sẹo
hoặc từ các cơ quan, gây tạo phơi vơ tính, tăng cường phát sinh chồi phụ. Gibberellin đóng
vai trị quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi,
8


sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật. ABA thuộc nhóm
các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm
của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng. ABA cịn có tác dụng tăng cường khả năng chống
chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi (Lê Văn Hồng, 2008).
1.3. Những nghiên cứu về ni cấy in vitro các loài thuộc chi Ardisia, họ Đơn nem
1.3.1. Nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, các nghiên cứu về cây khôi nhung trên thế giới chưa nhiều, tập trung chủ
yếu trong lĩnh vực hóa sinh, phân tích thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học của lồi.
Các nghiên cứu in vitro cũng được tìm thấy trong các lồi thuộc chi Ardisia, họ Đơn nem.
Năm 2009, Ma và cs đã tiến hành nghiên cứu tái sinh in vitro cây A. crenata. Kết quả
cho thấy, môi trường nuôi cấy tốt nhất để cảm ứng chồi nách, lấy đoạn thân của A. crenata
làm mẫu cấy là MS + 0,5 mg/L 6-BA + 0,1 mg/L NAA, môi trường tốt nhất để nhân nhanh

chồi là MS + 2,0 mg/L 6-BA + 0,1 mg/L NAA + 0,5 mg/L KT. Môi trường tốt nhất để tạo
rễ là 1/2MS + 0,2 mg/L IBA. Sự phát sinh rễ, tỷ lệ rễ và số lượng rễ có thể được thúc đẩy
bằng cách thêm 0,2% than hoạt tính, các cơ chất thích hợp nhất cho ra cây là cát sơng-đá
perlite-đá vermiculite (1:1:1) hoặc đá perlite-đá vermiculite (1:1), với hơn 80% cây A.
crenata in vitro có rễ sống sót.
Năm 2015, Chen và cs đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhân giống A.
mamillata bằng ni cấy mơ và thiết lập một hệ thống sản xuất công nghiệp để cung cấp
nhiều cây giống cho nhu cầu của con người. Môi trường tạo nguyên liệu khởi đầu tối ưu là
MS + 2 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA + 30 g/L đường, tỷ lệ mẫu đạt 76,4%. Môi trường tái
sinh chồi tối ưu là MS + 1 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA + 30 g/L đường, hệ số nhân chồi
đạt 4,56 lần, chiều cao chồi đạt 3,10 cm. Môi trường ra rễ tối ưu là ½ MS + 0,1 mg/L IBA
+ 15 g/L đường, tỷ lệ ra rễ 99,7%, dài 7,53 cm.
Sun và cs (2017) đã tiến hành nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy và nhân giống
in vitro cây A. violacea thông qua nuôi cấy đoạn thân. Môi trường cảm ứng chồi tối ưu là
MS + 0,8 mg/L KT + 0,1 mg/L NAA + 0,1 mg/L IBA, tỷ lệ nảy chồi của chồi nách đạt
92,60%. Môi trường nhân nhanh chồi tối ưu là MS + 0,5 mg/L TDZ + 0,1 mg/L NAA, và
hệ số nhân đạt 8,60. Môi trường cấy chuyền tối ưu là MS + 1,0 mg/L KT + 0,5 mg/L NAA.
Môi trường tạo rễ tối ưu là ½ MS + 2,0 mg/L IBA + 1,0 mg/L NAA + 1,0 mg/L than hoạt
tính và tỷ lệ ra rễ đạt 98,70%. Sử dụng cơ chất Vỏ thông:Than bùn (2:1,v/v) tỷ lệ sống sót
khi ra cây có thể đạt 85,30%.
Năm 2019, Tang và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây A. gigantifolia thông
qua nuôi cấy đoạn thân, Kết quả cho thấy, môi trường nuôi cấy MS + 1,0 mg/L 6-BA + 0,2
mg/L NAA và MS + 0,5 mg/L ZT có ảnh hưởng đáng kể đến sự cảm ứng chồi nách, tỷ lệ
9


cảm ứng tạo chồi là 89,3% và 85,7%. Môi trường ni cấy tốt nhất cho q trình nhân
nhanh chồi là MS + 0,5 mg/L 6-BA + 0,1 mg/L ZT + 0,1 mg/L NAA, và hệ số nhân nhanh
là 4,3. Môi trường tối ưu để tạo rễ là ½ MS + 1,5 mg/L IAA + 1,0 mg/L NAA, tỷ lệ ra rễ
đạt 92,3%. Rễ phát triển tốt và cây con phát triển mạnh mẽ. Cây con được cấy vào đất

vườn: đất than bùn: đá trân châu = 3: 1: 1 (v / v / v), và 82% cây có rễ sống sót.
1.3.2. Nghiên cứu trong nước
Các nghiên cứu về nhân giống cây khôi nhung trong thời gian qua đã ghi nhận được
nhiều kết quả tích cực. Năm 2009, Nguyễn Đình Ưng và cs đã tiến hành nghiên cứu nhân
giống bằng hom và trồng thử nghiệm cây khôi nhung tại Vườn Quốc gia Bái Tử. Kết quả
đã nhân giống được 4.000 cây khơi nhung và xây dựng thành cơng mơ hình trồng thử
nghiệm cây khơi nhung trên diện tích 1 ha, tỷ lệ sống đạt 92,5%, chiều cao cây trung bình
đạt 99,6 cm, đường kính gốc 2,6 cm. Đồng thời nhóm thực hiện đề tài cũng đã xây dựng
được bản hướng dẫn kỹ thuật nhân giống và trồng cây khôi nhung. Kết quả thu được của
đề tài đã góp phần bảo tồn nguồn gen loài cây dược liệu quý này tại Vườn Quốc gia Bái
Tử Long.
Năm 2016, Nguyễn Văn Việt và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây khôi nhung
thông qua nuôi cấy đoạn thân. Môi trường tối ưu để cảm ứng tạo cụm chồi từ mắt ngủ là
MS + TDZ 0,2 mg/L và NAA 0,5 mg/L. Môi trường tối ưu để tái sinh cây từ cụm chồi in
vitro là MS + BAP 1,5 mg/L + NAA 0,5 mg/L. Môi trường tối ưu cho ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh là ½ MS + 1 mg/L IBA. Đoàn Thị Thu Hương và cs (2019) đã nghiên cứu quy trình
nhân giống in vitro cây khơi nhung có nguồn gốc ở Thái Ngun. Kết quả cho thấy, phương
pháp tối ưu để khử trùng chồi được ngâm trong ethanol 70% trong 1 phút, bằng HgCl 2
dung dịch 0,1% trong 8 phút và nuôi cấy trên môi trường MS với 0,2 mg/L BAP, tỷ lệ mẫu
sống đạt được là 80,92%, MS bổ sung 1 mg/L BAP, 0,3 mg/L kinetin, 0,2 mg/L NAA,
sucrose 30 g/L và agar 7 g/L, tỷ lệ mẫu tạo chồi là 99,31%, chiều cao chồi 3,7 cm và nhân
lên 9,13 lần/chu kỳ sau 4 tuần. Môi trường MS chứa 0,5 mg/L NAA, sucrose 20 g/L và
agar 7g/L phù hợp cho tạo rễ, 97,63% chồi tạo rễ. Số lượng và chiều dài rễ tương ứng là
4,45 và 3,25 cm. Các cây con in vitro được thích nghi sau 8 tuần ni trong hỗn hợp đất
và cát.

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Cây khơi nhung, có tên khoa học là Ardisia silvestris Pitard, thuộc chi Ardisia họ
Myrsinaceae.
2.2. Ngun liệu nghiên cứu
- Thân của cây khơi nhung ngồi tự nhiên (cây cao khoảng 1 - 1,5 m, đã ra hoa) được
thu từ khu Bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà, Đà Nẵng dùng làm nguyên liệu để nuôi cấy in
vitro, quá trình thu mẫu dựa theo các tọa độ đã được (Lê Viết Mạnh, 2018) khảo sát:
+ Tọa độ: 16°6’58”B / 108°17’9”Đ.
+ Tọa độ: 0205922/1785960.
+ Tọa độ: 0207668/1784707.

Hình 2.1. Cây khơi nhung ngồi tự nhiên tại khu Bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà, thành phố
Đà Nẵng và mẫu thân.
(A).Cây khôi nhung tự nhiên, (B).Mẫu thân cây khôi nhung.
- Nghiên cứu được tiến hành tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ nuôi cấy mô và tế bào
thực vật, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng từ tháng
5/2020 đến 05/2021.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
.
11


Hình 2.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu vật
Thân cây khôi nhung thu về, cắt thành các đoạn ngắn và rửa sạch dưới vòi nước máy
chảy trong 60 phút. Sau đó ngâm mẫu đoạn thân trong dung dịch xà phịng lỗng khoảng
25-30 phút, rửa sạch lại dưới vòi nước chảy khoảng 15 phút.
Sau khi được khử trùng sơ bộ, đoạn thân được khử trùng trong tủ cấy vô trùng. Đoạn
thân được cắt thành các đoạn mẫu ngắn (dài khoảng 5 cm). Khử trùng đoạn thân bằng

ethanol 70% trong 1 phút, sau đó khử trùng bằng Javen 5% ở các khoảng thời gian khác
nhau: 4-10 phút, mẫu được rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng khoảng 3 lần.
Mẫu đoạn thân sau khi khử trùng được cắt thành các lát mỏng khoảng 1mm và nuôi
cấy trên mơi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar, pH = 5,8. Đánh giá hiệu quả khử
trùng mẫu qua các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần nuôi
cấy.
2.3.2. Phương pháp tái sinh chồi in vitro từ mẫu thân
Mẫu được cấy chuyển sang mơi trường MS có bổ sung 3% saccharose; 0,8% agar;
TDZ ( 0,25 mg/L; 0,5 mg/L và 1 mg/L) phối hợp với IBA ( 0,5 mg/L; 0,7 mg/L và 1 mg/L).
Đánh giá hiệu quả phát sinh chồi sau 6 tuần nuôi cấy thông qua các thông số: tỷ lệ mẫu
phát sinh chồi (%), đặc điểm hình thái của chồi, thời gian bắt đầu phát sinh chồi.
12


2.3.3. Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro
Các mẫu chồi in vitro được phát sinh trên môi trường tái sinh chồi tốt nhất (6 tuần
tuổi) được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 3% saccharose; 0,8% agar, pH=5,8;
bổ sung 0,5 – 2 mg/L BAP để nhân nhanh chồi. Đánh giá khả năng nhân nhanh chồi in
vitro thông qua các chỉ tiêu: số chồi/mẫu, chiều cao chồi, số lá/chồi sau 10 tuần nuôi cấy.
2.3.4. Phương pháp tạo rễ in vitro – Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Các chồi in vitro ( dài khoảng 3 cm) tách từ cụm chồi in vitro (10 tuần tuổi) được
nuôi cấy trên các môi trường: MS có 3% saccharose; 0,8% agar; bổ sung NAA (0,2 – 1,0
mg/L). Đánh giá khả năng hình thành rễ của chồi in vitro sau 4 tuần nuôi cấy thông qua:
Tỉ lệ mẫu chồi tạo rễ, số rễ/chồi, chiều dài rễ,
Các môi trường nuôi cấy in vitro đều được chỉnh pH = 5,8 trước khi khử trùng ở
121°C; 1,0 atm trong 20 phút. Các thí nghiệm ni cấy in vitro được duy trì ở nhiệt độ 25
± 2°C, điều kiện chiếu sáng 2000 Lux và thời gian chiếu sáng 12h/ngày.
2.3.5. Phương pháp xử lí thống kê
Mỗi thí nghiệm được bố trí lại 3 lần. Các số liệu thực nghiệm được xử lí thống kê
theo phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA).

13


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu vật
Tạo nguồn vật liệu ban đầu là một khâu hết sức quan trọng, quyết định sự thành công
trong việc nuôi cấy mô. Việc lựa chọn nguồn mẫu ban đầu và phương pháp khử trùng mẫu
phù hợp là bước quan trọng quyết định đến sự thành công của cả quy trình nhân giống.
Thân cây khơi nhung tiếp xúc với nhiều điều kiện bên ngoài nên lớp vỏ cây chứa vi
khuẩn và nấm. Phương thức vô trùng nuôi cấy thơng dụng nhất hiện nay là các hóa chất có
hoạt tính diệt nấm và khuẩn như: NaClO, H2O2, HgCl2 …Trong đó NaClO được đánh giá
là có hiệu quả diệt khuẩn và nấm khá tốt (Su, 2008). Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành
khảo sát hiệu quả khử trung mẫu vật với NaClO 5% với thời gian khử trùng khác nhau.
Kết quả khử trùng mẫu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng thời gian khử trùng bằng NaClO 5% đến hiệu quả khử trùng mẫu
thân cây khôi nhung sau 4 tuần nuôi cấy
Hiệu quả khử trùng
Thời gian khử
trùng (phút)

Tỷ lệ mẫu nhiễm

Tỷ lệ mẫu chết

Tỷ lệ mẫu sống

(%)

(%)

(%)

4 phút

62,21a ± 0,64

15,55a ± 0,65

37,67c ± 0,86

6 phút

53,33ab ± 0,87

19,9a ± 0,74

40,67b ± 0,92

8 phút

48,88b ± 0,72

28,9ab ± 0,85

54,33a ± 0,97

10 phút

44,44b ± 0,78

39,9b ± 0,87

51,67a ± 0,93

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thơng kê ở p<0,05
(Ducan’s test).
Qua bảng 3.1 cho thấy, với mẫu thân cây khôi nhung, khi sử dụng NaClO 5% ở 8
phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất với tỷ lệ mẫu sống đạt 54,33%, trong khi khử trùng
ở 4 phút tỷ lệ mẫu sống đạt 37,67%, nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm lên đến 62,21%. Khi tăng thời
gian khử trùng lên đến 10 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm, tuy nhiên tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt
51,67%. Khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu sạch đều tăng, nhưng tỷ lệ mẫu sống có
xu hướng giảm (đạt 40 – 60%), điều này có thể lý giải rằng khi tăng thời gian khử trùng
của NaClO 5% lên thì các tác nhân gây nhiễm như nấm và vi sinh vật bị tiêu diệt làm cho
tỉ lệ nhiễm giảm rõ rệt nhưng khi thời gian khử trùng của NaClO 5% tăng lên quá cao sẽ
gây tổn thương đến mô, cơ quan của cây và cuối cùng ảnh hưởng đến tỷ lệ tái sinh chồi
của mẫu được khử trùng. Do đó, thời gian của NaClO 5% phải phù hợp cho việc khử trùng
14


là vừa đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm nhưng lại không gây tổn thương đến các mô, cơ
quan. Như vậy, sử dụng NaClO 5% trong 8 phút để khử trùng mẫu cho kết quả tối ưu nhất.
Kết quả này có sự sai khác so với nghiên cứu của ( Nguyễn Văn Việt, 2016), nghiên
cứu nhân giống in vitro cây Khôi nhung (Ardisia sylvestris Pitard) thông qua nuôi cấy đoạn
thân đã sử dụng NaClO 3% trong thời gian 10 phút có hiệu quả khử trùng tốt nhất với tỷ
lệ sống sót đạt 80%. Năm 2019 nghiên cứu của Đồn Thị Thu Hương và cs đã kết luận
rằng phương pháp tối ưu để khử trùng chồi được ngâm trong ethanol 70% trong 1 phút,
bằng HgCl2 0,1% trong 8 phút và sau đó ni cấy mẫu với mơi trường Murashige và Skoog
(MS) với 0,2 mg/L BAP, tỷ lệ sống đạt được là 80,92%. Ở nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ

mẫu sống so với các nghiên cứu trên của các tác giả là tương đối thấp, nguyên nhân có sự
sai khác như vậy có thể là do đặc điểm của nguồn mẫu vật khôi nhung lấy ở các điều kiện
sinh thái khác nhau, khả năng nhiễm khuẩn cũng khác nhau...
Như vậy phương pháp khử trùng với ethanol 70% trong 1 phút, NaClO 5% trong 8
phút đạt hiệu quả tốt nhất và mẫu được sử dụng để thực hiện các bước tiếp theo trong
nghiên cứu.
3.2. Ảnh hưởng của TDZ và IBA đến khả năng tạo chồi in vitro từ callus mẫu thân
khôi nhung
Sau khi được khử trùng, mẫu thân được cấy vào các môi trường nuôi cấy tạo nguyên
liệu khởi đầu MS, sau 3 – 4 tuần ni mẫu thân hình thành callus. Callus phát triển theo
quy luật và có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phơi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh.
Hai điều kiện căn bản cho sự tạo mô sẹo là cây non và phần non cây trưởng thành dễ cho
mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác dụng của auxin (như 2,4 D hoặc NAA...)
được áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin.
Callus hình thành là nguồn nguyên liệu ban đầu để tiến hành q trình khảo sát ảnh
hưởng của mơi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh chồi in vitro. Các mô sẹo màu xanh
đậm, không nhiễm thu được từ giai đoạn nuôi cấy khởi đầu được cấy chuyển lên mơi trường
MS có 3% saccharose, 0,8% agar và bổ sung TDZ (0,25 mg/L; 0,5 mg/L, và 1 mg/L) phối
hợp với IBA (0,5 mg/L, 0,7 mg/L, và 1 mg/L) để khảo sát khả năng hình thành và phát
triển chồi in vitro. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của TDZ và IBA đến khả năng hình thành
chồi in vitro sau 6 tuần ni cấy được trình bày ở bảng 3.2.

15