Công Nghệ Di Truyền Chuyển gen ở tế bào động vật

Công nghệ di truyền 2

Chuyển gen ở động vật


Giới thiệu

• Động vật biến đổi gen (ĐVBĐG) được sử dụng trong
nghiên cứu chức năng gen in vivo và làm mơ hình
nghiên cứu bệnh ở người.
• ĐVBĐG được tạo ra ở các lồi động vật có vú, chim,
lưỡng cư, động vật khơng xương sống.
• Chuyển gen ở động vật thường được thực hiện trên
chuột nhằm tạo ra các mơ hình bệnh ở người.


Giới thiệu

•Phân tích điều hịa biểu hiện gen ở tế bào động vật
là một trong những hướng nghiên cứu chính của
sinh học phân tử hiện nay.
•Khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai của tế bào động
vật có vú và sự biểu hiện gen trong đoạn DNA chèn
vào được phát hiện vào năm 1962 bởi Szybalska và
Szybalski.
- DNA ngoại lai hình thành đồng kết tủa với
calcium phosphate; đi vào tế bào qua cơ chế
thực bào (phagocytosis).

Sinh học
• Virus

Hóa học
• Cation
polymer
• Calcium
phosphat
• Cation lipid

Vật lý
• Vi tiêm
• Biolistic
• Xung điện
• Tia laser
• Sóng siêu âm
• Hạt nano từ


Các phương pháp chuyển gen ở động vật

Hóa chuyển nhiễm (chemical transfection): DNA và
calcium phosphate đồng kết tủa trên màng tế bào và được tiếp
nhận qua cơ chế nội nhập bào (endocytosis)

Hình 1. DNA ngoại lai được đưa vào tế bào
bằng phương pháp hóa chuyển nhiễm
(Primrose and Twyman , 2006)

Các phương pháp chuyển gen ở động vật –

Hóa chuyển nhiễm

• Đồng kết tủa calcium phosphate thường độc, một
số loại tế bào không hấp thu kết tủa rắn
sử dụng hợp chất polycation (poly – L – lysine,
polyamides, DEAE-dextran)
• Một số hỗn hợp liplid tích điện dương trung hịa
tạo phức hợp với DNA. Phức hợp này tương tác
với màng tế bào sự tiếp nhận DNA qua cơ chế
nội nhập bào.
• Có thể được sử dụng trong chuyển gen một cách
bền vững hay tạm thời cũng như chuyển những
đoạn DNA kích thước lớn như YAC.


Hình 2. Các hợp chất polycation


Các phương pháp chuyển gen ở động vật –

Phương pháp vật lý

• Phương pháp chuyển nhiễm bằng xung điện cũng được sử

dụng rộng rãi, một cách hiệu quả trên nhiều loại tế bào và in
vivo (da, cơ hay tế bào ung thư)
Ưu điểm: dễ sử dụng và khả năng áp dụng trên nhiều
loại tế bào.

• Phương pháp vi tiêm mang lại hiệu quả cao nhưng địi hỏi
nhiều cơng sức và áp dụng trên một số loại tế bào nhất định,
như là giao tử cái, trứng, tế bào phơi sớm.
• Phương pháp bắn gen có thể được áp dụng đối với các tế
bào được nuôi cấy hay mô cũng như các ứng dụng in vivo
(cho tế bào da).


Hình 3. Vi ảnh thể
hiện cấu trúc màng
của tế bào hồng
cầu
được đông
lạnh ở các thời
điểm khác nhau (t),
sau
khi
được
truyền xung điện,
(a) t= 0,5 ms, (b)
2,5 ms, (c) 40ms,
(d) 5s,
(e) 10s
(Chang & Reese,
1990).


Hình 4 Thao tác vi tiêm thực hiện trên hợp tử ở giai
đoạn sớm

Sự xác nhập DNA

• DNA khơng tái bản, khơng được xác nhập sẽ bị
phân hủy, và chỉ dẫn đến biểu hiện tạm thời
(transient expression) .
• Ở một phần nhỏ của các tế bào được chuyển
nhiễm, DNA có thể xác nhập vào bộ gen tế bào
nhận, tái bản và tạo các dòng tế bào biến đổi gen
bền vững (stable expression). Các tế bào này được
chọn lọc bằng các marker.


plasmids-101-mammalian-vectors


Marker chọn lọc

• Dihydrofolate reductase (DHFR) và tính kháng
methotrexate.

Các dịng tế bào hoang dại nhạy cảm với Mtx 0.1µg/mL,
trong khi các dịng kháng (Mtx – resistant) được chọn lọc.

• Rodent CAD (carbamyl-P synthetase, aspartate
transcarbamylase, dihydro-orotase)

CAD protein là enzyme đa chức năng tham gia vào các
bước đầu tiên trong quá trình sinh tổng hợp uridine. Một
trong các bước này bị ức chế bởi N-phosphonacetyl- L –

aspartate (PALA). Các tế bào động vật có vú sản xuất
lượng lớn CAD từ các bản sao của gen CAD.


Marker chọn lọc

• XGPRT (xanthine – guanine phosphoribosyltransferase):
mycophenolic acid resistance

Enzyme từ E .coli này tương tự HGPRT ở động vật có vú.
Mơi trường chọn lọc được bổ sung adenine, mycophenolic
acid và xanthine. Hiệu quả chọn lọc tăng lên khi bổ sung
thêm aminopterin để khóa con đường nội sinh tổng hợp
purine.

• Neomycin phosphotranferase: kháng G418

Mã hóa bởi Transposon Tn5 và Tn601, thể hiện tính kháng
các kháng sinh aminoglucoside (Kanamycin, neomycin và
G418) – các chất ức chế sinh tổng hợp protein, hoạt động
ở tế bào nhân sơ và nhân thật.


Gen chỉ thị (reporter gene)

• Hệ thống biểu hiện gen (cassette) của các plasmid
pSV và pRSV điều khiển biểu hiện gen
chloramphenicol acetyltransferase (CAT) từ vi
khuẩn E. coli (Tn9), mã hóa tính kháng
chloramphenicol, phục vụ phân tích biểu hiện gen

tạm thời. Protein này khơng hoạt động trong tế
bào nhân thật.
• Luciferase là repoter gen được sử dụng rộng rãi ở
các hệ thống động vật và thực vật. Xúc tác sự oxi
hóa luciferin trong phản ứng cần khí oxi và ATP
và tỏa ánh sáng vàng – xanh lá.


Sự tạo dịng vơ tính ở động vật có vú

• Để chọn giống vật nuôi cần phải chọn lọc qua
nhiều thế hệ, tốn nhiều chi phí và cơng lao động.
• Sự đưa vào dịng thuần một tính trạng mới có thể
gây hại/giảm năng suất của con vật và cần nhiều
thời gian để tái lập dịng thuần mới.
• Sự thành cơng của việc chuyển gen vào tế bào
động vật có vú và của việc cấy chuyển nhân sinh
dưỡng vào tế bào trứng mất nhân cho phép thực
hiện tạo dịng vơ tính động vật biến đổi gen.


Các bước tạo động vật biến đổi gen ở động vật có vú

Phương pháp chung

Gen nhân dịng được tiêm vào hợp tử
Hợp tử (được tiêm) được cấy vào
con cái để hồn thành q trình phát
triển phơi thai
Những con vật mang gen nhân dòng

thành các dòng di truyền mới


Hình 5. Các bước tạo
chuột chuyển gen.
Tiền nhân đực (male
pronucleus) ở hợp tử
(fertilised egg) được vi
tiêm DNA; hợp tử
được biến đổi được
chuyển vào ống dẫn
trứng (oviduct) của
chuột cái mang thai
giả (pseudopregnant).
Hợp tử này sẽ phát
triển thành chuột
chuyển gen.


Hình 6. Các bước tạo
chuột chuyển gen bằng
cách sử dụng tế bào gốc.
Tế bào gốc phôi với gen
mục tiêu được biến đổi
được vi tiêm vào phôi
nang (blastocyst). Phôi
nang này được cấy vào
tử cung của chuột mẹ
mang thai giả. Phôi sẽ
phát triển thành chuột

chuyển gen mang đặc
điểm di truyền từ các tế
bào trong phôi ban đầu
và từ tế bào gốc.


Các ứng dụng của động vật chuyển gen

• Thiết lập mơ hình động vật phục vụ nghiên cứu các
bệnh ở người (Phương pháp “gene knock-out”)
• Sản xuất các protein q.

Ví dụ: sử dụng tuyến vú cho sản xuất các protein dược phẩm
có trong sữa. Sữa có thể được tái tạo liên tục, lượng lớn, quá
trình tinh chế protein cần thiết đơn giản hơn.


Tạo chuột chuyển gen sử dụng Retrovirus
Vector retrovirus được chuyển vào tế
bào giai đoạn phát triển phôi sớm
Vi tiêm vào nhân nguyên đực đã trương
to của trứng thụ tinh
Đưa các tế bào gốc phôi đã cải biến vào
phôi giai đoạn sớm, trước khi chuyển vào
con cái nhận.


Retrovirus

/>

Hình 7. Vịng đời của Retrovirus


Hình 8. Vector retrovirus có vị trí
tạo dịng (cloning site) nằm trong
vùng DNA có nguồn gốc từ
retrovirus. Vector tái tổ hợp được
tạo ra (mang đoạn chèn - màu đỏ)
và nhân lên trong tế bào E. coli.
DNA tái tổ hợp được đưa vào tế
bào ĐVCV dưới hình thức chuyển
nhiễm. Một số tế bào tiếp nhận
DNA và tạo virus tái tổ hợp. Các
virus tái tổ hợp này tiếp tục xâm
nhiễm và biểu hiện gen ở các tế
bào mới.
/>

Tạo chuột chuyển gen sử dụng retrovirus

Ưu điểm
- Rất hiệu quả trong việc cài nhập gen chuyển vào
bộ gen tế bào nhận
- Có thể áp dụng trên nhiều loại tế bào và trong
nghiên cứu liệu pháp gen.
Hạn chế
- Chỉ chuyển được đoạn DNA kích thước nhỏ
(khoảng 8 kb), do đó thiếu các trình tự liên quan đến
quá trình biểu hiện gen.
- Khơng an tồn cho các sản phẩm chuyển gen là

thực phẩm