BÁO CÁO KHOA HỌC: "THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI (HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO" pot

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG
TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI
(HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH
FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO

Nguyễn Bích Nhi
Viện Công nghệ Sinh học
Masashi Suzuki
National Istitute of Bioscience and Human Technology,
Tsukuba, Japan

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGFs (Fibroblast
Growth Factor) là những polypeptide thuộc nhóm cytokine,
được tiết ra ở các tế bào động vật, có hoạt tính gây phân
bào mạnh. Các thành viên của nhóm FGF đóng vai trò quan
trọng trong nhiều quá trình sinh lí như quá trình sinh
trưởng, biệt hóa tế bào, hình thành các mô, thành mạch
máu, sửa chữa và làm lành vết thương (Mc Keehan và
cs., 1998).

Nhiều thành viên của nhóm FGF có chứa đoạn tín hiệu
peptide mã hóa cho các protein tiết. FGF-10 là thành viên
thứ 10, dược phát hiện ra bởi Yamasaki và cs., 1996. cDNA
của hFGF-10 mã hóa cho một protein gồm 208 acid amin,
trong đó 40 acid amin đầu (đầu N) có tính kị nước cao, là
đoạn có vai trò như một tính hiệu peptide (Yamasaki và cs.,
1996, Emoto và cs., 1997. Do đó FGF-10 có thể có khả
năng tiết. Nhiều thành viên của nhóm FGF như FGF-5
(Bates và cs., 1991; Ozawa và cs., 1998, Clements và cs.,

1993), FGF-6 (Asada và cs), FGF-7 (MacArthur và cs.,
1995), FGF-9 (Santos - Ocampo và cs., 1996) có chứa vị
trí N-glyccosyl và một số thành viên của nhóm FGF được
tinh chế ở dạng glycosyl hóa. Để nghiên cứu, tìm hiểu các
tính chất của FGF-10 và sự biến đổi của nó liên kết với các
mạch carbohydrate , chúng tôi đã sử dụng và thiết kế vector
pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) để biểu hiện hFGF-10
ở các tế bào động vật có vú.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. ARN tổng số từ não người (Toyobo)

2. Vector tách dòng PCR -TRAP (GenHunter)

3. Vector biểu hiện pcDNA3.1(-)MycHis Version B
(Invitrogen).

4. Làm sạch sản phẩm PCR: sử dụng PCR QiaQuick PCR
Kit (Qiagen)

5. Tách ADN plasmid sử dụng MiniPrep Kit (PE Applied
Biosystem)

6. Xác định trình tự ADN sử dụng thiết bị ABI 310 -
PRISM Genetic Analyzer (Perkin Elmer)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thiết kế cặp mồi để biểu hiện hFGF-10 ở tế bào động

vật có vú:

Dựa vào trình tự của toàn bộ đoạn gen hFGF-10 (số đăng kí
trong Gen Bank là AB 002097 DDBJ), cặp mồi để nhân
hFGF-10 đã được thiết kế sử dụng vector pcDNA3.1(-)
Myc-His để biểu hiện ở tế bào động vật có vú với đầu 5'
gắn thêm vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI và đầu 3' gắn
vị trí cắt của enzym HindIII. Trình tự cặp mồi như sau:



2. Phản ứng RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR) :

Để thu nhận cDNA (complementary DNA - ADN bổ trợ)
từ ARN tổng số được tách ra từ não người và cung cấp bởi
hãng Toyobo, phản ứng phiên mã ngược RT (Reverse
transcriptase) đã được tiến hành trong tổng thể tích 50 l
với các thành phần phản ứng bao gồm 10l đệm 5 X RT,
2l mồi ngẫu nhiên -hexamer (60 ng/l), 5l DTT - dithio
threitol (0.1 M), 8l hỗn hợp dNTPs (2.5 mM), 0.5l
RNasin (40 U/l), 2l enzyme phiên mã ngược -MMLV
Reverse transcriptase (200 U/l), 18.5l nước cất vô trùng
và 4l ARN tổng số (250 ng/l). Phản ứng được tiến hành
ở 37
o
C trong 75 phút. Sau đó hỗn hợp phản ứng (cDNA đã
được tổng hợp) được pha loãng 10 lần bằng nước cất và
bảo quản ở -20
o
C.

Phản ứng PCR được tiến hành tiếp theo sử dụng cDNA vừa
được tổng hợp làm mẫu (template) để nhân toàn bộ đoạn
gen hFGF-10. Thành phần phản ứng PCR trong tổng thể
tích 25l bao gồm: 11l nước cất vô trùng, 2.5l 10 X đệm
Pfu, 2l dNTPs (2.5mM), 8l sản phẩm của phản ứng RT
đã pha loãng 10 lần, 0.5l mồi xuôi (10pmol), 0.5l mồi
ngược (10pmol) và 0.5l Pfu polymerase (0.5U/l).
Chương trình chạy PCR: các điều kiện để chạy PCR đã
được tối ưu hóa như sau: Biến tính ở 94
o
C trong 2 phút; 40
chu trình : 94
o
C trong 45 giây, 55
o
C trong 45 giây và 72
o
C
trong 2 phút; lần kéo dài chuỗi cuối cùng ở 72
o
C trong 10
phút.

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 1% (hình 1). Kết quả điện di trên hình 1
cho thấy sản phẩm PCR là một băng đậm đặc hiệu, có kích
thước khoảng 650 bp tương đương với kích thước của
hFGF-10 có cộng thêm các vị trí cắt của các enzyme giới
hạn đã thiết kế. Để kiểm tra xem sản phẩm PCR nhận được
có phải là hFGF-10 hay không, sản phẩm PCR sau khi

được tinh chế bằng Qia Quick Kit đã được cắt bằng enzyme
NsiI và ScaI. Phản ứng cắt kiểm tra được tiến hành trong
tổng thể tích là 10l với các thành phần như sau: 1l đệm
10X NsiI (hoặc đệm NE-II đối với ScaI), 2l sản phẩm
PCR, 0.8l NsiI enzyme. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37

C
trong 1 giờ. Sản phẩm thủy phân được điện di để kiểm tra
trên gel agarose 1% để kiểm tra (hình 2).

Hình1: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. Đường
chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123bp, đường chạy
số 2: sản phẩm PCR; đường chạy số 3: thang ADN chuẩn
/HindIII.


Hình 2. Kiểm tra cắt sản phẩm PCR bằng enzyme ScaI .
Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp;
đường chạy số 2: sản phẩm PCR sau khi bị cắt bởi ScaI.


Kết quả nhận được ở hình 3 cho thấy sản phẩm PCR sau
khi bị thủy phân bởi enzyme ScaI có 1 điểm cắt trong trình
tự của hFGF-10 tại vị trí 273 sản phẩm PCR sau khi xử lí
ScaI được chia thành 2 băng nhỏ hơn có kích thước khoảng
273 và 357 bp (hình 3, giếng 2). Như vậy sơ bộ có thể cho
rằng sản phẩm PCR nhận được có nhiều khả năng là hFGF-
10.

2. Tách dòng hFGF-10:

Để kiểm tra trình tự của sản phẩm PCR, vector tách dòng
(PCR-TRAP Cloning System, version 3.0- GenHunter
Corporation). Sản phẩm PCR được gắn vào vector TRAP
trong tổng số 10l với thành phần sau: 2l PCR-TRAP
vector đã chuẩn bị sẵn sàng để gắn các đoạn gen (insert),
1l 10X đệm gắn (ligation buffer), 2.5l sản phẩm PCR và
1l T4 -DNA ligase. Phản ứng được tiến hành ở 16

C, qua
đêm (khoảng 16 giờ). Sau đó hỗn hợp phản ứng được biến
nạp vào các tế bào khả biến chủng vi khuẩn GH với thành
phần phản ứng bao gồm: 20l tế bào khả biến GH , 4l hỗn
hợp phản ứng trên để ở trong đá (0

C) trong 45 phút. Sốc
nhiệt ở 42

C trong 2 phút rồi để ngay vào đá 2 phút và cho
thêm vào 0.4 ml môi trường LB (Luria-Bertani) lỏng, trộn
đều và nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) tiếp ở 37

C trong 1
giờ. Sau đó cấy trải dịch nuôi cấy trên lên đĩa petri LB đặc
có bổ sung tetracycline (nồng độ cuối cùng 20 g/ml). Để
đĩa petri qua đêm trong tủ ấm 37

C qua đêm. Hôm sau
kiểm tra đĩa thấy mọc các khuẩn lạc trắng. Kiểm tra sự gắn
của sản phẩm PCR vào vector bằng cách phân tích khuẩn

lạc. Lấy một ít khuẩn lạc bằng đầu côn cho vào ống
eppendorf vô trùng có chứa 50l đệm TE (10mM Tris,
1mM EDTA pH8) có bổ sung 0.1% Tween 20. Trộn đều và
ủ ở 95

C trong 10 phút. Li tâm nhanh. Lấy 2l dịch nổi làm
mẫu để chạy PCR với thành phần như sau: 2l 10 X đệm
PCR, 2ldNTPs (200 mol), 2l mỗi loại Lgh và Rgh mồi
được cung cấp bởi Kit, 0.2l Taq DNA polymerase.
Chương trình PCR như sau: 30 chu trình của 94

C trong 30
giây, 52

C trong 40 giây , 72

C trong 1 phút; tiếp theo 72

C
trong 5 phút và kết thúc ở 4

C. Sau khi chạy PCR, phân
tích sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1.5% (hình 3).

Hình 3. Điện di phân tích khuẩn lạc bằng phương pháp
PCR . Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn /HindIII;
đường chạy số 2,3: sản phẩm PCR của khuẩn lạc 1 và 2;
đường chạy số 4:thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp.

Kết quả phân tích khuẩn lạc cho thấy mẫu ADN của khuẩn
lạc 1 cho 1 băng đặc hiệu có kích thước khoảng 770bp
tương ứng với kích thước của đoạn gen hFGF-10 và cộng
120bp là phần thêm của vector TRAP như trong hướng dẫn
sử dụng của vector. Như vậy ADN của khuẩn lạc 1 có
mang đoạn gen cần gắn. Đối với mẫu khuẩn lạc 2, sản
phẩm PCR là 2 băng có kích thước nhỏ không đúng với
kích thước của đoạn gen cần gắn do đó ADN của khuẩn lạc
2 không chứa đoạn gen cần gắn.

Sau khi dã xác định được khuẩn lạc 1 có chứa đoạn gen
nhân được, khuẩn lạc 1 được nuôi ở môi trường LB lỏng có
bổ sung tetracycline và tách ADN plasmid sử dụng kit
MiniPrep, ADN sau đó được kiểm tra OD
260/280nm
để định
lượng và sử dụng 500 ng để xác định trình tự. Kết quả cho
thấy sản phẩm PCR nhân được có trình tự ADN hoàn toàn
trùng khớp với trình tự của gen hFGF-10 trong ngân hàng
gen, số đăng kí AB 002097 DDBJ. Như vậy là việc tách
dòng gen hFGF-10 đã được thực hiện.

4. Gắn gen hFGF-10 vào vector biểu hiện pcDNA3.1(-
)Myc-His:

pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) là vector 5.5 kb được
thiết kế để biểu hiện các protein tái tổ hợp trên tế bào động
vật có vú. Vector có 3 vị trí đọc để gắn đoạn gen đích với
đầu C tận cùng của polypeptide có gắn đuôi Histidine (His
tag) và Myc (C-myc) epitope cho phép xác định và tinh chế

hiệu quả protein tái tổ hợp. Promotor của vector -human
cylomegalovirus (CMV) cho phép biểu hiện cao ở nhiều
loại tế bào động vật có vú. Vector biểu hiện pcDNA3.1(-)
Myc-His và vector tách dòng có chứa đoạn gen hFGF-10
cùng được xử lí bằng XhoI và HindIII, sau đó sản phẩm
vector và gen đã xử lí enzyme được kiểm tra trên gel
agarose 1% và tinh chế bằng phương pháp thôi gel, sử dụng
Qia Quick Kit. Sau khi tinh sạch và xác định hàm lượng,
gen được gắn vào vector nhờ phản ứng gắn sử dụng
enzyme T4-ligase với thành phần như sau: 0.75l đệm gắn
T4, 3l vector đã xử lí (250ng/l), 3.5l gen hFGF-10
(insert) đã xử lí (60ng/l) và 0.25l T4-ligase. Phản ứng
được thực hiện ở 16C qua đêm. và cấy trải trênaTiếp đó
hỗn hợp phản ứng được biến nạp vào tế bào khả biến DH5
đĩa LB có bổ sung ampicilline (50g/ml) và nuôi trong tủ
ấm 37C qua đêm. Các khuẩn lạc được nuôi nhân trong
môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline và tách ADN
plasmid. Kiểm tra sự gắn của gen vào vector biểu hiện
pcDNA3.1(-)Myc-His bằng cách xử lí ADN plasmid tách
được bằng 2 enzyme XhoI và HindIII. Kết quả được thể
hiện trên hình 4.

Hình 4. Các ADN plasmid được xử lí bằng enzyme XhoI và
HindIII. Đường chạy số 1-5: ADN các plasmid từ 1-5 được
xử lí bằng XhoI và HindIII; đường chạy số 6: Thang ADN
chuẩn bậc thang 123bp.


Kết quả trên hình 4 cho thấy chỉ trừ các plasmid số 4
(đường chạy 4) là không chứa đoạn insert, các plasmid còn

lại đều có chứa đoạn gen có kích thước khoảng 650 bp
tương ứng với hFGF-10. Như vậy việc gắn hFGF-10 vào
vector biểu hiện pcDNA3.1(-)myc.his đã thành công. ADN
của các plasmid này đã được sử dụng để chuyển gen hFGF-
10 vào tế bào động vật có vú (Cos-7- tế bào thận khỉ) sử
dụng các hóa chất chuyển gen (Lipo Fectamin-2000,
SuperFect ).

KẾT LUẬN

1. Đã tách dòng được gen hFGF-10 từ ARN tổng số não
người bằng phản ứng RT-PCR.

2. Đã thiết kế được vector biểu hiện pcDNA3.1(-)Myc-His
có gắn đoạn gen hFGF-10 để biểu hiện ở tế bào động vật có
vú.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Asada M., Yoneda A., Oda Y., Ota K., Ozawa K.,
Fukuta K., Omae M., Orikasa N., Suzuki M., Oka S.,
Makino T. and Imamura T. (1999) Growth Factor 16, 293-
303.
2.Bates B., Hardin J., Zhan X., Drickamer K., and Goldfarb
M.(1991). Mol.Cell Biol. 11,1840-1845.
3. Clements D.A., Wang J.K., Dionne C.A. and Goldfarb
M. (1993)Oncogene 8, 1311-1316
4. Emoto H., Tafashira S., Mattei M.G. and Yamasaki M,
(1997) J. Biol. Chem. Vol. 272, No.37, 23191-23194.
5. Hsu Y.R., Hsu E.W., Katta V., Brankow D., Tseng J., Hu

S., Morris C.F., Kenney W.C. and Lu H.S. (1998) Protein
Expr.Purf. 12, 189-200.
6. MacArthur C.A., Lawshe A., Shankar D.B.,
Heikinheimo M., Shackleford G.M. (1995) Cell Growth
Differ. 6,817-825.
7. McKeehan W.L., Wang F. and Kan M. (1998)
Prog.Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59. 135-176.
8. Revest J.M., DeMoerlooze L. and Dickson C. (2000)
J.Biol.Chem. 275, 8083-8090.
9. Santos-Ocampo S., Colvin J.S., Chellaiah A. and Ornitz
D.M. (1996) J.Biol.Chem. 19, 1726-1731.
10. Yamasaki M., Miake A., Tagashira S. and Itoh N.
(1996) J.Biol.Chem. 271,15918-15921.
11. Yoneda A., Asada M., Suzuki M. and Imamura T.
(1999)Biotechniques 27, 576-590.

SUMMARY

Construction of mammalian expression vector For
human fibroblast growth factor-10 (hfgf-10)

Nguyen Bich Nhi
Institute of Biotechnology (IBT), NCST
Masashi Suzuki
National Institute of Bioscience and Human Technology
(NIBH), Tsukuba, Japan


Full length human Fibroblast Growth Factor (hFGF-10)
cDNA (650 bp) was amplified from human brain total

RNA (Toyobo) by reverse transcription-polymerase chain
reaction (RT-PCR) using synthetic oligonucleotide primers.
These primers contain sequences that flank both ends of the
full length hFGF-10 (amino acid 1-208) with additional
XhoI and HindIII sites located at their 3’ and 5' ends,
respectivetly. The amplified product was sub-cloned into
the PCR-TRAP (GenHunter) cloning vector and the DNA
sequence was verified by ABI310-PRISM Genetic
Analyzer as the hFGF-10 (acession number AB 002097 in
the DDBJ and GenBank Nucleotide Sequence Databases).
For expression of recombinant hFGF-10 protein in
mammalian cells, we used an expression vector,
pcDNA3.1(-)Myc-His (Invitrogen) which is designed to
introduce a C-terminal peptide containing a myc sequence
and polyhistidine metal -binding sequence tags into the
target protein for efficent detection and purification. The
amplified product was digested with XhoI and HindIII
restriction enzymes, purified by QiaQuick Kit (Qiagen) and
was ligated at XhoI and HindIII sites of the corresponding
sites of the enzyme-digested pcDNA3.1(-)Myc-His vector
to allow production of recombinant protein in mammalian
cells from T7 promoter . The ligation product then was
transformed into the DH5- competent cells and cultured at
37C overnight. The plasmid DNAs were extracted from
the culture of white colonies by using MiniPrep Kit (PE
Applied Biosystem) and the recombinant expression
pcDNA 3.1(-) Myc-His vector bearing hFGF-10 gene was
confirmed by XhoI/HindIII enzyme digestion of plasmid
DNAs.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Thị Ngọc
Dao.