ứng dụng phương pháp pcr phát hiện edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN








MAI THỊ LOAN







ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN
Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH









LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009






PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN





MAI THỊ LOAN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN
Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN






CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH
KS. NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG







2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- i -
LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân có
phần đóng góp rất lớn của Cha Mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng; Thầy
Cô đã có công dạy bảo và tất cả bạn bè luôn bên cạnh tôi giúp đỡ và động viên
tôi.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị
Nguyễn Trúc Phương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi về mọi mặt
trong quá trình tôi thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn cô Đặng Thụy Mai Thy và cô Trần Thị Tuyết Hoa cũng
như toàn thể quý thầy cô Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giúp đỡ tôi
và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Chân thành cảm ơn chị Trần Việt Tiên, anh Lê Hữu Thôi và các anh chị Bộ
môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
tôi thực hiện đề tài.
Cảm ơn những người bạn thân của tôi cũng như tất cả các bạn lớp Bệnh Học
Thủy Sản 31 đã luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời
gian học tập tại Giảng đường Đại học cũng như trong quá trình thực hiện đề
tài.
Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và Em trai tôi đã luôn là chỗ dựa
tinh thần vững chắc cho tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống.


Mai Thị Loan
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- ii -

TÓM TẮT
Đề tài thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô thận của cá

tra theo phương pháp của Taggart et al. (1992) và tối ưu hóa phương pháp
PCR phát hiện E. ictaluri.
Qui trình ly trích ADN được chuẩn hóa có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui
trình gốc (Taggart et al, 1992) với hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5µl
(40mg/ml), thời gian ủ ở bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5µl
(2mg/ml), thời gian ủ bước 2 là 30 phút.
Qua thí nghiệm xác định được độ nhạy đối với ADN chiết tách trực tiếp từ
thận có hàm lượng là 50ng, với ADN chiết tách từ vi khuẩn có hàm lượng 0.2
ng. Hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 được xác định là đặc hiệu với vi khuẩn E.
ictaluri. Ngoài ra trong quá trình chuẩn hóa thay đổi hàm lượng Tag DNA
polymerase từ 5U/µl xuống còn 3U/µl.
Thực hiện phản ứng PCR với ADN được chiết tách trực tiếp từ thận với qui
trình đã được tối ưu, phương pháp PCR đã chuẩn hóa phát hiện E. ictaluri ở vị
trí 407bp.











PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- iii -
MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG vi
DANH SÁCH HÌNH vii
PHẦN I: GIỚI THIỆU 1
PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL 3
2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 4
2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam 4
2.2.1.1 Trên thế giới 4
2.2.1.2 Ở Việt Nam 4
2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri 5
2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm 6
2.3 Chiết tách acid nucleic 6
2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) 7
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
3.1 Thời gian và địa điểm 13
3.2 Dụng cụ và hoa chất 13
3.2.1 Dụng cụ 13
3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn 13
3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR 13
3.2.2 Hóa chất 14
3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn 14
3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR 14
3.3 Phương pháp nghiên cứu 15
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- iv -
3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 15

3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể 15
3.3.1.2 Cá thí nghiệm 15
3.3.1.3 Vi khuẩn gây cảm nhiễm 15
3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm 16
3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn 17
3.3.3 Phương pháp PCR 19
3.3.3.1 Vật liệu cho phản ứng PCR 19
3.3.3.2 Chiết tách acid nucleic: phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al,
1992) 19
3.3.3.3 Thí nghiệm xác định độ nhạy 20
3.3.3.2.1 Chiết tách acid nuleic (Bartie và ctv, 2006) 20
3.3.3.2.2 Khuếch đại ADN: (Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) 21
3.3.3.2.3 Điện di 22
3.3.3.4 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu 22
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24
4.1 Kết quả phân tích vi sinh 24
4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý 24
4.1.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa 24
4.2 Kết quả chuẩn hóa qui trình chiết tách acid nucleic – phương pháp Phenol
chloroform (Taggart et al, 1992) (chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh)25
4.2.1 Thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol
chloroform (Taggart et al, 1992) 25
4.2.2 Tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 26
4.2.3 Điều chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase
27
4.2.4 Tối ưu qui trình chiết tách với hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ
bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút.
27
4.3 Kết quả chuẩn hóa phương pháp PCR 28
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

- v -
4.3.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy 28
4.3.2 Kết quả xác định tính đặc hiệu 30
4.3.3 Kết quả chuẩn hóa qui trình khuếch đại phát hiện E. ictaluri (Panangala
và ctv, 2007) 31
4.4 Kết quả phản ứng PCR 33
4.4.1 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện qui trình chiết tách acid
nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) 33
4.4.2 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách
được tối ưu 35
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36
5.1 Kết luận 36
5.2 Đề xuất 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO 37
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- vi -
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Thành phần tham gia phản ứng PCR 20
Bảng 4.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa 25
Bảng 4.2 Hàm lượng DNA chiết tách (theo Taggart et al., 1992) 25
Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform
(Taggart et al, 1992), tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1
26
Bảng 4.4 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform
(Taggart et al, 1992), chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng
RNase 27
Bảng 4.5 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform
(Taggart et al, 1992), hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ bước 1 là 15
phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút 28
Bảng 4.6 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA

polymerase 5U/µl) 31
Bảng 4.7 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA
polymerase 4U/µl) 31
Bảng 4.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA
polymerase 3U/µl) 32




PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- vii -
DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan 24
Hình 4.2 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ
thận 29
Hình 4.3 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ
vi khuẩn 29
Hình 4.4 Kết quả điện di thí nghiệm xác định tính đặc hiệu. 30
Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra hiệu quả của các hàm lượng Tag DNA
polymerase khác nhau 32
Hình 4.6 Kết quả chạy PCR phát hiện E. ictaluri, qui trình chiết tách acid
nucleic theo phương pháp Phenol-chloroform (Taggart et al, 1992) 33
Hình 4.7 Kết quả chạy PCR, chuẩn hóa qui trình chiết tách lần 1 34
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR với qui trình tối ưu 35




PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 1 -

PHẦN I
GIỚI THIỆU
Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta nói chung và
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đang phát triển không ngừng
mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nước nhà đặc biệt là cá tra do đây là đối
tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon. Cá tra được nuôi nhiều ở An
Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ với nhiều mô hình khác nhau cả trong lồng bè,
ao đất.
Mặc dù năm 2008 ngành thủy sản nước ta gặp nhiều khó khăn nhưng giá trị
xuất khẩu vẫn không ngừng gia tăng. Theo số liệu của Hải quan, tính đến
ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đã đạt 4 tỷ
USD. 10 tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ
USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái.
Xuất khẩu trong tháng 10 đạt 124.328 tấn, trị giá 478,23 triệu USD, tăng 30%
về khối lượng và giá trị so với tháng 10/2007. Trong đó, cá tra, basa chiếm
32,4%, với 550.070 tấn, đạt mức tăng trưởng cao nhất, tăng 74,5% về lượng
và 53,3% về giá trị so với cùng kỳ (
Để có sản lượng cao như thế, bên cạnh việc tăng diện tích nuôi trồng người
nuôi còn tăng cả mật độ làm xuất hiện nhiều loại bệnh như mủ gan, bệnh đốm
đỏ, bệnh nhiễm huyết và một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra.v.v. Theo
thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì tần suất xuất hiện bệnh năm 2007
ở các tỉnh ĐBSCL gồm đốm trắng trên gan, thận (52,80%), xuất huyết
(42,50%), phù mắt (20,70%) và vàng da (21,60%). Như vậy tần số xuất hiện
của bệnh đốm trắng nội tạng là cao nhất (Nguyễn Trọng Bình, 2008).
Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998
(Ferguson và ctv, 2001) và trở nên trầm trọng vào 1999. Bệnh xuất hiện suốt
chu kỳ nuôi, thường vào mùa lũ và cao điểm là vào tháng 7 và 8. Cá bị bệnh
có biểu hiện bơi lờ đờ, tuy nhiên đa số cá bệnh không có những biểu hiện bất
thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi, trong giai
đoạn này nếu không áp dụng các phương pháp điều trị và môi trường nuôi

quá bẩn bệnh sẽ trở nên trầm trọng và rất khó khăn trong việc điều trị. Khi cá
nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào
cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung, 2004).
Từ thực tế tình hình dịch bệnh đòi hỏi phải có một phương pháp giúp sớm tìm
ra tác nhân gây bệnh từ đó có hướng xử lý và điều trị kịp thời. Hiện nay
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 2 -
phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ
biến là phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API20E. Tuy
nhiên cả 2 phương pháp này cho kết quả chậm, mất nhiều thời gian nên chưa
đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán bệnh trong tình hình hiện nay. Gần đây
Nguyễn Trúc Phương (2009) đã ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán
nhanh vi khuẩn E.ictaluri, thời gian được rút ngắn ¼ lần so với phương pháp
định danh truyền thống. Tuy nhiên phương pháp này vẫn phải trải qua một
bước nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tổng hợp để được chủng vi khuẩn
thuần. Nếu phương pháp này được thực hiện trực tiếp từ mô cá bệnh thì thời
gian chẩn đoán sẽ được rút ngắn hơn nữa (chỉ mất khoảng 1 ngày). Do đó đề
tài “Phát triển phương pháp PCR phát hiện Edwardsiella ictaluri trực
tiếp từ mô cá bệnh” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát
hiện E. ictaluri nhanh, nhạy làm cơ sở cho việc điều trị có hiệu quả sau này.
Mục tiêu
Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri từ mô cá
bệnh
Nội dung
1. Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô cá bệnh
2. Tối ưu phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri
3. Xác định độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện E.
ictaluri

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 3 -
PHẦN II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL
Đồng Bằng Sông Cửu Long gồm 12 tỉnh và 1 thành phố trực thuộc Trung
ương với tổng diện tích chiếm 3.960.000 ha chiếm 12% tổng diện tích tự
nhiên của cả nước. Tiềm năng diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản của
vùng được xác định là khoảng 963.700 ha chiếm 57,61% tổng diện tích tiềm
năng của cả nước. Năm 2002, đã có khoảng 73,9% diện tích tiềm năng này
được sử dụng cho nuôi trồng thủy sản (Lê Xuân Sinh, 2005).
Theo báo cáo của ngành Thủy sản năm 2006, cá tra basa đạt sản lượng
800.000 tấn và kim ngạch xuất khẩu đạt 773 triệu USD (tăng 50% so với năm
2005), và đến năm 2007 với sản lượng hơn 1,5 triệu tấn kim ngạch xuất khẩu
cá tra đạt 974 triệu USD, chiếm 26% kim ngạch xuất khẩu toàn ngành thủy
sản (kim ngạch xuất khẩu toàn ngành ước đạt 3,75 tỷ USD) (Trần Thanh Hoan
2008, trích dẫn bởi Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008).
Theo Nguyễn Phú Son (2007), năm 2002 diện tích nuôi cá tra ao là 2.720 ha,
đến năm 2005 tăng lên 3.548 ha, tăng bình quân hằng năm 18,6% trong 3 năm
2003 – 2005.
Khi ngành nuôi trồng đã phát triển, nhiều đối tượng có giá trị kinh tế được đưa
vào nuôi, các hình thức nuôi công nghiệp như thâm canh, siêu thâm canh được
áp dụng phổ biến, sự đầu tư lớn về giống, thức ăn và năng suất cao luôn là

điều kiện tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh. Do vậy, khi nuôi trồng thủy sản
càng phát triển thì vấn đề dịch bệnh càng trở nên thường xuyên, đe dọa ngành
nuôi trồng thủy sản, gây những thiệt hại lớn và đôi khi bệnh đã trở thành nhân
tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất (Bùi Quang Tề, 2004).
Ngoài ra, theo Lê Xuân Sinh và Lê Lệ Hiền (2008), trong tổng chi phí nuôi cá
tra, thức ăn chiếm khoảng ¾, điều này có tác động lớn tới môi trường nước -
một trong những nguyên nhân quan trọng nhất đối với việc bệnh xuất hiện
ngày càng nhiều trên cá tra nuôi.
Có nhiều loại tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi, tuy nhiên vi khuẩn là một tác
nhân gây bệnh quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm hãm phát triển và gây hạn
chế mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản (Từ Thanh Dung, 2008)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 4 -
Theo Trần Anh Dũng (2005), khi nghiên cứu khảo sát tác nhân gây bệnh trên
cá tra nuôi thâm canh ở An Giang cho thấy, bệnh trên cá tra nuôi sự xuất hiện
có tính mùa vụ rõ rệt, bệnh do ký sinh trùng hầu như xuất hiện quanh năm
nhưng nhiều nhất là vào mùa mưa và mùa lũ rút, mùa khô thường ít hơn mùa
lũ. Bệnh do vi khuẩn xuất hiện quanh năm, bệnh mủ gan xuất hiện nhiều vào
mùa lũ, bệnh xuất huyết xuất hiện nhiều vào mùa lũ rút. Theo đó, tỉ lệ nhiễm
các bệnh do vi khuẩn như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ chiếm 68,3%, mủ gan chiếm
61,0%, phù đầu 51,2% và bệnh vàng da chiếm 24,4%.
Kết quả điều tra tại An Giang và Cần Thơ cho thấy các loại bệnh phổ biến
trong nuôi cá tra thâm canh ở hai địa phương này là bệnh gan thận mủ, bệnh
đốm đỏ, bệnh phù đầu, bệnh lở loét, trắng mang – trắng đuôi, lồi mắt-nổ mắt,
nấm thủy mi, xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng. Trong đó bệnh thường gặp
và gây thiệt hại lớn là bệnh gan thận mủ với tỷ lệ chết là 80 – 90% nếu không
có biện pháp điều trị kịp thời (Nguyễn Chính, 2005; Nguyễn Tấn Duy Phong,
2008).
2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam

2.2.1.1 Trên thế giới
Hawke (1979) lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng máu
trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), với tên gọi là ESC (Enteric septicaemia
of catfish). Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo
(Hawke và ctv,1998). Bên cạnh xuất hiện ở miền Nam nước Mỹ bệnh còn
được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona, và New Mexico.
Ngoài cá nheo, các loài blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish
(Ictalurus melas) cũng nhạy cảm với E. ictaluri (Plumb và Sanchez, 1983) và
theo ghi nhận của Kasornchandra và ctv (1987) thì vi khuẩn này cũng được
tìm thấy trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan.
Plumb, 1999 cho biết bệnh do vi khuẩn E. ictaluri xảy ra trên cá trơn vào mùa
có nhiệt độ thấp. Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân
đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu khi nhiệt độ nước khoảng 18 - 28°C.
2.2.1.2 Ở Việt Nam
Bệnh mủ gan được ghi nhận xuất hiện đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào
cuối năm 1998 với tên gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pangasius)
(Ferguson và ctv 2001). Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10 – 90%
tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi. Cá bị bệnh trên gan, thận và tỳ tạng
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 5 -
xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1 – 3mm, bên trong chứa dịch màu
trắng đục nên thường gọi là bệnh mủ gan. Qua nghiên cứu E. ictaluri chính là
tác nhân gây ra bệnh này (Từ Thanh Dung, 2004).
Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì trong hai năm 2005 và 2006,
tại các khu vực nuôi cá tra tập trung như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và
Vĩnh Long, cá tra thường nhiễm bệnh vào tháng 5 và 7. Thời điểm này, môi
trường nước trong ao nuôi rất xấu do ảnh hưởng của lũ đổ về mang nhiều chất
thải lẫn mầm bệnh. Cá thường bị nhiễm các bệnh vàng da, mủ gan, bệnh xuất
huyết, và đốm đỏ. Kết quả điều tra 65 hộ nuôi cá tra thì có 100% số hộ ở Đồng
Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ và 80% số hộ ở An Giang bị nhiễm bệnh (Thạch

Thảo, 2008).
Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh xuất hiện từ cuối 1998 và trở nên trầm
trọng vào 1999. Ở ĐBSCL, bệnh thường xuất hiện trong suốt mùa lũ. Tuy
nhiên bệnh bộc phát cao điểm vào tháng 7 và 8. Bệnh đốm trắng trên gan xuất
hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá giống và cá thịt, ở cả cá nuôi ao và
nuôi bè.
2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri
Vi khuẩn E. ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn gram âm,
hình que, kích thước thay đổi, di động yếu ở 25-30°C, ở nhiệt độ cao hơn
không di động, H
2
S và indole âm tính, có khả năng lên men O/F. Cho phản
ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng oxydase. E. ictaluri phát
triển tốt ở 28
o
C trên môi trường TSA trong 48h tạo thành những khuẩn lạc
màu trắng đục kích thước rất nhỏ, không có nhân, rìa có dạng không đồng
nhất (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
Tuy nhiên Plumb (1993) cũng có một số mô tả khác như có dạng hình que và
kích thước biến đổi. So với E. tarda phát triển tốt ở 37
o
C trong khi E. ictaluri
phát triển tốt ở 28
o
C, điều này lý giải vì sao vi khuẩn E. tarda ngoài gây bệnh
trên cá còn gây bệnh trên nhiều loài động vật máu nóng khác như chim, gia
súc, heo, động vật có vú ở biển. E. ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá.
Dấu hiệu bệnh lý
Theo Lê Thị Bé Năm (2002), cá bị bệnh thường giảm hoặc bỏ ăn, cá nổi trên
mặt nước, bơi lội chậm chạp, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với

tiếng động, màu sắc nhợt nhạt. Một số cá bụng sưng và có những điểm xuất
huyết trên đuôi, hậu môn, các tia vi. Bên trong cá bụng trương to, có những
đốm trắng đường kính 1-3mm dưới bề mặt lớp biểu bì và khắp vùng gan, thận
và tỳ tạng. Ngô Minh Dung (2007) cũng có những mô tả tương tự khi thí
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 6 -
nghiệm gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá tra. Tuy nhiên đa số cá không có
biểu hiện bất thường bên ngoài (Từ Thanh Dung, 2004).
2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm
Theo Wolter và Johnson (1994) khi gây cảm nhiễm trên cá nheo Mỹ (từ 15-
20cm) với mật độ vi khuẩn E. ictaluri 1,2 x 10
6
tb/0,1ml ở 25
0
C, tốc độ nước
chảy 1lít/phút, cho ăn 3% trọng lượng thân/ ngày. Tỉ lệ cá chết dao động từ 38
– 95.3%. Trong thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri của Phan Thị Mỹ
Hạnh (2004), với mật độ vi khuẩn tương đương 1,5x10
6
tb/ml nhưng tỉ lệ chết
trên cá tra cao hơn so với cá nheo Mỹ ở cùng thời gian thí nghiệm 7 ngày.
Lương Trần Thục Đoan (2006) tiến hành gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá tra
bằng hai phương pháp ngâm và tiêm với các mật độ vi khuẩn khác nhau, thời
gian theo dõi trong 10 ngày. Kết quả cho thấy ở phương pháp ngâm cá bắt đầu
chết vào ngày thứ 3, tỷ lệ chết 75% với mật độ vi khuẩn là 1x 10
7
CFU/ml.
Với phương pháp tiêm, thời gian xuất hiện cá chết là ngày thứ 2, tỷ lệ chết
100% trong 6 ngày với mật độ vi khuẩn 1x10
6

CFU/ml.
Với thí nghiệm gây cảm nhiễm của Huỳnh Chí Thanh (2007), kết quả cho thấy
cá biểu hiện bệnh lý sớm nhất ở mật độ vi khuẩn 1,02x10
8
CFU/ml với tỷ lệ
91,66%. Với các mật độ 1,02x10
7
CFU/ml, 1,02x10
6
CFU/ml, 1,02x10
5

CFU/ml có tỷ lệ chết tương ứng là 66,66%, 33,33 % và 25%. Qua đó xác định
được LD
50
là 3,16x10
6
CFU/ml.
Theo nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II kết hợp với
công ty thuốc Thú Y TW (Navetco) (2008) sau khi phân lập và định danh vi
khuẩn cho thấy 97% mẫu cá bệnh đều có dấu hiệu điển hình của bệnh đốm
trắng với sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri. Tiến hành thí nghiệm cảm
nhiễm ngược, vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là vi khuẩn E. ictaluri được
phân lập từ các mẫu cá bệnh. Kết quả nghiên cứu đã xác định, vi khuẩn E.
ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên gan, thận và lách cá tra. Kết quả
thí nghiệm cũng xác định được liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD
50
) là 2,5
x 10
4

tế bào/0,2 ml/ cá có trọng lượng trung bình khoảng 30 gram (Nguyễn
Thị Hiền, 2008).
2.3 Chiết tách acid nucleic
Mỗi thí nghiệm thao tác gen đều đòi hỏi phải có nguồn acid nucleic đủ lớn và
đủ tinh sạch. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết acid nucleic
là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân
hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học
(phân tử bị thủy giải bởi các enzym nội bào giải phóng ra môi trường khi tế
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 7 -
bào bị phá vỡ). Các acid nucleic cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ
thấp để ức chế hoạt động của các enzym nội bào. (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), phương pháp tách chiết cơ bản gồm có
ba bước:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Thông thường nghiền tế bào, mô
trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này
sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng
thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong dung dịch phenol và chloroform, dung
dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan acid
nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa
acid nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha
phenol:chloroform. Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa acid nucleic. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid
nucleic ở dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các
enzym, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ
mong muốn. Có hai cách tủa thông dụng:
- Tủa trong ethanol (ethylic alcohol), việc tủa này được thực hiện trong

môi trường có nồng độ muối cao và nồng độ ethanol cao (2,5 dung tích
ethanol/1 dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa. Hầu
như toàn bộ acid nucleic đều tủa trong các điều kiện nêu trên.
- Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là
không cần sự hiện diện của muối , thể tích isopropanol/thể tích mẫu là
1/1. Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, do đó có thể
loại chúng ra khi dùng cách tủa trong isopropanol.
Trong cả hai phương pháp, acid nucleic sẽ được thu nhận lại bằng cách ly tâm.
Sau đó cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các
dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu.
2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được phát minh từ năm 1985 và được thừa
nhận chính thức từ năm 1993 qua giải thưởng Nobel cho Kary Mullis - người
phát minh ra nó, PCR hiện đang được ứng dụng rộng khắp tại Việt Nam.
Nguyên tắc (Đặng Thị Hoàng Oanh 2007)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 8 -
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những
đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn,
và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi
chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA thì chỉ đoạn
DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và
một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi
chu kỳ gồm ba giai đoạn sau:
Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn
nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95
o

C trong vòng 30 giây
đến 1 phút.
Giai đoạn lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép mồi bắt
cặp với khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-
70
o
C, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau
và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72
o
C, đó là điều kiện tốt nhất để
cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ
sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymerase hoạt động. Thời
gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30
giây đến nhiều phút.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được
nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn
cho chu kỳ nhân bản tiếp theo. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được
tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2
n
bản
ADN từ một khuôn ban đầu.
Đối chứng
Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần có những đối chứng sau:
- Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để
kiểm soát trường hợp trường hợp bị tạp nhiễm.
- DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được
khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ.
Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

- 9 -
Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005), phản ứng PCR có các nhân tố
ảnh hưởng sau:
- ADN mẫu: Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu ADN không được dài
quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn ADN dài khoảng 1 –
1.5kb. Mẫu ADN tinh sạch sẽ cho kết quả tốt , tuy nhiên kỹ thuật chẩn
đoán bằng phương pháp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu
ADN không cần có độ tinh sạch cao.
- Enzyme ADN-polymerase: Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào
khả năng chịu nhiệt của enzyme polymerase do phản ứng luôn phải
thực hiện ở nhiệt độ khác nhau. Enzyme thường được dùng là Taq-
polymerase có nguồn gốc vi khuẩn (Thermus aquaticus) tách từ suối
nước nóng nên chịu được nhiệt độ cao. Nhược điểm của enzyme này là
không tổng hợp được trình tự ADN dài quá 3kb, hơn nữa enzyme này
không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép.
- Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi: Mồi là một chỉ tiêu quan trọng để
đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Chọn mồi phải
tuân theo nguyên tắc sau đây:
• Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và
mồi ngược, và cũng không tạo những cấu trúc kẹp tóc.
• Mồi phải chọn đặc trưng cho ADN cần khuếch đại và không trùng
với các trình tự lặp lại trên gen
• Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb)
• Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ
hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30
nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp.
• Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thường
trong khoảng từ 4-5
0
C, và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng

72
0
C.
- Ảnh hưởng của các nucleotide: Cần phải có bốn loại nucleotide dạng
triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ mỗi loại
nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20 - 200µM cho mỗi
loại nucleotide. Nếu mất trạng thái cân bằng sẽ gây ra lỗi khi sao chép,
nếu nồng độ các nucleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao
chép giả.
- Môi trường phản ứng
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 10 -
• Ion Mg
2+
là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR,
nồng độ Mg
2+
tối ưu để thực hiện PCR từ 150-200µM. Nồng độ
chuẩn cho từng khoản tương ứng, phải được xác định trong điều
kiện thí nghiệm nhất định.
• Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không
chứa bất kỳ ion lạ nào. Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và
các enzyme phân hủy acid nucleic.
• Môi trường dung dịch đệm phải ổn định.
- Thời gian và số lượng chu kỳ: Tổng thời gian cho mỗi bước của một
chu kỳ và của chu kỳ đầu với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau. Ngoài
ra thời gian cho mỗi phản ứng còn phụ thuộc vào độ dài đoạn ADN cần
nhân dòng. Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường
trong khoảng từ 30 đến 40 chu kỳ.
- Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt

độ nhanh và chính xác. Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình
phản ứng. Tuy nhiên, với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết bị và dụng
cụ khuếch đại riêng.
Ứng dụng của phương pháp PCR
Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc
phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh
thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm:
virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan
tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng Taura (TSV)
(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
Theo Lê Đình Lương (2004) kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong
khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội.
- Trong nghiên cứu khoa học kỹ thuật PCR giúp phát hiện đột biến, cho
phép phân tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu
quá trình tiến hóa ở mức phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gen
đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm.
- Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng, kỹ thuật PCR cho phép lựa
chọn cặp cha mẹ làm giống chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ.
- Trong y học PCR có thể chẩn đoán chính xác các bệnh truyền nhiễm do
virus, vi khuẩn, HIV-AIDS…
Các hạn chế của phương pháp PCR
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 11 -
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007), phương pháp PCR có các hạn chế sau:
- Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những
đoạn DNA lớn hơn 3kb
- Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước.
- Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì
enzym gắn sai 1 nucleotic)
Một số nghiên cứu về PCR

Yang và ctv (2006) đã phát triển phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời hai
loại virus IHHNV và WSSV trên tôm he. Với đoạn mồi I 2814, I 3516 và W1,
W2 lần lượt cho hai loại bệnh trên với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR
lần lượt là 703 và 824bp (trích dẫn bởi Nguyễn Trúc Phương, 2008).
Trần Thị Mỹ Duyên (2006) đã ứng dụng và tối ưu hóa qui trình PCR-
genotyping với các thay đổi về thành phần hóa chất tham gia phản ứng, chu kỳ
nhiệt của phản ứng thu được qui trình tối ưu phát hiện tác nhân gây bệnh đốm
trắng trên tôm sú.
Lê Hữu Thôi (2008) thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời YHV,
GAV và β-actin. YHV và GAV là hai bệnh do virus trên tôm sú gây thiệt hại
nặng đến nghề nuôi tôm của nước ta. Phương pháp giúp phát hiện đồng thời
hai loại bệnh này trên tôm đồng thời kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong
qui trình thông qua gen nội sinh β-actin. Kết quả sản phẩm PCR cho hai vạch
750 bp (YHV) và 216 bp (β-actin) ở bước 1 và 317 bp (GAV) ở bước 2.
Trần Nguyễn Diễm Tú (2008) thực hiện qui trình phát hiện WSSV, HPV và β-
actin trên tôm sú. Cũng như YHV và GAV, WSSV và HPV là hai bệnh gây
thiệt hại nặng nề đến nghề nuôi tôm sú của nước ta. Kết quả sản phẩm PCR
cho hiện vạch ở vị trí 1441 bp (WSSV) và 216 bp (β-actin) ở bước 1 và 941
bp (WSSV), 441 bp (HPV), 216 bp (β-actin) ở bước 2.
Victor và ctv (2007) phát triển phương pháp m-PCR phát hiện cùng lúc ba loài
vi khuẩn gây bệnh trên cá : Flavobacterium Columnare (504bp), E. Ictaluri
(407bp), Aeromonas Hydrophyla (209bp).
Gần đây nhất, Nguyễn Trúc Phương (2008) đã định danh E. ictaluri bằng
phương pháp truyền thống và bằng bộ kit API20E, sau đó tiến hành kiểm tra
lại bằng phương pháp PCR. Kết quả cho thấy 5 trong 7 chủng đã được định
danh là E. ictaluri với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR là 407bp.
Nguyễn Văn Hòa (2008), dùng qui trình chiết tách acid nucleic theo phương
pháp Phenol-Chloroform (Taggart et al, 1992) ly trích ADN từ cơ thịt cá lóc,
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 12 -

sản phẩm thu được sau khi điện di trên agarose 1% cho sản phẩm có kích
thước phân tử lớn hơn 1kb. Dùng ADN ly trích được thực hiện phản ứng PCR,
sản phẩm thu được có kích thước khoảng 300-400 bp.


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 13 -
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ tháng 01/2009 đến tháng 06/2009.
Địa điểm thu mẫu: Thu mẫu từ cá gây cảm nhiễm ở thí nghiệm LD
50
của bộ
môn sinh học và bệnh thủy sản - khoa Thủy Sản.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản – Khoa
Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Dụng cụ và hóa chất
3.2.1 Dụng cụ
3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn
- Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt
- Ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh
- Chai 100ml, 250ml, 500ml
- Lame, lamelle
- Viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn
- Tủ ấm, nồi thanh trùng
3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR
- Ống tub 1.5ml, 0.5ml, 0.2ml, khay đựng ống tub, que nghiền
- Cân điện tử
- Micropipet các loại

- Đầu col các loại
- Máy ly tâm lạnh
- Máy ủ mẫu
- Máy vortex
- Máy đo ADN
- Máy PCR
- Bộ điện di (nguồn và bồn điện di)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 14 -
- Bàn đọc UV và máy chụp hình gel
- Lò viba
- Tủ hút, tủ lạnh
3.2.2 Hóa chất
3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn
- Cồn tuyệt đối, NaCl, H
2
O
2

- Vaselin, nước cất
- Hóa chất nhuộm gram
- Amyl alcohol, ethanol, axit sulphanilic, axit acetic
- Dầu paraffin
- Glucose
- Oxidase thương mại
Môi trường
- Môi trường thạch: Tryptic soy agar (TSA), Nutrient agar (NA)
- Môi trường lỏng: Nutrient broth (NB)
- Môi trường OF
3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR

- Ethanol
- Lysis buffer: 0.5M NaCl; 0.001M EDTA; 1% Sodium Dodecyl Sulfate
(SDS); 0.8% Triton; 0.1M Tris-HCl
- SDS 10%
- Proteinase K
- RNase-A
- Chloroform-Isoamyl (24:1)
- Phenol-Chloroform-Isoamyl (25:24:1)
- Isopropanol
- Cồn 70%
- TE buffer (10mM Tris, 1mM EDTA, pH=7)
- Buffer 10X, MgCl
2
, dNTPs (10mM), Taq polymerase (5u), mồi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 15 -
- Agarose
- TAE 0,5X
- Loading dye
- Ethidium bromide
- Nước tiệt trùng 2 lần
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm
3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể
- Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200ppm,
phơi khô.
- Cấp nước vào bể, có sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine.
- Đối với bể lớn 2m
3
để trữ cá thì cấp nước khoảng 2/3 bể, có sục khí

trước 1-2 ngày khi thí nghiệm. Bể được đặt ngoài trời nơi có mái che
(tránh mưa).
- Đối với bể thí nghiệm 100L thì cấp khoảng 60L nước, sục khí. Bể được
đặt trong phòng kín nhiệt độ phòng 26-28
0
C.
- Nước sử dụng là nguồn nước máy.
- Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, vợt, ống sục khí, đá bọt…cũng được
vệ sinh kỹ.
3.3.1.2 Cá thí nghiệm
- Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15-20g/con, da sáng, phản ứng linh
hoạt.
- Cá mua về được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức ăn
công nghiệp, cho ăn theo nhu cầu của cá.
- Cá được nuôi dưỡng khoảng 1 tuần trước khi thí nghiệm được tiến
hành
3.3.1.3 Vi khuẩn để gây cảm nhiễm
Sử dụng nguồn vi khuẩn trữ trong tủ -80
0
C của bộ môn sinh học và bệnh học
thủy sản, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 16 -
Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường NA/TSA ở 28
0
C. Sau 24-48 giờ quan
sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi
khuẩn.
Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt
trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt
trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000
vòng/phút ở 4
0
C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và
dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần).
Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25ml
dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex.
Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước
sóng 590nm và điều chỉnh OD tương ướng để xác định mật độ vi khuẩn.
OD=0.1±0.02 tương ướng mật độ vi khuẩn là 10
8
cfu/ml.
3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm
thức đối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại
3 lần với mật độ 10 con/bể.
Ø Nghiệm thức không tiêm.
Ø Nghiệm thức đối chứng: Tiêm nước muối sinh lý.
Ø Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
2
CFU/ml).
Ø Nghiệm thức 2: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
3
CFU/ml).
Ø Nghiệm thức 3: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
4
CFU/ml).

Ø Nghiệm thức 4: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
5
CFU/ml).
Ø Nghiệm thức 5: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
6
CFU/ml).
Ø Nghiệm thức 6: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
7
CFU/ml).
Thí nghiệm xác định LD
50
được tiêm với 6 mật độ khác nhau là 10
3
đến 10
8

CFU/ml đối với chủng A1 . 3 chủng còn lại tiêm từ 10
2
đến 10
7
CFU/ml.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version