nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus) ở tỉnh trà vinh, bến tre và cần thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






CHÂU HUỲNH THÙY TRÂM







NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA NHÓM
VI KHUẨN Pseudomonas spp. TRONG MÔI TRƯỜNG
AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Ở
TỈNH TRÀ VINH, BẾN TRE VÀ CẦN THƠ








LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Cần Thơ, 5/2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm tạ cô Từ Thanh Dung đã hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện
cho em hoàn thành đề tài cũng như được tiếp xúc thực tế ở ao nuôi thủy sản.
Xin gởi lời cảm ơn quí thầy cô khoa thủy sản đã truyền đạt kiến thức quý báu
trong quá trình học cũng như trong thời gian thực hiện đề tài.
Xin gởi đến cha mẹ, cậu, các chị và các em lời cám ơn chân thành, là nguồn động
viên tinh thần trong suốt thời gian qua.
Xin gởi đến chị Phạm Thanh Hương lời cám ơn sâu sắc về sự giúp đỡ nhiệt tình và
đóng góp nhiều ý kiến quí báu cho tôi hoàn thành đề tài.
Xin chân thành cám ơn chị Châu Hồng Thúy và các anh chị làm việc trong phòng
thí nghiệm trường Đại học Trà Vinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong
quá trình thu và phân tích mẫu ở tỉnh Trà Vinh.
Chân thành cám các anh chị cán bộ trong khoa cùng tập thể lớp bệnh học thủy sản
31 đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT
Mục tiêu của đề tài là đánh giá sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn

Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus), để có cách nhìn sâu sắc hơn về thuốc kháng sinh, từ đó đưa ra
biện pháp kiểm soát việc sử thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản một cách
triệt để hơn. Trước hết, tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn Pseudomonas
spp. từ trong môi trường ao nuôi cá tra ở một số hộ ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và
Cần Thơ. Sau đó tiến hành làm kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh và chọn ra 4
chủng để xác định MIC với 3 loại thuốc (oxytetracycline hydrochloride,
chloramphenicol, streptomycin) bằng phương pháp pha loãng. Kết quả cho thấy đa
số các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. kháng với các loại kháng sinh thử
nghiệm, trong đó tất cả các chủng vi khuẩn kháng với cefazolin (CEZ/30 µg),
ampicillin (AM/10 µg), kháng ít nhất với doxycycline (DO/30µg) (6,7%) (xem
Bảng 4.1). Mặc khác, thấy có 13 chủng trong 30 chủng vi khuẩn thí nghiệm kháng
với 2 loại kháng sinh trở lên. Giá tri MIC của các chủng vi khuẩn với
chloramphenicol nằm trong khoảng từ 32 đến >256 µg/ml , với oxytetracycline là
8-128 µg/ml, với streptomycine là 4 đến >256 µg/ml.



PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii
MỤC LỤC
MỤC LỤC
Phần I : ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu của đề tài 2
1.3 Nội dung của đề tài 2
Phần II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Đặc điểm và bệnh do Pseudomonas spp. trong nuôi thủy sản 3
2.1 Vi khuẩn Pseudomonas 3
2.2 Một số nghiên cứu về Pseudomonas spp. trong môi trường 4

2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi thủy sản 5
2.3.1 Thuốc kháng sinh 5
2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn 6
2.3.3 Sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas 7
Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 10
3.2 Vật liệu nghiên cứu 10
3.2.1 Dụng cụ 10
3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu 10
3.3 Phương pháp nghiên cứu 11
3.3.1 Địa điểm thu mẫu 11
3.3.2 Mẫu vi khuẩn 11
3.3.3 Phương pháp thu mẫu 11
3.3.4 Phương pháp đếm mật độ vi khuẩn 11
3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 12
3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ 12
3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 13
Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16
4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn 16
4.2 Kết quả lập kháng sinh đồ 17
4.2.1 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh 17
4.2.2 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh 19
4.3 Kết quả làm MIC
Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 24
5.1 Kết luận 24
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
5.2 Đề xuất 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO 25
PHỤ LỤC 29

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH MỤC BẢNG HÌNH
Hình 2.1 Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và
con người (Prescott et al., 2000) 7
Hình 4.1 Vi khuẩn trên môi trường GSP 16
Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram (100X) 16
Hình 4.3 Kết quả test O/F 16
Hình 4.4 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh 18
Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ chủng PTV085 18
Hình 4.6 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh 19
Bảng 4.1: Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh 17
Bảng 4.2: Kết quả giá trị MIC của 4 chủng Pseudomonas spp. 3 kháng sinh
chloramphenicol, oxytetracycline, streptomycin 21







PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
Phần 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Việt Nam có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh. Cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi chính của
cả nước, không chỉ đáp ứng cho nhu cầu thực phẩm trong nước mà còn là mặt

hàng xuất khẩu quan trọng, vì thế diện tích và sản lượng không ngừng gia
tăng. Điển hình năm 2007, diện tích mặt nước nuôi cá tra và cá basa là 6.000
ha (tổng diện tích đất 9.000 ha) diện tích nuôi tăng gấp 6 lần so với năm 1997,
sản lượng đạt 1 triệu tấn tăng gấp 45 lần so với năm 1997 (22.500 tấn)
(Dzung, 2007).
Để đáp ứng nhu cầu thị trường, nghề nuôi cá tra phát triển ở mức độ
thâm canh ngày càng cao dẫn đến nhiều bệnh thường xuyên xảy ra và việc sử
dụng thuốc kháng sinh phổ biến trong nuôi thủy sản đã làm cho hiện tượng
kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng. Theo khảo sát của Mai Văn Tài và
ctv. (2004) ở 6 mô hình nuôi và sản xuất giống thủy sản thì có đến 138 loại
thuốc kháng sinh được sử dụng. Trong môi trường nuôi cá tra (ở vùng nước
ngọt) có nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau, sự kháng thuốc của các nhóm vi
khuẩn này cũng đã được xác định bởi một số nghiên cứu: Sarter et al. (2007)
nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn Gram âm (Enterobacteriaceae
(49,1%), Pseudomonads (35,2%) và Vibrionaceae (15,7%)) trong ao nuôi cá
tra và cá ba sa ở vùng ĐBSCL. Nghiên cứu của Stock and Wiedemann (2001)
về sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loại kháng sinh của 102 chủng
Edwardsiella bao gồm E. tarda (42 chủng), E. ictaluri (41 chủng) và E.
hoshine (19 chủng). Và tiêu biểu nhất là nghiên cứu của Từ Thanh Dung
và ctv. (2008) về hiện trạng kháng thuốc của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan
thận mủ trên cá tra ở ĐBSCL.
Tỉnh Trà Vinh có 29.187 ha đất nuôi trồng thủy sản, trong đó nuôi
trồng thủy sản nước lợ, mặn chiếm 96% đất nuôi trồng thủy sản. Năm 2007,
tổng sản lượng thủy sản của Trà Vinh đạt 149.000 tấn, trong đó sản lượng do
nuôi trồng đạt hơn 84.000 tấn chiếm đến 81% tổng giá trị sản phẩm do ngành
thủy sản mang lại (Ðặng Văn Bường, 2008). Sau khi cá tra được nuôi thử
nghiệm thành công ở vùng nước lợ thuộc ấp 5, xã Bình Thắng, huyện Bình
Đại, tỉnh Bến Tre vào những ngày đầu năm 2008, có khả năng cá tra sẽ mở
rộng diện tích nuôi ở vùng nước lợ. Nhưng tính đến thời điểm hiện nay chưa
có tác giả nào công bố về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong ao nuôi cá tra ở

vùng nước lợ. Vì thế đề tài “Nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Đánh giá sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp. trong
môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), để có cách nhìn
sâu sắc hơn về thuốc kháng sinh, từ đó đưa ra biện pháp kiểm soát việc sử
thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản một cách triệt để hơn.
1.3 Nội dung của đề tài
− Phân lập, định danh vi khuẩn Pseudomonas spp. trong môi trường
nuôi cá tra ở tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ.
− Xác định sự kháng thuốc của vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas spp.
bằng phương pháp lập kháng sinh đồ theo Kirby Bauer.
− Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- Minimum Inhibitory
Concentration) của vi khuẩn Pseudomonas spp. với một số loại kháng sinh.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm và bệnh do Pseudomonas spp. trong nuôi thủy sản
Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình
que thẳng hoặc cong mãnh, không có khả năng sinh bào tử, kích thước 0,5-1,0
x 1,5-5,0 µm, thường di động với một hoặc nhiều roi, hiếu khí bắt buộc. Hầu
hết Pseudomonas có oxidase dương tính, nhưng thỉnh thoảng có chủng
oxidase âm tính xuất hiện. Vi khuẩn tạo sắc tố vàng - xanh, xanh và xanh
nhạt. Nhiệt độ thích hợp cho Pseudomonas phát triển là 4-43
0
C, phát triển tốt

ở nhiệt độ thấp. Pseudomonas phân bố khắp nơi trong môi trường, trong đất
và nước, là tác nhân cơ hội gây bệnh trên người, động vật và thực vật. Vi
khuẩn phân lập được từ bên ngoài và trong nội tạng của cá, gây bệnh trên cá
chủ yếu là P. fluorescens, P. chlororaphis và P. anguilliseptica, gây nhiễm
trùng máu trong điều kiện nhiệt độ cao và quản lý không phù hợp (Inglis and
Hendrie, 1993). Pseudomonas spp. là mầm bệnh trên nhiều đối tượng nuôi
thủy sản kinh tế quan trọng, gây tỉ lệ tử vong khá cao (Từ Thanh Dung, 2008).
Pseudomonas anguilliseptica được thông báo đầu tiên gây bệnh đốm
đỏ (red spot disease – RSD hay Sekiten-byo) trên cá chình ở Nhật Bản bởi
Wakabayashi & Egusa vào năm 1972. Theo Muroga et al. (1975), cá chình
Nhật Bản (Anguilla japonica) nhạy cảm với P. anguilliseptica hơn cá chình
châu Âu (Anguilla anguila). Vi khuẩn này có thể phân lập từ gan, tỳ tạng, tim
và trong máu cá bệnh, khuẩn lạc nhỏ trên môi trường NA sau 72h ủ ở 25
o
C.
Ngược lại, P. fluorescens phát triển tốt trên môi trường NA ở 22-25
o
C và tạo
sắc tố màu vàng – xanh, tạo sắc tố huỳnh quang dưới đèn cực tím. (được trích
dẫn bởi Inglis and Hendrie, 1993).
Kobayashi et al. (2004) xác định tác nhân gây bệnh ở cá thu từ các ao
nuôi ở Wakayama Prefecture là vi khuẩn Pseudomanas plecoglossicida bằng
kỹ thuật ngưng kết trên lam với kháng thể P. plecoglossicida FPC941. Bằng
phương pháp mô học đã phát hiện những tổn thương ở tỳ tạng, thận, gan, ruột,
tim và mang, xuất hiện những vết hoại tử đi kèm với sự xuất huyết, đông máu
và trương phòng ở phần tủy của tỳ tạng, biểu bì mô và trong thận. Ở gan cũng
có hiện tượng hoại tử và sự hình thành vùng áp-xe. Tuy nhiên, ruột, tim và
mang chỉ bị vi khuẩn P. plecoglossicida tấn công ở mức không đáng kể,
không có sự tổn thương hoặc vi khuẩn không xuất hiện ở não.
Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2005), bệnh đốm đỏ xuất hiện trên tất cả

các loài cá nuôi và cá tự nhiên (cá trắm cỏ, cá tra, cá basa, ếch…), có 4 mức
độ và trạng thái bệnh của cá: Bệnh ác tính- không biểu hiện triệu chứng đặc
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
trưng, từ khi xuất hiện đến khi cả đàn cá bị bệnh khoảng 10-30 ngày, thời gian
ủ bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ và chất lượng nước; Bệnh cấp tính- có biểu
hiện triệu chứng bệnh nhưng không đầy đủ, khoảng 40-50% đàn cá mắc bệnh,
số lượng cá chết rất lớn trong vài ngày; Bệnh thứ cấp tính- biểu hiện xuất
huyết từng đốm đỏ trên da, hai bên thân nhất là vùng bụng bị xuất huyết, ứ
máu đỏ bầm, vảy dựng lên, bụng phình to…, 30-40% đàn cá bệnh thì đàn cá
bơi lội uể oải, lờ đờ, chậm chạp, ở cá khỏi bệnh có nhiều vết sẹo và sinh
trưởng chậm hơn bình thường 2-3 lần; Bệnh mãn tính- kéo dài trong suốt quá
trình nuôi, tỉ lệ chết khoảng 10% đàn cá, cá khi thu hoạch có nhiều vết sẹo
hoặc nhiều chỗ loét chưa lành.
Phan Thị Vân và ctv. (2002) xác định tỉ lệ nhiễm Pseudomonas
fluorescens phân lập được từ cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ và xuất huyết lần lượt
là 23,6-45,2% và 0-7,8%, bệnh đốm đỏ xuất hiện chủ yếu ở cá trên một tháng
tuổi, bệnh xảy ra quanh năm, cao điểm là từ tháng 4-5 và tháng 10-11.
Bên cạnh những loài thuộc giống Pseudomonas gây bệnh, thì cũng có
những loài có ích, cụ thể là P. stutzeri có khả năng khử nitrate cơ bản dựa trên
hoàn toàn bộ gen mã hóa cho các enzyme dị hóa nitrate chứa bên trong chúng
bao gồm: gen nar (nitrate reductase) , gen nir (nitrite reductase), gen nor
(nitrite oxide reductase), gen nos (nitrous oxide reductase)(Lalucat et al.,
2006) . Quá trình khử nitrate thành nitơ phân tử nhờ các vi khuẩn khử nitrate
trong đó có vi khuẩn P. stutzeri, chúng khử NO
3
-
qua các sản phẩm trung gian
đến sản phẩm cuối cùng là N
2

không khí (Lương Đức Phẩm, 2007). Khả năng
khử nitrate là một đặc tính bền vững của vi khuẩn P. stutzeri, loài vi khuẩn
này là một trong những loài vi khuẩn dị dưỡng khử nitrate hiệu quả nhất và
được xem là một hệ thống chuẩn của quá trình khử nitrate bằng vi khuẩn
(Zumft, 1997). Carlson et al. (1983) đã nghiên cứu về khả năng khử nitrate
của vi khuẩn P. stutzeri, P. aeruginosa và Paracoccus denitrificans. Kết quả
cho thấy rằng P. stutzeri chỉ tạo ra sản phẩm là khí nitơ trong khi
P. aeruginosa tạo ra nhiều khí N
2
O hơn là N
2
. Thêm vào đó một bất lợi là vi
khuẩn P. aeruginosa làm giảm lượng nitrate (NO
3
-
), nitrite (NO
2
), nitrous
oxide (N
2
O) chậm và không có khả năng sinh trưởng hiếm khí trong khi đó thì
điều hoàn toàn có thể được thực hiện bởi vi khuẩn P. stutzeri. Vì thế P.
stutzeri được ứng dụng xử lý đạm trong ao nuôi cá tra (được Đặng Thị Bé
trích dẫn, 2008).
2.2 Một số nghiên cứu về Pseudomonas spp. trong môi trường
Nghiên cứu của Kennedya et al. (2006) về phức hệ vi sinh vật (VSV)
trong trại sản xuất giống tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), tổng số
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
vi khuẩn có trong nước giếng khoan, nước biển và nguồn nước cấp từ 10

1
- 10
5

cfu/ml, số lượng vi khuẩn chiếm mật số cao hơn trong nước bể ương. Vi
khuẩn Vibrio hiện diện trong môi trường nước của bể nuôi khoảng 10
1
– 10
3

cfu/ml trong khi mật độ vi khuẩn có ở mẫu ấu trùng 10
2
– 10
4
cfu/10 ấu trùng.
Phần lớn loại vi khuẩn chiếm ưu thế là gram âm gồm các giống Aeromonas
spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp., Baccillus spp. và vi khuẩn gram dương
không hình thành bào tử. Với kết quả phức hệ VSV trong hệ thống nuôi tôm
càng xanh này đang trong điều kiện bình thường. Số lượng và chất lượng hệ vi
sinh vật trong hệ thống nuôi đã giúp định hướng được sự biến động của hệ
VSV trong trại giống và có thể dự đoán sự bộc phát của bệnh dịch (Dương Thị
Mỹ Hận trích dẫn, 2007).
Theo kết quả nghiên cứu về số lượng và chất lượng hệ vi sinh vật trong
ao đất nuôi cá rô phi lai ở Saudi Arabia, mật số vi khuẩn (colony forming units
- cfu) ở trong phạm vi từ 5,6 ± 0,8 × 10
3
đến 2,4 ± 1,2 × 10
4
cfu /ml trong
nước ao; 9,3 ± 1,1 × 10

6
đến 1,9 ± 1,5 × 10
8
cfu /g trong bùn. Phân lập được
15 giống vi khuẩn và 18 loài. Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn trong nước ao và
bùn đáy sẽ phản ánh được vi khuẩn trên mang và nội tạng cá rô phi, vi khẩn
trên mang đa dạng hơn vi khuẩn trong nội tạng. Trong đó, Pseudomonas spp.
cũng chiếm ưu thế so với vi khuẩn khác (10,1%) trong mẫu nước, còn trong
bùn ít hơn trong nước với Pseudomonas spp. 4,57% và có thêm P. fluorescens
1,37% (Al-Harbi and Uddin, 2003).
Akinbowale et al. (2005) đã phân lập được nhiều giống vi khuẩn từ môi
trường nuôi thủy sản (cá nước ngọt và lợ, giáp xác): Vibrio spp. chiếm 60%,
Aeromonas spp. 21%, Photobacterium spp. 4%, Pseudomonas spp. 4%,
Citrobacter spp. 2%, E. tarda 2%, Hafnia alvei 1%, Flavobacterium spp. 2%,
Plesiomonas shigelloides 1% và vi khuẩn gram dương (Staphylococcus và
Micrococcus spp.) chiếm 4% trong nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi
khuẩn được phân lập từ các nguồn thủy sản ở Úc.
Sazakli et al. (2005) phân lập được 160 chủng Pseudomonas từ nhiều
nguồn nước khác nhau (nước biển, nước cất, nước đóng chai…) ở Greece,
trong đó P. aeruginosa chiếm đa số 61 chủng (38%), tiếp theo là 30 chủng
(19%) P. stutzeri, còn lại là P. alcaligenes, P. putida, P. fluorescens, P.
mendocina.
2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi thủy sản
2.3.1 Thuốc kháng sinh
Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn
gốc sinh học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra), hay do con người tổng
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
hợp nên, có tác dụng một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu trong
chu trình biến dưỡng của vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của nấm (tác nhân

kháng nấm), của virus (tác nhân kháng virus) (được trích dẫn bởi Lê Thị Kim
Liên và ctv., 2008).
Người đầu tiên phát hiện chất kháng sinh là bác sĩ người Anh
Alexander Fleming (1881-1955). Năm 1928 ông là người đầu tiên tách được
chủng nấm Penicilium notatum sinh chất kháng sinh penicilin, mở ra một kỷ
nguyên mới cho việc đẩy lùi nhanh chóng các bệnh nhiễm khuẩn.
Năm 1944, Waksman (người Mỹ gốc Nga) phát hiện ra Streptomycine
và nhận giải Nobel vào năm 1952. Tiếp theo, hàng loạt chất kháng sinh quan
trọng khác đã được phát hiện và ứng dụng như: Bacitracin (1945),
chloramphenicol (1947), polimixin (1947), chlortetracyclin (1948),
cephalosporin (Brotzu, 1948), neomycin (1949), eritromicine (1952),
validacine (1970)…(được trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002).
2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn
Theo Bùi Thị Tho (2003), sự kháng thuốc của vi khuẩn được chia thành
2 loại: Một là kháng thuốc tự nhiên: Bản thân vi khuẩn bình thường đã có sẵn
những men hay một chất x nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng
sinh. Hoặc có thể loại vi khuẩn đó không vị trí công kích, điểm tác động của
chất kháng sinh. Ví dụ: Các vi khuẩn Gram âm không chịu tác dụng của
Penicilin. Hai là kháng thuốc thu được: Vi khuẩn thu được những yếu tố
kháng thuốc trong quá trình sống do sự đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc
(Nicholas F. N, 1987). Khi có được các yếu tố kháng thuốc – plasmid, factor
R, hay episome, nó có khả năng truyền ngang các yếu tố kháng này giữa các
chủng cùng loài và giữa các loài với nhau.
Theo Clowes (1973), Cohen (1965,1982), Johnson (1994)… có 3
phương thức mà vi khuẩn có thể truyền gen kháng thuốc theo chiều ngang là
sự biến nạp, tải nạp và tiếp hợp (được Bùi Thị Tho trích dẫn, 2003).
Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2005), nguyên nhân dẫn đến hiện tượng
kháng thuốc bao gồm: Một là sự kháng thuốc kháng sinh do sử dụng không
đúng loại, liều lượng sẽ dẫn đến việc tạo các dòng vi khuẩn kháng thuốc, đây
cũng là nguyên nhân chính gây ra sự thất bại về sản lượng thu hoạch tôm

Đài Loan năm 1989; Hai là việc sử dụng thuốc kháng sinh ban đầu có thể sẽ
mang lại tỉ lệ sống cao hơn nhưng lại sẽ tạo ra những dòng vi khuẩn kháng
thuốc khó trị. Sự quay vòng trong việc sử dụng thuốc kháng sinh cũng góp
phần tạo ra những dòng vi khuẩn kháng nhiều loại thuốc (đa kháng). Sự kháng
thuốc có thể là do sự phát sinh ra cơ chế miễn dịch trong hệ di truyền của vi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
khuẩn. Do đó, sự kháng thuốc có thể được chuyển từ loại vi khuẩn này sang vi
khuẩn khác.
Để hạn chế khắc phục những nguyên nhân trên cần phải: Chuẩn đoán
đúng bệnh để cho đúng thuốc và sử dụng đúng liều lượng thuốc, đúng thời
gian qui định. Hạn chế sử dụng thuốc bừa bãi, tùy tiện khi chưa xác định được
tác nhân gây bệnh. Không sử dụng đồng thời hai loại thuốc có tác dụng đối
kháng nhau. Để kìm hãm sự phát sinh của các dòng vi khuẩn kháng thuốc, nên
diệt khuẩn với liều lượng hữu hiệu. Nếu dùng thuốc với nồng độ thấp hơn qui
định chúng có thể bình phục và sản sinh ra những dòng kháng thuốc cao hơn.
Mặc khác, sự trao đổi của vi khuẩn gây bệnh giữa con người và động
vật với nuôi thủy sản bằng nhiều con đường khác nhau (Hình 2.1), do đó sự
kháng thuốc của vi khuẩn trên động vật thủy sản sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe
và việc điều trị bệnh của con người.


2.3.3 Sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas
Theo Aoki (1988), các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá như: Aeromonas
salmonicida, A. hydrophila, Edwardsiella tarda, Pasteurella piscicida,
CON NGƯỜI
Bệnh viện, thành
phố, nông thôn

ĐỘNG VẬT

TRÊN CẠN
Cừu, Ngựa, Heo,
Gia Cầm, Bò
Sông, suối
Th
ịt

Chế
biến
Nước uống
U
ỐNG

HỆ THỰC VẬT
Rau
Cây ăn quả
Nước uống
Nư
ớc

Bơi lội
Th
ức ăn
gia súc
Biển
MÔI TRƯỜNG
NUÔI THUỶ SẢN
(cá và giáp xác)

Lò

mổ
Ti
ếp xúc trực tiếp

Chuẩn
bị, nấu,
nướng
V
ật nuôi trong nh
à

Phế phẩm
Nguồn nước,
chất thải của
nông trại
Hình 2.1 Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa
động vật và con người (Prescott et al., 2000)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
Pseudomonas fluorescens và Vibrio anguillarum có chứa plasmid kháng thuốc
kháng sinh. Cụ thể là: A. salmonicida có chứa plasmid R kháng
chloramphenicol, sulfonamide, streptomycin (ở Nhật Bản) và với sulfonamide,
streptomycin, spectinomycin, trimethoprim và tetracycline (ở Ireland) (Aoki,
1997) (được trích dẫn bởi Alderman, 2000).
Theo nghiên cứu của Akinbowale et al. (2005) về sự kháng thuốc của
vi khuẩn được phân lập từ các nguồn thủy sản ở Úc (100 giống vi khuẩn gram
âm và 4 gram dương) với 19 loại kháng sinh (amoxycillin, ampicillin,
cefazolin, cefotaxime, cefoperazone, ceftiofur, nalidixic acid, oxolinic acid,
ciprofloxacin, chloramphenicol, florfenicol, gentamicin, kanamycin,

erythromycin, tetracycline, oxytetracycline, sulfamethoxazole, trimethoprim
and potentiated sulfonamide). Tác giả cho rằng:
− Tần số xuất hiện sự kháng thuốc khác nhau ở các giống vi khuẩn.
Hầu hết đều kháng với penicillins và một vài loài kháng với cephalosporins
cũng như erythromycin.
− Trong tổng số chủng vi khuẩn có 54,8% kháng với ampicillin and
amoxicillin, 41,4% kháng với cefotaxime, 23,1% kháng cefazolin, 5,8% kháng
ceftiofur và 1,9% kháng cefoperazone. Trong khi đó 47,1% kháng
erythromycin, 16,4% kháng tetracycline và với oxytetracycline là 19,2%.
− Kháng với gentamicin và kanamycin lần lượt 2,9% và 5,8%; 13,5%
kháng acid nalidixic và 8,7% với acid oxolinic, kháng chloramphenicol và
florfenicol là 6,7% và 8,7%.
− Phân lập được 4,8% các loài kháng trimethoprim và 15,4% kháng
sulfamethoxazol. Tìm thấy 3,9% kháng trimethoprim + sulfamethoxazole. Đặc
biệt là tất cả các loài đều nhạy cảm ciprofloxacin.
− Cả 4 chủng Pseudomonas spp. đều nhạy với ciprofloxacin,
gentamicin and kanamycin. Trong đó: Một chủng nhạy với tất cả kháng sinh
(19 loại). Ba chủng còn lại kháng cefotaxime, 2 chủng kháng với ampicillin và
amoxycillin, 2 chủng kháng cefazolin. Kháng với ceftiofur ở 3 chủng và 2
chủng kháng với cefoperazone, chloramphenicol, florfenicol, trimethoprim,
sulfamethoxazole và trimethoprim-sulfamethoxazole. Kháng với acid nalidixic
and erythromycin ở 3 chủng. Tuy nhiên, chỉ có 1 chủng kháng acid oxolinic, 1
chủng kháng tetracycline và oxytetracycline.
Le et al. (2005) nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong mô
hình nuôi tôm- đước ở Việt Nam, tác giả thấy tác hại việc sử dụng thuốc
kháng sinh phổ biến trong nuôi thủy sản làm cho tồn lưu kháng sinh trong
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
nước, trong bùn và tạo sự kháng thuốc của vi khuẩn trong môi trường. Kiểm
tra sự kháng thuốc của vi khuẩn được phân lập từ 4 địa điểm nuôi tôm – đước

khác nhau ở Việt Nam với norfloxacin (NOR), oxolinic acid (OXLA),
trimethoprim (TMP) và sulfamethoxazole (SMX). Trong đó, vi khuẩn kháng
với TMP và SMX. Trong mẫu bùn phân lập được chủ yếu vi khuẩn Baccillus
và Vibrio kháng với với thuốc kháng sinh.
Theo nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn trong ao
nuôi cá da trơn. Chọn ngẫu nhiên 3 trại nuôi cá da trơn khác nhau, phân lập
được 92 chủng vi khuẩn từ môi trường ao nuôi. Trong đó, tổng số chủng vi
khuẩn thuộc họ: Enterobacteriaceae chiếm 49,1%, Pseudomonads chiếm
35,2%, Vibrionaceae chiếm 15,7%. Kiểm tra sự kháng thuốc của các chủng vi
khuẩn phân lập được với 6 loại thuốc kháng sinh: oxytetracyline (OTC),
chloramphenicol (CHL), trimethoprim - sulphamethoxazol (SXT),
nitrofurantoin (NF), nalidixic acid (NA) và ampicillin (AM). Thấy phần lớn
các chủng vi khuẩn đa kháng với AM-OTC-SXT-NA chiếm 17,8%, với OTC-
SXT-NA chiếm 15,1%, với AM-C-FT-SXT-NA chiếm 13,7%, với AM-FT-
OTC chiếm 9,6% và kháng với AM-C-FT-OTC-SXT-NA chiếm 8,2%, tiêu
biểu là có 6 chủng P. pseudomallei và 1 chủng P. cepacia kháng với AM-
OTC-SXT-NA, 10 chủng P. cepacia kháng với AM-C-FT-SXT-NA. Từ kết
quả cho thấy, sự kháng thuốc trong thuỷ sản đang ở mức cao. Những kết quả
này cho thấy khả năng kháng thuốc kháng sinh trong các loài vi khuẩn cá bản
địa là một mối quan tâm lớn trong nghề nuôi cá da trơn ở vùng ĐBSCL
(Sarter et al., 2007).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
Phần 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ 1/2009 − 5/2009.
Địa điểm thực hiện:
− Thu mẫu nước và mẫu bùn tại tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ.
− Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thuỷ Sản − Khoa

Thuỷ Sản − Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ
Phiếu ghi nhận thông tin khi thu mẫu (Phụ lục 1), que cấy, giấy vệ sinh,
bao tay, giấy nhôm, giấy làm dấu, bọc nylon, dây thun, thùng trữ lạnh, hộp
quẹt,…
Chai nút mài 100 ml, ống nghiệm 10ml, đĩa petri, đèn cồn, que trãi thuỷ
tinh, bình xịt cồn, cốc thủy tinh 250 ml, hộp đầu col pipet 0,5ml và 1ml, pipet
100-1000ml, lame, lamelle.
Cân điện tử, máy trộn mẫu nước (vortex), máy khuấy từ, nồi khử trùng
áp suất, tủ sấy khô, tủ ấm, tủ lạnh, tủ vô trùng.
3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu
Hoá chất: NaCl, cồn 96
o
, cồn 70
o
, glycerol, nước cất, các loại hoá chất
nhuộm Gram,…
Thuốc kháng sinh (12 loại): trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT/ 1,25
µg - 23,75 µg), tetracyline (TE/30 µg), cefazolin (CEZ/30 µg), norfloxacin
(NOR/5µg), nitrofurantoin (NF/300 µg), rifampicin (RA/30 µg), ampicillin
(AM/10 µg), streptomycin (SM/10 µg), chloramphenicol (CHL/30 µg),
neomycin (NM/30 µg), flumequin (FM/30 µg), doxycycline (DO/30µg). Hầu
hết, những thuốc kháng sinh này của Bio-Rad, riêng cefazolin và norfloxacin
của Oxoid.
Thuốc kháng sinh tinh dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu:
Oxytetracycline hydrochloride, chloramphenicol, streptomycin.
Môi trường chung: Trypton soy agar (TSA), nutrient broth (NB), brain
heard in broth (BHIB), mueller hinton agar (MHA).
Môi trường chọn lọc: Glutamate starch phenol red agar (GSP Agar),

Pseudomonas isolation agar.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
Nguồn vi khuẩn: 30 chủng Pseudomonas spp. phân lập được từ môi
trường ao nuôi cá tra ở 3 tỉnh Trà Vinh, Cần Thơ và Bến Tre. Hai chủng vi
khuẩn tham khảo Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Địa điểm thu mẫu
Chọn số ao nuôi cá thâm canh ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ.
3.3.2 Mẫu vi khuẩn
Tổng số ao được thu là: 30 ao (30 mẫu nước + 30 mẫu bùn). Mỗi tỉnh
tiến hành thu 10 ao.
3.3.3 Phương pháp thu mẫu
Thu hai đợt trong chu kỳ nuôi: Một đợt trong tháng đầu và một đợt vào
tháng cuối của vụ nuôi và thu mẫu khi có bệnh xảy ra đột xuất. Mẫu nước và
bùn được thu ở ba điểm khác nhau ở trong ao: điểm cấp nước vào, giữa ao và
điểm thoát nước.
Phương pháp thu mẫu nước và bùn theo tài liệu của Le et al. (2005).
Đối với mẫu nước: tại mỗi điểm thu 100 ml bằng chai nút mài tiệt trùng và thu
cách mặt nước 0-20 cm. Đối với mẫu bùn: tại mỗi điểm thu 10 ml bằng dụng
cụ chuyên biệt (drivers) và thu ở lớp mặt 1 cm, sau đó cho mẫu vào chai đã
tiệt trùng. Tất cả mẫu thu được trữ lạnh ở 4
o
C và chuyển về phòng thí nghiệm
phân tích trong vòng 24 giờ.
3.3.4 Phương pháp phân tích vi khuẩn trong mẫu nước và bùn
a. Mẫu nước
Các chai nước được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng.
Sau đó rút bỏ một ít nước trong mỗi chai sao cho có thể đảo đều mẫu nước
trong chai. Ở mỗi chai hút 30ml cho vào một chai rỗng đã được khử trùng.

Trộn đều mẫu nước và tiến hành phân tích theo phương pháp của
(Le et al., 2005).
Pha loãng 1 ml mẫu nước ban đầu thành 10ml trong nước muối sinh lý
đã được tiệt trùng ở 121
o
C trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10
-4
. Rút
0,1ml từ những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường GSP Agar sau đó đem
ủ trong điều kiện hiếu khí ở 28
o
C và đọc kết quả khi mẫu được ủ sau 24 giờ.
Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
b. Mẫu bùn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
Các chai bùn được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng.
Sau đó, cho tất cả bùn từ 3 chai được thu tại 3 điểm trong ao vào cùng một
chai đã tiệt trùng và đảo đều mẫu sau đó tiến hành phân tích theo phương pháp
của Le et al. (2005).
Pha loãng 1g mẫu bùn với 10ml trong nước muối sinh lý đã được tiệt
trùng ở 121
o
C trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10
-4
. Lấy 0.1ml từ
những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường GSP Agar sau đó đem ủ trong
điều kiện hiếu khí ở 28
o
C và đọc kết quả khi mẫu được ủ sau 24 giờ. Tất cả

các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
c. Chọn vi khuẩn
Theo như chỉ dẫn của nhà sản xuất, chọn khuẩn lạc rời, tạo sắc tố đỏ
trên đĩa môi trường GSP ở mẫu nước và mẫu bùn. Sau đó tiến hành tách ròng
sang đĩa mới đến khi thuần thì trữ lại.
3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn
Xác định các đặc điểm về hình thái, sinh-hóa: kiểm tra các chỉ tiêu cơ
bản (primary test). Vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Frerichs
và Millar (1993) và sử dụng dòng vi khuẩn tham khảo là: P.aeruginosa.
3.3.5.1 Xác định các chỉ tiêu cơ bản
(Theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993))
Quan sát tính di động.
Nhuộm Gram.
Phản ứng oxidase.
Phản ứng catalase.
Khả năng lên men và oxy hoá đường glucose (Fermentation/oxidation:
O/F).
3.3.5.2 Phương pháp sử dụng bộ kit API 20E (Biomerieus
®
SA I’Etoile -
France)
3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ
(Theo phương pháp của Kirby Bauer)
Phương pháp xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ.
Vi khuẩn sau khi được phục hồi, kiểm tra tính thuần thì tiến hành làm
kháng sinh đồ.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống
nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn đều và

tiến hành xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng
610 nm và điều chỉnh để xác định mật số vi khuẩn đạt 10
8
cfu/ml
(OD = 0,1 ± 0.02).
Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành trãi dung dịch vi khuẩn
lên môi trường thạch.
Dùng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều trên
môi trường thạch MHA. Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng
lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của
đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh
với mép đĩa petri 10-15mm. Mỗi đĩa petri (đường kính 100 mm) môi trường
đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh.
Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm
ở điều kiện 28
0
C. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả.
Ghi chú:
− Phải lắc đều vi khuẩn và được lặp lại 3 lần.
− Sử dụng chủng tham khảo E. coli.
Đọc kết quả
Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô
trùng của nhà sản xuất để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và
kháng. Kết quả đường kính vòng vô trùng của 2 trong 3 lần lặp lại sai khác
không đáng kể thì ghi nhận kết quả của 2 lần lặp lại đó hoặc kết quả trung bình
của 3 lần lặp lại đó.
3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Qua việc sàn lọc kết quả kháng sinh đồ, chọn 4 chủng vi khuẩn
Pseudomonas spp. (PTV083, PCT0914, PTV0923, PBT0925) để xác định giá
trị MIC đối với 3 loại thuốc kháng sinh (oxytetracycline, streptomycin,

chloramphenicol), thực hiện cùng 2 chủng tham khảo P. aeruginosa và E. coli.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa
trên phương pháp (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006b).
v Các bước tiến hành:
Ø Chuẩn bị hóa chất - môi trường
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
Vi khuẩn được lấy từ tủ đong -80
o
C sau khi rã đông thì được cấy lên
môi trường TSA, ủ trong tủ ấm từ 28
o
C sau 24 giờ. Riêng với vi khuẩn đối
chứng E. coli, ủ ở 37
o
C.
Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng,
kích thước màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần. Nếu vi
khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần.
Khi vi khuẩn đã thuần, lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống
nghiệm chứa 5 ml BHIB, ủ ở 28
o
C, trong 18-20 giờ.
Ø Chuẩn bị dung dịch thuốc
Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị 2 chai (50 ml) dung dịch thuốc
gốc có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp.
Pha loãng 2 lần các nồng độ: 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512;
1024 µg/ml. Pha loãng bằng nước muối sinh lý (Bảng phụ lục 3).
Chú ý:
Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 và 256 µg/ml sẽ được pha loãng từ

dung dịch thuốc gốc 1024 µg/ml. Những ống nghiệm thuốc còn lại 128; 64;
32;…; 0,5 µg/ml được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml. Cần lắc
đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các dung dịch thuốc tiếp theo. Nồng
độ thuốc sẽ giảm đi một nữa khi cho dung dịch vi khuẩn vào. Ghi tên thuốc và
nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm.
Ø Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng
610 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB (không dùng nước
cất) ở điểm OD = 0,1±0,02 (mật số vi khuẩn khoảng 10
8
CFU/ml), pha loãng
để đạt được mật số vi khuẩn 10
5
cfu/ml. Sau đó, mỗi chủng vi khuẩn đều được
cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự thuần chủng vi khuẩn và được ủ trong
điều kiện với các ống MIC.
Cho 3 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 3 ml dung
dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,5; 1; 2;…; 512 µg/ml (cần lắc đều).
Thí nghiệm có 2 đối chứng:
Đối chứng âm: (3 ml BHIB + 3 ml nước muối sinh lý).
Đối chứng dương: (3 ml dung dịch vi khuẩn + 3 ml nước muối sinh lý).
Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28
o
C, trong 24 giờ (đến khi thấy vi
khuẩn trong đối chứng dương phát triển).
Ø Đọc kết quả
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết
quả hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì

làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng
âm và dương.
Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc
kháng sinh, ở đó không có vi khuẩn phát triển.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn
Sau 3 đợt thu mẫu ở Trà Vinh, Cần Thơ và Bến Tre, phân lập được 80
chủng vi khuẩn trong môi trường ao nuôi cá tra thâm canh (Phụ lục 4). Tất cả
các chủng vi khuẩn này có khả năng tạo sắc tố đỏ trên môi trường GSP agar (
môi trường chọn lọc Aeromonas spp. và Pseudomonas spp.) (Hình 4.1)


Chọn ngẫu nhiên 30 chủng vi khuẩn từ 80 chủng phân lập được, trong
đó có 10 chủng từ mẫu nước, 20 chủng từ mẫu bùn. Tiến hành kiểm tra các chi
tiêu cơ bản.


Qua kết quả kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (Phụ lục 6) thấy hầu hết các
chủng vi khuẩn Gram âm, hình que (Hình 4.2), di động được, oxidase và
catalase dương tính, trừ một vài chủng oxidase âm tính, đa số các chủng không
cho phản ứng oxidation/fermentation (O/F) (Hình 4.3), chỉ có một số cho phản
ứng oxidation (O) (Hình 4.3).
Sau khi kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản cho phép định danh 30 chủng vi
khuẩn thuộc giống Pseudomonas. Giống vi khuẩn này phân bố khắp nơi trong
môi trường, trong đất và nước. Sazakli et al. (2005) phân lập được 160 chủng

Pseudomonas spp. từ nhiều nguồn nước khác nhau ở Greece gồm có
Hình 4.1 Vi khuẩn trên môi trường GSP
Hình 4.3 Kết quả test O/F

Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram (100X)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17
P. aeruginosa, P. stutzeri, P. alcaligenes, P. putida, P. fluorescens, P.
mendocina…
4.2 Kết quả lập kháng sinh đồ
Sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh trong nuôi thủy sản, là một
trong những nguyên nhân dẫn đến sự hình thành các mầm bệnh vi khuẩn
kháng kháng sinh, gây khó khăn cho việc điều trị bệnh động vật thủy sản, ảnh
hưởng đến động vật nuôi và con người. Sự kháng kháng sinh của các chủng
Pseudomonas spp. phân lập từ môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ đã được xác định,
30 chủng Pseudomonas spp. thử nghiệm với 6 kháng sinh
(tetracyline, chloramphenicol, doxycycline, flumequin, streptomycin,
trimethoprim-sulfamethoxazole) và chọn ra 12 chủng thử thêm với 6 loại
kháng sinh (norfloxacin, cefazolin, rifampicin, ampicillin, neomycin,
nitrofurantoin).
Bảng 4.1 Tính kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh
Kháng sinh
Kháng Trung bình Nhạy Tổng số
chủng
Số chủng %

Số chủng %

Số chủng %

TE 6 20

4 13

20 67

30
CHL 18 60

5 17

7 23

30
DO 2 6.7

10 33

18 60

30
FM

12

40

1

3.3

17

57

30

SM 20 66,7

9 30

1 3,3

30
SXT 13 43.3

10 33.3

7 23,3

30
NOR

5

42

1

8.3

6

50

12

CFZ 12 100

0 0

0 0

12
RA 11 91.7

1 8.33

0 0

12
AM 12 100

0 0

0 0

12
NM 4 33.3

4 33.3

4 33,3

12
NF 11 91.7

0 0

1 8,3

12
Ghi chú: Tetracyline (TE/30 µg), chloramphenicol (CHL/30 µg), doxycycline (DO/30µg),
flumequin (FM/30 µg), streptomycin (SM/10 µg), trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT/ 1,25 µg -
23,75 µg), norfloxacin (NOR/5µg), cefazolin (CEZ/30 µg), rifampicin (RA/30 µg),
ampicillin (AM/10 µg), neomycin (NM/30 µg), nitrofurantoin (FT/300 µg).
Qua Bảng 4.1, thấy đa số các chủng Pseudomonas spp. thí nghiệm
kháng với các kháng sinh, mỗi loại kháng sinh đều có chủng vi khuẩn kháng ,
tương tự như nghiên cứu của Sokarid et al. (1988) về sự kháng thuốc của vi
khuẩn thuộc nhóm coliform và Pseudomonas spp. trong môi trường nước ở
Port Harcourt, Nigeria: Tất cả 157 chủng Pseudomonas spp. phân lập được
đều kháng một trong 10 loại thuốc kháng sinh thử nghiệm và có đến 151
chủng kháng từ 2 loại thuốc trở lên.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
18
4.2.1 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh
7
18
17

1
7
4
5
10
1
9
10
6
18
2
12
20
20
13
0
3
6
9
12
15
18
21
TECHLDOFMSMSXT



Đối với doxycyclin (DO) và tetracycline (TE), thuộc nhóm tetracycline,
hơn phân nửa chủng vi khuẩn nhạy với 2 kháng sinh này (Hình 4.4). Tuy
nhiên, có đến 6 chủng kháng với TE còn kháng DO thì chỉ có 2 chủng, vì thế

DO nhạy với Pseudomonas spp. hơn TE, theo Lê Thị Kim Liên và ctv. (2008),
xét về mặt dược lí, chia nhóm kháng sinh này làm 2 thế hệ: Thế hệ I và II,
trong đó TE, oxytetracycline… thuộc thế hệ I có thời gian tác động ngắn còn
DO, minocyclin thuộc thế hệ II được tổng hợp gần đây có thời gian tác động
dài. Xét về mặt hiệu lực xếp theo thứ tự giảm dần minocyclin mạnh nhất rồi
đến DO, TE, oxytetracycline. Nhóm tetracycline được sử dụng trong nuôi thủy
sản bằng cách trộn vào thức ăn hoặc tắm (trích dẫn của Từ Thanh Dung, 2008)
mà theo Bùi Thị Tho (2003), DO hấp thu tốt ở đường tiêu hóa.


Tương tự, flumequin (FM) thuộc thế hệ I của nhóm Fluroquinolon, có
12 chủng kháng với FM (Hình 4.4), theo Bùi Thị Tho (2003) nhóm này
Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ chủng PTV085
chủng vi khuẩn
kháng sinh
Hình 4.4 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
19
thường có phổ tác dụng rộng, có tác dụng rất tốt trên vi khuẩn thuộc họ đường
ruột (trực khuẩn Gram âm khó tính bao gồm cả Pseudomonas…).
Theo Bùi kim Tùng (2001), streptomycin (SM) cùng nhóm aminosid
không hấp thu qua ruột nên không dùng không uống mà sử dụng phương pháp
tiêm, ở người SM chủ yếu trị bệnh lao, nhưng tỉ lệ kháng (66,7%) cao hơn
NM. Trong thí nghiệm này, SM có tỷ lệ kháng cao với 30 chủng thì có đến 20
chủng kháng SM (Hình 4.4), chỉ có 1 chủng nhạy. Sokari et al. (2005) xác
định trong 157 chủng Pseudomonas spp. thì có 56 chủng kháng (35,67%).
Trong 30 chủng thí nghiệm thì có 13 chủng kháng với trimethoprim-
sulfamethoxazole (SXT), tỉ lệ kháng (43,3%) chưa đến 50%, còn với
chloramphenicol (CHL) tỉ lệ kháng cao đến 60% (Bảng 4.1). So với nghiên
cứu của Akinbowale et al. (2007) tỉ lệ kháng với SXT và CHL đều là 50%, thì

các chủng vi khuẩn kháng với SXT thấp hơn và kháng với CHL cao hơn. Theo
điều tra của Mai Văn Tài và ctv. (2004), có ít nhất 373 loại hoá chất và CPSH
được sử dụng trong nuôi thủy sản thì có 5 loại bị cấm sử dụng trong đó có
CHL.
4.2.2 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh
6
4
111
4
5
12
11
12
4
11
0
2
4
6
8
10
12
14
NORCEZRAAMNMNF



Norloxcin (NOR) thế hệ II của nhóm fluroquinolon, theo Bùi Kim
Tùng (2001) nhóm kháng sinh này có khả năng ức chế hoạt động của enzym
AND gyrase, enzyme này can thiệp vào việc sao chép và đảo trình tự các

nucleotid trong quá trình sao chép AND, vì thế nếu lạm dụng fluroquinolon sẽ
tạo ra những chủng vi khuẩn kháng thuốc vĩnh viễn do đột biến. Kết quả
nghiên cứu này, thấy có đến 5 chủng Pseudomonas spp. kháng với NOR (42%
chủng vi khuẩn). Newaj-Fyzul et al. (2008) xác định được 1 chủng trong 8
chủng vi khuẩn
kháng sinh
Hình 4.6 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version