phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (penaeus monodon) tại sóc trăng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN






LÊ MỸ PHƯƠNG






PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis
TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon)
TẠI SÓC TRĂNG








LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Cần Thơ, 2008
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN





LÊ MỸ PHƯƠNG





PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis
TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon)
TẠI SÓC TRĂNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN












Cần Thơ, 2008
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
DANH MỤC HÌNH

Hình Trang
Hình 4.1: Khuẩn lạc sau 24 giờ ở độ pha loãng 10
-2
21
Hình 4.2: Khuẩn lạc thuần trên TSA sau 24 giờ 21
Hình 4.3: Vi khuẩn gram dương 22

Hình 4.4: Bào tử sau 28 giờ 22
Hình 4.5: Các bào tử tự do sau 36 giờ 22
Hình 4.6: Thủy phân Starch 24
Hình 4.7: Thuỷ phân Casein 24
Hình 4.8: Thuỷ phân Gelatin 24
Hình 4.9: Phản ứng V-P dương tính 25
Hình 4.10: Tạo Nitrite từ Nitrate dương tính 25
Hình 4.11: Methyl red dương tính 25
Hình 4.12: Vi khuẩn phát triển ở các nồg độ muối
2%, 5%, 7%, 10% 26
Hình 4.13: Xylose (+), Arabinose (+), Mannitol (+),
Glucose (+), Sucrose (-) 26
Hình 4.14: Kết quả chạy điện di ADN dòng chuẩn Bacillus subtilis 27











Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
MỤC LỤC

Phần I: GIỚI THIỆU 1

Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Ứng dụng của vi sinh vật đối với đời sống con người 3
2.2 Các vấn đề phát sinh trong ao nuôi tôm thâm canh 4
2.3 Probiotic trong thuỷ sản 6
2.3.1 Khái niệm và ứng dụng của probiotic 6
2.3.2 Cơ chế tác dụng của probiotic 7
2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 8
2.4.1 Vị trí phân loại 8
2.4.2 Quá trình hình thành bào tử 9
2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis 10
2.5 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn 11
2.6 Phương pháp PCR 12
Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 14

3.2 Môi trường, hóa chất và thiết bị 14

3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu 15
3.3.1 Thu mẫu 15
3.3.2 Phân tích mẫu 15
3.4 Phân lập vi khuẩn 15
3.5 Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn 15

3.6 Phương pháp PCR 17
3.6.1 Ly trích ADN 17
3.6.2 Qui trình chạy PCR 18
3.6.3 Chạy điện di và đọc kết quả 18
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 19

4.2 Kết quả về hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn 19
4.3 Kết quả PCR dòng chuẩn 26
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 28
5.1 Kết luận 28
5.1 Đề xuất 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29


Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ.
Đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền
đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em học tập và
nghiên cứu tại trường.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng cùng gia đình
và các bạn lớp Bệnh học Thủy sản K30 đã động viên và hỗ trợ cho em trong thời
gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp.


Sinh viên thực hiện
Lê Mỹ Phương
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TÓM TẮT
Bacillus subtilis là vi khuẩn có lợi, có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh
vực của đời sống. Phần lớn các sản phẩm men vi sinh bán trên thị trường đều
có thành phần là B. subtilis. Đề tài được thực hiện nhằm phân lập và xác định

đặc tính sinh hoá vi khuẩn phân lập để định danh vi khuẩn B. subtilis trong ao
nuôi tôm sú thâm canh. Thu mẫu bùn tại 4 ao nuôi tôm thâm canh tại Sóc
Trăng với nhịp thu 2 tuần/lần và phân tích tại phòng thí nghiệm. Kết quả phân
lập được 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus, trong đó có 8 chủng cho kết
quả các đặc tính sinh hoá gần giống với Bacillus subtilis. Tám chủng vi khuẩn
này sẽ được trữ lại và tiếp tục định danh theo phương pháp PCR. Tuy nhiên do
thời gian có hạn đề tài chỉ thực hiện đến việc xác định chủng vi khuẩn chuẩn
B. subtilis S19 (bằng phương pháp PCR) sử dụng làm đối chứng dương.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
1

Phần I: GIỚI THIỆU

Trong những năm gần đây, thuỷ sản đã trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của
nước ta. Sản lượng thuỷ sản không chỉ đáp ứng được nhu cầu thực phẩm trong
nước mà còn xuất khẩu sang thị trường các nước như Nhật, Nga, Mỹ, Úc,…
Năm 2007, xuất khẩu thuỷ sản nước ta đạt 3,7 tỷ USD, vượt 2,78% so với kế
hoạch, tăng 10,45% so với năm 2006 (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông
Thôn, 2007). Trong đó tôm Sú (Penaeus monodon) là một trong những sản
phẩm xuất khẩu chủ lực, chiếm 39,9% tổng sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu. Tuy
nhiên để tăng năng xuất và lợi nhuận, người nuôi đã không ngừng tăng mật độ
giống thả, sử dụng thuốc, hoá chất trong phòng và trị bệnh chưa hợp lý, thiếu
sót trong quản lý môi trường… Vấn đề trên không chỉ làm xáo trộn sự cân bằng
sinh học của hệ sinh thái trong ao nuôi mà còn tạo điều kiện cho dịch bệnh
bùng phát ảnh hưởng đến sức khoẻ vật nuôi, đồng thời gây ô nhiễm môi
trường.
Trước tình hình trên, xu hướng chung của thế giới là “phòng bệnh hơn chữa
bệnh”. Hiện nay nhiều mô hình nuôi bền vững được đề xuất và áp dụng như
nuôi tôm thân thiện môi trường, nuôi sinh thái, nuôi an toàn sinh học… Gần

đây các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu việc tận dụng các vi sinh vật
hữu ích để tạo các chế phẩm sinh học (như: Bio-remediation, Bio-control,
Probiotics) thông qua cơ chế tác động của chúng như: sản xuất các hợp chất ức
chế hoặc vi sinh vật gây hại, cạnh tranh về dinh dưỡng, nơi cư trú, tiết enzym
phân huỷ hợp chất hữu cơ giúp cải thiện môi trường ao nuôi, hỗ trợ quá trình
tiêu hoá cho đối tượng nuôi… Một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu
nhiều nhất là Bacillus. Hầu hết các loài Bacillus không độc hại đối với động vật
kể cả người. Nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến
dưỡng thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hoá chất và enzym (trích
dẫn bởi Olmos, 2005).
Đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (Penaeus
monodon) tại Sóc Trăng” được thực hiện với mục tiêu và nội dung:
Mục tiêu
Phân lập và xác định các đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis trong ao nuôi
tôm sú thâm canh. Từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2

Nội dung
Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn trong ao nuôi tôm sú thâm canh.
Khảo sát các đặc điểm sinh học của vi khuẩn theo phương pháp truyền thống.
Nhận diện dòng vi khuẩn chuẩn Bacillus subtilis S19 bằng kỹ thuật PCR
(Polymerase Chain Reaction).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3

Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Ứng dụng vi sinh vật đối với đời sống con người
Việc nghiên cứu vi sinh vật phát triển rất nhanh đã dẫn đến việc hình thành các
lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology); nấm học (Mycology); tảo học
(Phicology); virus học (Virology),…Chúng được ứng dụng nhiều trong các lĩnh

vực như: y học, thú y, công nghiệp, nông nghiệp, môi trường,…(Nguyễn Xuân
Thành và ctv, 2005).
Đa số vi sinh vật trong tự nhiên là có lợi, do đó cần nghiên cứu vai trò to lớn về
nhiều mặt của các nhóm vi sinh vật trong tự nhiên và trong công nghiệp. Trên
cơ sở đó tìm kiếm các phương pháp nhằm khai thác đầy đủ nhất những tác
động tích cực của vi sinh vật và ngăn chặn một cách hiệu quả nhất các tác động
có hại của chúng. Định hướng nghiên cứu về các lĩnh vực của công nghiệp vi
sinh vật nhằm tạo ra nhiều chế phẩm vi sinh vật hữu ích ứng dụng trong sản
xuất nông nghiệp, công nghiệp, phục vụ đắc lực cho hoạt động sống của con
người (Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2005).
Vi sinh vật tham gia vào việc khép kín vòng tuần hoàn các vật chất và giữ cân
bằng sinh thái trong tự nhiên. Một số chủng vi sinh vật tiết ra chất kháng sinh,
vitamin, chất kích thích sinh trưởng, hoặc trong tế bào chứa tinh thể diệt côn
trùng áp dụng trong công nghệ sản xuất chất kháng sinh, vitamin, thuốc bảo vệ
thực vật,… Ngoài ra, vi sinh vật còn phân huỷ các chất độc hại, các phế thải
nông nghiệp, công nghiệp, làm sạch môi trường,…(Nguyễn Khắc Thái Sơn,
2007)
Trong y học, công nghệ vi sinh đã góp phần trong việc tìm kiếm nhiều loại
dược phẩm quan trọng, chẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh hiểm nghèo cho
người, gia súc, gia cầm. Đặc biệt trong quá trình tìm kiếm các biện pháp, thuốc
phòng trị các loại bệnh truyền nhiễm, công nghệ vi sinh đã tạo ra vacxin từ vi
sinh vật như: vacxin tạo từ riboxom của từng loài vi khuẩn gây bệnh, có ưu
điểm ít độc và tính miễn dịch cao hoặc vacxin được tạo từ các mảnh của vỏ
virus gây bệnh. Ngoài ra vacxin còn được chế tạo từ vi khuẩn hoặc nấm men tái
tổ hợp có mang gen mã hoá việc tổng hợp protein của kháng nguyên gây bệnh
(Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2005). Công nghệ vi sinh còn được ứng dụng để
sản xuất men tiêu hóa cho con người. Hầu hết các men tiêu hóa hiện nay dùng
cho con người trên thị trường đều có chứa các vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
4

subtilis như: Biosubtilic, Bidisubtilic, Antibio, Biofidin, Biobaby,…(Nguyễn
Khắc Thái Sơn, 2007).
Vi sinh vật còn có vai trò trong việc tạo ra nguồn năng lượng cho con người
như lên men nguyên liệu rẻ tiền như rỉ đường để sản xuất cồn chạy xe thay
xăng. Nhờ quá trình lên men yếm khí của vi sinh vật đã chuyển hoá vật chất
hữu cơ tạo Biogas làm khí đốt.
Đặc biệt, vi sinh vật có vai trò rất lớn trong việc bảo vệ môi trường, tham gia
tích cực trong việc xử lý phế thải nông nghiệp, công nghiệp, rác thải sinh hoạt,
nước thải,…làm sạch môi trường.
Trong tự nhiên, nhờ hoạt động sống của vi sinh vật nên một lượng lớn các chất
hữu cơ bị khoáng hoá. Các hợp chất hữu cơ được chuyển hoá qua hàng loạt các
phản ứng hoá học, xúc tác mỗi phản ứng là một enzyme (Nguyễn Xuân Thành,
2005). Trong chuyển hoá các hợp chất trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật
cùng tham gia, sản phẩm chuyển hoá của vi sinh vật này lại là cơ chất cho vi
sinh vật khác, hoạt động của chúng diễn ra phức tạp và có mối liên hệ chặt chẽ
với nhau. Sự phân huỷ các chất hữu cơ diễn ra với tốc độ khác nhau phụ thuộc
vào thành phần, số lượng và điều kiện môi trường. Thành phần chủ yếu của
hợp chất hữu cơ trong nước và bùn ao nuôi tôm bao gồm: protein, lipit,
hydratcacbon, kitin. Các vi khuẩn có khả năng phân huỷ protein thường gặp
thuộc chi Pseudomonas, Clostridium, Bacillus. Chúng phân giải protein thành
polypeptit, axit amin, NH
3
. Nhóm vi sinh vật phân huỷ các hydratcacbon bao
gồm chi Bacillus, Aspegilus streptomyces, Streptocococus, Clostrium,… Trong
quá trình này các hydratcacbon (tinh bột, xenluloza, pectin, hemixenluloza,…)
được phân giải thành những phần nhỏ hơn, tạo ra các sản phẩm của quá trình
trao đổi chất như các khí (NH
3
, CO

2
), axit formic, axit acetic, axit propinic,
axit béo, axit lactic, các chất khoáng và sinh khối mới của vi sinh vật
(
Một trong những đặc điểm quan trọng của vi sinh vật là chúng sinh trưởng
nhanh. Khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp chỉ sau 24 giờ từ một tế bào vi
sinh vật có thể thu được một sinh khối lớn. Hơn nữa chúng có thể nuôi cấy dễ
dàng trên các cơ chất rẻ tiền, không tốn nhiều diện tích và việc sản xuất không
phụ thuộc vào sự thay đổi của thời tiết
(



Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
5

2.2 Các vấn đề phát sinh trong nuôi tôm thâm canh
Trong nuôi tôm thâm canh, việc làm sạch và duy trì ao nuôi sạch vẫn còn nhiều
khó khăn, khiến cho những người nuôi tôm gặp rất nhiều rủi ro. Tình trạng
nhiễm bẩn nặng của ao nuôi tôm mặc dù đã được khắc phục bằng giải pháp
thay nước sạch thường xuyên hay nước đã được xử lý, song phần bùn ao nơi
các chất thải tích tụ trong quá trình nuôi là môi trường lý tưởng cho các vi
trùng và ký sinh trùng gây bệnh phát triển. Mỗi năm ở đáy ao nuôi tôm thâm
canh hình thành một lớp bùn dày 10-15 cm, tương đương 30-50 tấn/ha chất khô
giàu hữu cơ ( Bùn có
thành phần chủ yếu là chất hữu cơ, bao gồm sinh khối vi sinh vật và xác động
thực vật thuỷ sinh. Khi phân huỷ tự nhiên sẽ làm cạn kiệt lượng oxy hoà tan và
sinh ra các chất độc hại đối với tôm như NH
3
, H

2
S,
CH
4
…( Từ đó làm phát
sinh bệnh và gây thiệt hại lớn. Theo Moriarty (1998), bệnh do vi khuẩn gây ra
xảy ra ở tất cả các giai đọan phát triển của tôm và sự bùng phát bệnh gây thiệt
hại kinh tế lớn. Theo trình bày của Ngân hàng thế giới thiệt hại kinh tế do bệnh
gây ra trong nuôi thủy sản khoảng 3 tỷ đô la (Ludin, 1996; trích dẫn bởi
Vaseeharan et al., 2002).
Để kiểm soát và quản lý mầm bệnh người nuôi đã sử dụng thuốc, hóa chất bừa
bãi dẫn đến hiện tượng chọn lọc và phát tán các gen kháng thuốc giữa các
chủng vi khuẩn nhờ plasmid hoặc thể thực khuẩn (Moriarty, 1999). Điều này
có nguy cơ gây nguy hiểm cho người và các động vật khác. Ngoài việc sử dụng
kháng sinh, người nuôi còn sử dụng các chất tẩy uế để giết mầm bệnh. Các chất
như formaline, chlorin có thể ngăn cản sự bùng phát bệnh, nhưng lâu dài sẽ tạo
ra các vấn đề môi trường tiềm tàng (Rosenthal, 1980). Việc sử dụng chlorine
kích thích sự phát triển nhiều gen kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn (Murray
et al. 1981; trích dẫn bởi Moriarty, 1999).
Bên cạnh các vấn đề về môi trường, thức ăn cho tôm cũng là yếu tố quan trọng.
Do thức ăn chiếm chi phí đắt nhất trong nuôi thủy sản, số lượng và chất lượng
thức ăn là nhân tố đầu tiên ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tôm (Olmos,
2005). Thức ăn cho tôm chứa hàm lượng protein cao (trên 35%), do đó khi thức
ăn không được tôm tiêu thụ hoặc các chất thải bài tiết từ tôm sẽ phóng thích
lượng lớn các hợp chất chứa nitơ vào môi trường nước gây các vấn đề về môi
trường và dịch bệnh.
Để giải quyết vấn đề chất thải lắng tụ trong ao, vấn đề kiểm soát bệnh sao cho
có hiệu quả và an toàn, đồng thời giảm chi phí về thức ăn cho tôm; các nhà
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
6

khoa học hướng tới việc tận dụng các vi sinh vật có lợi mà gần đây được biết
như chế phẩm vi sinh (probiotics).
2.3 Probiotic trong thủy sản
2.3.1 Khái niệm và ứng dụng Probiotic
Một thời gian dài trước khi phát hiện ra Probiotic, vi khuẩn chưa được xem
như nguồn thức ăn cho sinh vật khác. Sau đó những nghiên cứu thực hành cho
thấy những kết quả đã góp phần cải thiện sức khỏe con người. Vào những năm
đầu thế kỷ 20, Metchnikoff đã cấy vi khuẩn lên men acid lactic vào đường tiêu
hóa của người với mục đích khống chế họat động của vi khuẩn khác. Khái
niệm mới về Probiotic đã được hình thành.
Yasuda and Taga (1980), công bố sử dụng vi khuẩn như nguồn thức ăn và
là nhân tố sinh học trong phòng trị bệnh cá. Vi khuẩn được đề nghị đầu tiên là
Vibrio alginolyticus, sử dụng như một vi sinh vật hữu ích trong các trại giống ở
Ecuado từ 1992 giúp giảm thời gian nghỉ của trại từ 21 ngày xuống còn 7 ngày
(Phạm Thị Tuyết Ngân, 2006).
Probiotics hiện nay thường xuyên được sử dụng giúp tăng sự kháng bệnh
cho tôm và như một chất thay thế kháng sinh (Rengpipat et al., 1998).
Probiotics là vi sinh vật hoặc sản phẩm của chúng có lợi cho sức khoẻ của vật
chủ. Chúng được phát triển trong nuôi trồng thuỷ sản như là phương tiện kiểm
soát bệnh, kích thích sự thèm ăn, cải tiến chất dinh dưỡng bằng cách tạo ra
vitamin, giải độc các thành phần trong thức ăn và phân huỷ các chất không
được tiêu hoá (Irianto and Austin, 2002). Theo Fuller (1987), probiotic là sản
phẩm được nuôi hoặc bổ sung thức ăn vi khuẩn sống có lợi cho vật chủ bằng
cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột. Theo Gram et al. (1999), đề
nghị probiotic là chất bổ sung vi khuẩn sống, tác dụng có lợi đối với động vật
chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn của nó, định nghĩa này không gắn
liền với thức ăn. Hơn nữa, Salminen et al. (1999), cho rằng probiotic như các
thành phần của tế bào vi khuẩn (nhưng không cần thiết phải sống) có ảnh
hưởng tốt đến sức khoẻ vật chủ. Tất nhiên probiotic phải không gây hại đến vật

chủ (Salminen, 1999). Chúng chịu được ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ muối
khác nhau (Fuller, 1987). Ngày nay, Probiotic đã được sử dụng trong thức ăn
nhân tạo (Robertson et al., 2000), thức ăn tươi sống như Artemia, Rotifers
(Gatesoupe, 1991) và sử dụng trong môi trường nước (Austin, 1995).
Hơn 50 năm qua, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu về probiotics để cải
tiến các thực phẩm có lợi, góp phần tăng sức khoẻ cho con người và động vật
(Rengpipat et al., 1998). Các loài vi sinh vật thường được dùng để tạo
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
7

Probiotics bao gồm Lactobacillus spp., Saccharomyces sp., Bacillus spp. (trích
dẫn bởi Irianto and Austin, 2003).
Austin (1995), nghiên cứu sử dụng probiotic (Vibrio alginolyticus) trên cá Hồi,
kết quả cho thấy probiotic có thể làm giảm bệnh gây ra bởi Aeromonas
salmonicids, Vibrio anguillarium và Vibrio ordalii. Một nghiên cứu khác khi
ngâm tôm Sú (PL30) 10 ngày với Vibrio harveyi có sử dụng probiotic (Bacillus
S11) cho thấy sự tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm là 100% cao hơn nhiều so
với nhóm đối chứng (không sử dụng probiotic) 26% (Rengpipat et al., 1998).
Bên cạnh đó tác giả còn cho rằng Bacillus S11 có thể thay thế cả Vibrio spp.,
một số loài vi khuẩn khác trong ruột tôm và trong môi trường nước. Theo
Hasting and Nealson (1981) Bacillus S11 có thể tạo ra một số chất kháng
khuẩn hoặc một vài sản phẩm chưa được biết có thể tiêu diệt V. harveyi D331.
Theo Moriarty (1998), mầm bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. đã được xem là một
trong những nguyên nhân làm tôm chết hàng loạt. Tuy nhiên, các ly trích tế bào
tự do Bacillus subtilis BT23 cho thấy có hiệu quả cao trong việc chống lại sự
tăng trưởng của Vibrio harveyi phân lập từ tôm sú bệnh đen mang, tỉ lệ chết của
tôm giảm 90% (Vaseeharan and Ramasamy, 2002). Nghiên cứu này cho thấy
mầm bệnh Vibrio bị kiểm soát bởi Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm
và ngoài thực tế. Theo một nghiên cứu khác của Vaseeharan et al. (2004),
probiotic giúp kháng được vi khuẩn Listonella anguillarum xuất hiện trong

nước, bùn đáy ao nuôi và trong các cơ quan của tôm sú. Tác giả cho biết trên
mang, cơ, dạ dày và gan tụy của tôm sú trong ao nuôi có sử dụng probiotic, số
lượng vi khuẩn Listonella anguillarum thấp hơn so với ao đối chứng. Kết quả
này chứng minh các sản phẩm bài tiết của Bacillus trong thức ăn và ruột tôm ức
chế sự phát triển của L. anguillarum trong cơ thể tôm đồng thời giúp tăng
cường sự tăng trưởng, nâng cao tỉ lệ sống của tôm sú (Vaseeharan et al., 2004).
Kết quả này cũng trùng với nghiên cứu của Moriarty (1998), sau khi sử dụng
probiotic (chứa chủng Bacillus spp.) tỉ lệ sống của tôm sú tăng, hạn chế được
mầm bệnh vi khuẩn phát sáng Vibrio spp. trong nước và bùn đáy ao.
2.3.2 Cơ chế tác dụng của Probiotic
Nhóm vi sinh vật dị dưỡng hoại sinh như một số loài thuộc nhóm Bacillus (B.
subtilis, B. licheniformis, B. megaterium,…) làm sạch môi trường nhờ khả năng
sinh các enzyme (protease, amylase, xenlulase, kitinase, lipase) phân hủy các
hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của các vi sinh vật gây
bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn ở trạng
thái cân bằng sinh học ( />)
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
8

Các loài thuộc giống Bacillus, Pseudomonas, Clostridium (B. mesentericus, B.
mycoides, B. subtilis, P. flourescenc, C. sporogenes,…) tham gia vào quá trình
amôn hóa protein, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển nitơ từ dạng khó
hấp thu sang dạng muối amôn dễ được thực vật thủy sinh hấp thu và giúp làm
sạch các thủy vực (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2006).
Nhóm vi sinh vật Enterococcus faecium, Streptomyces cinnamoensis, B.
subtilis, Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Pediococcus
acidilatici, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lên men acid lactic, có vai trò kiểm soát
các sinh vật gây bệnh cho tôm, cá trong môi trường nhờ khả năng sinh các chất
ức chế như acid lactic, bacterioxin. Bên cạnh đó chúng cũng được dùng làm
thức ăn cho tôm, cá, giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm

nhập của các vi sinh vật có hại và tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh
đường ruột. Đồng thời còn có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, hấp thu thức ăn, giúp
vật nuôi khỏe mạnh và phát triển nhanh
(
Theo Olmos (2005), trong thức ăn nuôi tôm, probiotic có thể giúp phân hủy tất
cả các thành phần protein vì các enzyme được tạo ra bởi vi khuẩn có thể bổ
sung các hoạt tính của protease giúp tăng khả năng tiêu hóa thức ăn cho tôm.
Hơn nữa, enzyme từ probiotic chịu được khoảng pH rộng hơn enzyme của tôm,
do đó quá trình tiêu hóa có thể diễn ra trong thời gian dài giúp tôm hấp thu chất
dinh dưỡng tốt hơn.
2.4 Đặc điểm sinh học Bacillus subtilis
2.4.1 Vị trí phân loại
Giới Bacteria
Ngành Firmicutes
Lớp Bacilli
Bộ Bacillates
Họ Bacillaceae
Giống Bacillus
Loài Bacillus subtilis
(
Năm 1872, Ferdinand Cohn (cùng thời Robert Koch), đã phát hiện và đặt tên là
B. subtilis. B. subtilis là trực khuẩn Gram dương, di động, có kích thước 2-3x
0,7-0,8 µm, nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8 µm. Ở điều kiện
100
o
C, bào tử B. subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ
thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. B. subtilis hình thành bào
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
9

tử khi môi trường biến đổi đột ngột, cũng như sống thời gian dài dưới những
điều kiện bất lợi như khan hiếm chất dinh dưỡng
( Tuy nhiên, B. subtilis
cũng có thể phản ứng với sự thiếu dinh dưỡng bằng cách di chuyển cơ thể từ
các điều kiện nghèo dinh dưỡng đến nơi tốt hơn nhờ vào các lông roi (Mirel et
al., 2000).
2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis
Khi môi trường bị thay đổi đột ngột hoặc do thiếu thức ăn, các loài thuộc giống
Bacillus và Clostridia khác nhau tạo ra một loại tế bào ngừng hoạt động tạm
thời gọi là nội bào tử, có thể chống lại các tấn công lớn có thể phá hủy thành tế
bào (Driks, 1999). Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi
nẩy nở mà để chịu đựng được với điều kiện bất lợi. Đó là loại tế bào ở trạng
thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh (Nguyễn Lân
Dũng, 1983). Cách đây 100 năm, một nghiên cứu của Koch về bào tử của B.
anthracis có thể sống sót ở điều kiện đun sôi, đã tạo cảm hứng cho các nhà
khoa học nghiên cứu về bào tử với mục đích khám phá ra như thế nào loại tế
bào ngưng hoạt động đặc biệt có thể chịu nhiệt độ và các điều kiện gây sốc
khác. Theo Driks (1999), bào tử có khả năng chịu nhiệt là nhờ lớp áo bào tử.
Áo bào tử là một cấu trúc gồm nhiều lớp bao quanh bào tử được cấu thành bởi
hơn 25 loại polypeptid liên kết chéo chặt chẽ với nhau. Tuy nhiên lớp áo bào tử
cũng cho phép bào tử hồi sinh khi điều kiện môi trường thích hợp. Bào tử có
thể chuyển đổi thành tế bào phát triển thông qua một quá trình gọi là sự nảy
mầm.
Trong quá trình hình thành nội bào tử, vi khuẩn cũng tạo ra các chất kháng
sinh. Nhiều loài hình thành bào tử có thể phân hủy một cách hiệu quả các
polymer sinh học (protein, starch, pectin,…), đóng vai trò quan trọng trong các
chu trình sinh học Nitơ và Carbon
(
Quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn cần khoảng 8 giờ để hoàn thành
(Driks, 1999). Trong quá trình hình thành bào tử, nhiễm sắc thể nhân đôi thành

các bản sao riêng biệt. Cuối cùng chỉ có một bản sao nhiễm sắc thể nằm trong
bào tử, sau đó thành hai tế bào, các phần còn lại bị hủy đi và bào tử được phóng
thích. Theo Nguyễn Lân Dũng (1983), phần lớn vi khuẩn trong tế bào chỉ có
thể có một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm và mỗi bào
tử chỉ cho ra một tế bào dinh dưỡng.
Trong tất cả các loài, không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở
trong bất kỳ điều kiện nào. Chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
10

trong môi trường nuôi hình thành bào tử và một số khác thì không. Tuy nhiên
có sự chấp nhận rằng sự hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh
và trong suốt pha tĩnh (Banwart, 2000).
2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis
B. subtilis tạo protease kiềm (subtilisin) với lượng lớn, có đặc tính bền vững,
hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành
công nghiệp khác nhau. Subtibilin chủ yếu được sử dụng trong các ngành công
nghiệp các chất tẩy rửa và cả trong y dược học. Ngoài ra subtibilin còn sử dụng
trong xử lý phim X quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc, làm nước mắm
cá, làm thức ăn gia xúc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác, xử lý rác thải
trong lò mổ gia cầm.
Trong những năm gần đây tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên
thị trường đều là protease được sản suất từ các chủng Bacillus, mà chủ yếu là
B. subtilis. Năm 1971, đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những nghiên
cứu về protease kiềm ở Bacillus. Horikoshi là người đầu tiên công bố thu nhận
và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ bản, tính chất lý hóa của protease kiềm từ
Bacillus ( Năm 1972, người
ta đã nghiên cứu và đưa vào sản xuất trên quy mô lớn các protease kiềm ở một
vài loài Bacillus. Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease kiềm của
Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị trường

thương mại, vi khuẩn Bacillus trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo
quan điểm công nghiệp (
Gần đây người ta đã thành công trong nhân dòng phân tử, giải trình tự
nucleotide và biểu hiện gen mã hóa protease kiềm từ nhiều loài Bacillus. Nhiều
chủng được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa subtilisin, trong đó chủng
Bacillus được sử dụng nhiều nhất vì đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về
đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền với toàn bộ genon đã được xác định
(
.Ngoài những sản phẩm hóa chất, một số công ty cũng sử dụng B. subtilis như
tác nhân sinh học để kiểm soát địch hại. B. subtilis (QST 713) có hiệu quả
đáng kể chống nhiều loại vi khuẩn và bệnh nấm. QST 713 hoạt động bằng cách
chiếm bề mặt lá cây, cạnh tranh với các mầm bệnh để chiếm không gian và các
chất dinh dưỡng, nhờ đó ngăn cản mầm bệnh bằng con đường vật lý. Nó cũng
sản sinh ra các chất chuyển hóa lipopeptit có tác động kết hợp để phá hủy các
ống và màng của mầm bệnh
(
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
11

Quỹ nghiên cứu trà USPAI tại Valparai, Ấn Độ đã khảo sát tiềm năng của các
vi khuẩn chống các mầm bệnh gây rụi lá trà. Nhiều dòng vi khuẩn B. subtilis đã
được xác định là có khả năng chế ngự mầm bào tử của mầm bệnh. Hiện nay
các nhà nghiên cứu đang tiến hành các thí nghiệm để nâng cao hiệu quả thực
địa của những dòng vi khuẩn chọn lọc
(
B. subtilis là một trong những vi khuẩn có tiềm năng nhất, thuận lợi trong việc
cải thiện sức khỏe và kích thích hệ miễn dịch. Theo các nghiên cứu lâm sàng
trong báo cáo khoa học về thuốc “Sự kích thích miễn dịch bởi Bacillus subtilis”
của nhà vi sinh vật học J. Harmann, các thành phần của thành tế bào vi khuẩn
B. subtilis có thể hoạt hóa gần như tất cả các hệ thống phòng thủ miễn dịch của

con người, bao gồm sự hoạt hóa ít nhất 3 kháng thể chuyên biệt (IgM, IgG,
IgA) chống lại hiệu quả nhiều virus, nấm, mầm bệnh vi khuẩn gây hại thường
xâm nhập và gây nhiễm vào cơ thể người
( Theo một nghiên cứu
của Gong et al. (2006), chủng B. subtilis PY-1 phân lập từ bó mạch của cây
bông có khả năng kháng mạnh nhiều mầm bệnh nấm trên cây trồng đặc biệt là
nấm Fusarium oxysporum gây ra thiệt hại kinh tế lớn trong nhiều mùa vụ. Theo
tác giả, các chất kháng sinh tạo ra bởi chủng B. subtilis PY-1 ổn định ở các điều
kiện pH trung tính và kiềm, không nhạy với nhiệt độ cao. Gần đây các nhà
khoa học sử dụng các vi sinh vật này như là một phương pháp bảo vệ sinh học,
kiểm soát mầm bệnh và thay thế các thuốc diệt sinh vật (methyl bromide) có
nguy cơ gây ra thiệt hại môi trường nghiêm trọng
(
2.5 Các đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn
Tổng các phản ứng xảy ra trong tế bào có liên quan đến quá trình trao đổi chất
và các phản ứng hóa học riêng được tạo nên bằng sự xúc tác bởi các phản ứng
protein gọi là enzyme. Phần lớn các enzyme trong tế bào có chức năng phân cắt
các nguyên liệu thức ăn (sự dị hóa) và tổng hợp thành các thành phần của tế
bào (sự đồng hóa). Tuy nhiên vi khuẩn không thể thực hiện sự thực bào do
thành tế bào cứng. Vì thế chúng bài tiết ra các ngoại enzyme có chức năng bên
ngoài tế bào để phân cắt các đại phân tử như: protein, tinh bột,… thành các
amino acid, monosaccharide,… Sau đó được vận chuyển vào tế bào. Điển hình
của các ngoại enzyme của vi khuẩn là: protease, amylase, lypase,…
Mục đích đầu tiên của quá trình trao đổi chất là tạo ra năng lượng cần cho sự
tổng hợp sinh học và tăng trưởng của tế bào. Vi khuẩn có thể đạt được các nhu
cầu năng lượng bằng hai phương thức trao đổi chất khác nhau đó là quá trình
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
12

hô hấp và quá trình lên men. Trong quá trình hô hấp các phân tử hữu cơ được

phân hủy một cách hoàn toàn thành carbondioxide (CO
2
) và nước. Ngược lại,
sự lên men là sự phân cắt các phân tử hữu cơ thành các alcohol, aldehyde, acid
và các khí như: CO
2
, hydrogen. Trong quá trình này các phân tử hữu cơ trong
con đường trao đổi chất giữ nhiệm vụ như chất nhận electron cuối cùng và trở
thành sản phẩm cuối cùng trong con đường lên men. Nhiều loài vi khuẩn có
khả năng phát triển bằng hai quá trình hô hấp và lên men. Sản phẩm cuối cùng
của quá trình lên men có thể được sử dụng như một chỉ tiêu để định danh vi
khuẩn (Brown, 2005).
Khi vi khuẩn hiếu khí phát triển bằng quá trình hô hấp, chúng tạo ra hydrogen
peroxide (H
2
O
2
) như một sản phẩm khử O
2
thành nước. H
2
O
2
có tính phản ứng
cao sẽ gây tổn hại đến các enzyme, nucleic acid, các phân tử nhỏ trong tế bào.
Để tránh thiệt hại này, các sinh vật hiếu khí tạo ra enzyme catalase chuyển
H
2
O
2

thành O
2
vô hại.
2H
2
O
2
2H
2
O + O
2
↑
Các vi khuẩn kỵ khí bặt buộc thiếu enzyme này vì thế chúng không thể xử lý
với H
2
O
2
tạo ra trong môi trường hiếu khí. Sự hiện diện của catalase là một
cách để phân biệt các vi khuẩn này với vi khuẩn hiếu khí.
2.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Thế giới khoa học cần có một hệ thống phân loại dựa trên các dấu hiệu có ở các
sinh vật sống. Trong những năm 1980, nhà khoa học Carl Woese đưa ra một đề
nghị mới đó là đi thẳng đến trung tâm của nguồn gốc tính đa dạng. Ông đề nghị
trình tự deoxyribonucleic acid (ADN) của vài gen thông thường có thể được sử
dụng để xác định mối quan hệ của các sinh vật khác nhau. Điển hình Woese
nhặt một gen mã hóa 1 phân tử RNA tìm thấy trong ribosome (rRNA).
Ribosome (phức hợp protein-RNA) tìm thấy trong tất cả prokaryote và
eukaryote. Mặc dù có sự khác nhau về kích cỡ giữa ribosome của prokaryote và
eukaryote, nhưng trình tự của phân tử rRNA thì rất giống nhau (đó là vùng có
tính bảo tồn cao). Điều này cho phép các trình tự nucleic được đánh dấu và so

sánh. Woese chọn 16S rRNA (prokaryote) hoặc 18S rRNA (eukaryote). Phân
tử này đủ lớn để chứa đủ các thông tin cho so sánh di truyền và đủ nhỏ cho gen
để giải trình tự một cách dễ dàng (trích dẫn bởi Salyers and Whitt, 2001).
PCR được Kary Mullis phát minh năm 1985, là một kỹ thuật phổ biến trong
sinh học phân tử nhằm khuếch đại một đoạn ADN lên đến 10
6
lần hoặc nhiều
hơn (Marlowe et al., 2005) mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli
hay nấm men. Theo Marlowe et al. (2005), PCR thực chất là một phản ứng
catalase
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
13

enzyme đơn giản, sử dụng enzyme ADN-polymerase để sao chép trình tự ADN
mong muốn lập lại 25-30 chu kỳ. Trong mỗi chu kỳ trình tự ADN được nhân
đôi, kết quả lượng ADN tăng theo hàm số mũ. Theo giả thiết, 25 chu kỳ tạo ra
sự khuếch đại là 2
25
, nhưng trong thực tế chỉ đạt được tương đương 10
6
lần
lượng ADN ban đầu. Theo tác giả đây là do hiệu quả của sự khuếch đại không
hoàn hảo.
Ngày nay PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các bệnh di truyền; nhận dạng, chẩn
đoán các bệnh nhiễm trùng; tách dòng gen; xác định huyết thống. PCR cũng
được dùng để phân tích tiến hóa, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ ADN
trong và giữa các quần thể. Trong thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu cho
việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn (Vibrio) hoặc virus (WSSV, YHV,…), ký
sinh trùng và nấm trên động vật thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).

Một chu kỳ thông thường của PCR gồm 3 bước (biến tính ADN, gắn mồi, và
kéo dài ADN). Phần lớn các phản ứng PCR, giai đoạn biến tính được chuẩn
hóa tại nhiệt độ 94
o
C

trong 1,5 phút, vì ở nhiệt độ này đảm bảo sự biến tính
hoàn toàn của các phân tử ADN (Marlowe et al., 2005). Giai đoạn gắn mồi xảy
ra tại nhiệt độ thấp hơn (thông thường khoảng 50-70
o
C

trong 1 phút), mức
nhiệt độ ở giai đoạn này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi sử dụng.
Bước cuối của PCR là kéo dài mạch ADN, giai đoạn kéo dài thường xảy ra
trong 1 phút tại 72
o
C. Thành phần quan trọng của giai đoạn này là enzyme Taq
polymerase thu từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus. Enzyme này phù
hợp với PCR do nó ổn định với nhiệt độ (có thể trên 98
o
C) và có thể tái sử
dụng cho nhiều chu kỳ (Marlowe et al., 2005).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
14

Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm: Thu mẫu tại các ao nuôi tôm thâm canh ở ấp Tân Tĩnh, xã Vĩnh
Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng. Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm
Khoa Thuỷ Sản, trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian: Từ tháng 3 – tháng 7 năm 2008.
3.2 Môi trường, hóa chất và thiết bị
Môi trường nuôi: Tripticase soya agar (TSA), Luria-Bertani (LB), Tripticase
Soya Broth (TSB)
Môi trường và hóa chất để xác định các đặc tính sinh lý sinh hóa vi khuẩn:
Môi trường: MR-broth, Nitrate broth, Trypton, Casein, Gelatin, Starch,
Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB), Simmon’s citrate agar,…
Hóa chất nhuộm: Crystal violet, iodine, cồn 96%, safranin, malachite green 5%
Hóa chất pha thuốc thử: alpha naphthol, KOH, sulphanilic acid, acid acetic,
alpha naphthylamine, H
2
O
2
, HgCl
2
, HCl đậm đặc, phenol red, methyl red
Hóa chất khác: NaCl, K
2

HPO
4
, KH
2
PO
4
, các loại đường (glucose, arabinose,
xylose, sucrose, mannitol), urê,…
Hóa chất trong phương pháp PCR
Hóa chất ly trích ADN : Na
3
PO
4
, Tris-HCl (10mM, pH 9), Lysozyme,
CH
3
COONH
4
, Chloroform, TE (pH 8, Tris 10 mM, EDTA 1 mM),
isopropanol,…
Hóa chất trong phản ứng PCR: nước cất 2 lần, MgCl
2
(1,5 mM), buffer
Hóa chất trong điện di: dung dịch TAE 1X, agarose, ethidium bromide
Thiết bị và dụng cụ
Nồi hấp tiệt trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, vortex, cân phân tích, kính hiển vi,
micropipet, đèn cồn, que cấy, que tán, đĩa petri, ống nghiệm,…
Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, bộ điện di, bàn đọc UV, máy chụp gel.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu
3.3.1 Thu mẫu
Mẫu bùn được thu bằng bộ dụng cụ thu mẫu làm bằng ống nhựa PVC (do viện
nghiên cứu sức khỏe động vật thủy sản Thái Lan thiết kế). Thu mẫu tại 4 ao,
mỗi ao thu 3 điểm (khoảng 100g bùn/điểm) theo đường chéo của ao. Thu từ
trên bề mặt đáy ao xuống khoảng 10cm. Mẫu được cho vào chai có nắp đậy đã
tiệt trùng và trữ lạnh ngay ở 4
o
C. Sau đó vận chuyển về phân tích.
Nhịp thu mẫu 2 tuần/lần.
3.3.2 Phân tích mẫu
Pha loãng 1g bùn ở mỗi vị trí thu mẫu của 1 ao trong 9ml nước muối sinh lý,
trộn đều. Sau đó hút 3ml dung dịch được pha loãng từ mỗi mẫu (3 mẫu/ao) trộn
lại thành 9ml dung dịch mẫu bùn pha loãng của ao thu mẫu. Hút 1 ml từ mẫu 9
ml trên cho vào ống 9 ml nước muối sinh lý khác. Tiếp tục pha loãng đến hệ số
cần thiết (tùy theo độ đục của mẫu phân tích). Pha loãng mẫu tương tự đối với
các ao còn lại.
Để nhiệt kế vào một ống nghiệm khác có chứa nước (không cần tiệt trùng). Sau
đó xếp tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng và ống nghiệm có nhiệt kế vào
cùng một giá, để vào nước nóng ở 80ºC. Khi nhiệt kế đạt 80ºC tính thời gian
đến 10 phút rồi lấy các ống nghiệm ra. Sau đó hút 100µl từ mỗi nồng độ pha
loãng của mẫu bùn trong mỗi ao cho vào các đĩa môi trường TSA (thêm 1,5%
NaCl), dùng que thủy tinh trãi đều. Mỗi nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần. Ủ ở
30
o
C trong 24 – 28 giờ.
3.4 Phân lập vi khuẩn

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng mọc trên các đĩa môi trường sau khi ủ, cấy sang
đĩa môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl) ủ ở 30ºC trong 24 giờ. Tiếp tục tách
ròng cho đến khi thu được dòng thuần. Các dòng vi khuẩn phân lập được nuôi
tăng sinh trong môi trưuờng TSB (thêm 1,5% NaCl). Sau đó trữ vi khuẩn với
glycerol 25% trong các ống cryobead và giữ ở -80
o
C trước khi phân tích tiếp.
3.5 Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn
Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa để định danh các dòng vi khuẩn phân lập (Bảng
3.1) được chọn theo Andretta et al. (2004).
Xác định tính di động, sản sinh catalase, sự khử nitrate, khả năng sử dụng
citrate, sản sinh indole, sử dụng urê, thủy phân gelatin, thủy phân tinh bột, phản
ứng Voges-proskauer (VP), các phản ứng lên men đường (glucose, xylose,
arabinose, sucrose, mannitol), phát triền tại các nồng độ muối khác nhau, phát
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
triển tại các nhiệt độ khác nhau được thực hiện theo Tài liệu hướng dẫn thực
tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
Phương pháp nhuộm Gram, methyl red thực hiện theo Sharmin and Rahman
(2007). Nhuộm bào tử, phát triển ở các pH khác nhau theo Brown (2005). Thủy
phân Casein theo Elnasser et al. (2007). Cách tiến hành các chỉ tiêu trên được
mô tả chi tiết ở phần phụ lục.

Bảng 3.1: Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá để định danh Bacillus subtilis

Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá Kết quả
Gram
Hình dạng bào tử
Vị trí bào tử
Hình dạng tế bào chứa bào tử
Di động

Starch
Catalase
Citrate
Phát triển tại pH 5,7
Phát triển tại pH 6,8
Phát triển trong điều kiện kỵ khí
Phát triển ở 2% NaCl
5% NaCl
7% NaCl
10% NaCl
Thuỷ phân Gelatin
Sản sinh Indole
Tạo Nitrite từ Nitrate
Tyrosine
Voges-proskauer (VP)
Methyl red
Lên men Arabinose
Xylose
Glucose
Sucrose
Mannitol
Sinh gas từ Glucose
Thuỷ phân Casein
Phát triển tại 55ºC
65ºC
Lecithinase
Urease
+
Oval
Chính tâm /lệch tâm

Que, không sưng phồng
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
_

Ghi chú: (+) dương tính; (-)âm tính
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu


3.6 Phương pháp PCR
3.6.1 Ly trích ADN
Ly trích ADN từ dòng vi khuẩn chuẩn Bacillus subtilis S19 (từ Bộ môn di
truyền Sinh học và Động vật, trường đại học Florence, Italia)
Phương pháp ly trích ADN dựa theo Boon (2000). Các bước như sau:
1. Lấy 2ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB ly tâm 5.000 vòng trong 15 phút.
2. Lấy 400 µl cho vào tuýp có chứa sẳn 3g hạt thủy tinh.
3. Thêm 800 µl Na
3
PO
4
(0,1M), lắc đều.
4. Đập hỗn hợp trong 90 giây, tốc độ 27 (1/s), 5 lần.
5. Thêm 32 µl lysozyme (50 mg lysozyme/ml Tris-HCl (10 mM, pH 9,0), lắc
đều.
Sau đó trộn hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 30 phút.
6. Thêm vào 60 µl SDS (20%) và 0,2 ml CH
3
COONH
4
(8M), lắc đều.
7. Trộn hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 10 phút.
8. Ly tâm 15 phút, 7000 vòng. Lấy dung dịch ở phần trên sang tuýp khác.
9. Thêm 800 µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), lắc đều.
10. Trộn hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 60 phút.

11. Ly tâm 15 phút, 7000 vòng. Lấy dung dịch ở phần trên sang tuýp khác.
12. Thêm 0.8 thể tích isopropanol (100%) so với phần nước đã lấy, lắc đều.
13. Giữ ở nhiệt độ -20
o
C (qua đêm).
14. Ly tâm 25 phút, 12.000 vòng.
15. Đổ bỏ phân nước, giữ lại phần ADN kết tủa.
16. Để khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
17. Hòa tan ADN kết tủa bằng TE-buffer (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH
8,0) 250-500 µl tùy theo khối lượng ADN.
18. Giữ ở -20
o
C (để làm các bước tiếp theo).
Qui trình làm sạch:
19. Thêm 800 µl Clean up vào tuýp có chứa ADN. Cho hỗn hợp vào bộ làm
sạch.
20. Thêm tiếp 2ml isopropanol (80%).
21. Hút sạch nước, lấy phần ống có chứa ADN gắn vào tuýp.
22. Ly tâm 10.000 vòng trong 2 phút, lấy ống để sang tuýp khác.
23. Cho vào 25µl TE-buffer (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0) (TE
trước khi sử dụng được giữ ấm ở 65-70
o
C).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.6.2 Quy trình chạy PCR (theo Andretta et al., 2004)
Hỗn hợp của 1 mẫu chạy PCR bao gồm:
- Nước cất 2 lần: 11,15 µl
- Buffer: 2 µl
- MgCl

2
(1,5mM): 1,2 µl
- dNTP (0,2mM): 3,2µl
- Mồi xuôi (5’ GAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’): 0,6µl
- Mồi ngược (5’ AGAAAGGAGGTGATCCAGCC 3’): 0,6µl
- Taq ADN polymerase: 0,25µl
- ADN: 2µl
Tổng thể tích của 1 mẫu là 20µl
Điều kiện phản ứng: 94ºC trong 2 phút
Sau đó: 94ºC trong 1 phút
55ºC trong 1 phút
72ºC trong 2 phút
Lặp lại chu kỳ trên 35 lần
Kéo dài 72ºC trong 3 phút
3.6.3 Chạy điện di và đọc kết quả
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 1X và bản thạch chứa
1,5% agarose.
Chuẩn bị bản thạch: Đun nóng dung dịch agarose bằng lò vi sóng cho tới khi
agarose tan hoàn toàn, để dung dịch nguội khoảng 50
o
C. Cho ethidium bromide
(2µl/100 ml dung dịch gel) vào khuấy đều. Sau đó đổ vào khay đã chuẩn bị
trước (đổ sao cho bề dày của gel cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm).
Khi gel đặc lại cho vào bồn điện di và thêm dung dịch TAE 1X vào cho vừa
bao phủ gel. Dùng pipet hút 8µl mẫu cần phân tích trộn với 2µl Loading Dye
6X cho vào từng giếng. Sử dụng thang ADN (giới hạn 100 -1517 bp) để xác
định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Đối chứng âm được dùng là nước
cất. Khi đã cho mẫu vào các giếng, nối bồn điện di với nguồn điện (50V) để
chạy điện di. Ngừng dòng điện khi màu xanh di chuyển đến khoảng 1/2 gel.
Sau đó đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng

máy đọc gel. Trọng lượng phân tử để xác định ADN Bacillus subtilis S19 là
1500bp.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu


Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Qua 4 đợt thu mẫu (tổng số mẫu thu là 16 mẫu), phân lập được 53 chủng vi
khuẩn. Trong đó có 39 chủng thuộc giống Bacillus do thuộc nhóm Gram
dương, hình thành nội bào tử và catalase dương tính (Collins and Lyne’s,
1986). Còn lại 14 chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương (hình cầu) sẽ bị
loại bỏ. Tên của các chủng phân lập được đặt theo mã số a-b-c-d và liệt kê
trong Bảng 4.1.
Với:
a : Đợt thu mẫu (I: đợt 1, II: đợt 2, III: đợt 3, IV: đợt 4)
b: Ao thu mẫu (A1: ao 1, A2: ao 2, A3: ao 3, A4: ao 4)
c: Số thứ tự của chủng phân lập (từ 1 đến 39)
d: Loại mẫu (S: mẫu bùn)
Bảng 4.1 Danh mục các chủng vi khuẩn phân lập được
STT Tên chủng STT Tên chủng STT Tên chủng
1 I-A1-1-S 14 II-A4-14-S 27 III-A4-27-S
2 I-A1-2-S 15 III-A1-15-S 28 III-A4-28-S
3 I-A3-3-S 16 III-A1-16-S 29 III-A4-29-S
4 II-A2-4-S 17 III-A1-17-S 30 III-A4-30-S
5 II-A2-5-S 18 III-A2-18-S 31 IV-A1-31-S
6 II-A2-6-S 19 III-A2-19-S 32 IV-A1-32-S
7 II-A3-7-S 20 III-A2-20-S 33 IV-A1-33-S
8 II-A3-8-S 21 III-A2-21-S 34 IV-A2-34-S

9 II-A3-9-S 22 III-A3-22-S 35 IV-A2-35-S
10 II-A3-10-S 23 III-A3-23-S 36 IV-A3-36-S
11 II-A4-11-S 24 III-A3-24-S 37 IV-A4-37-S
12 II-A4-12-S 25 III-A4-25-S 38 IV-A4-38-S
13 II-A4-13-S 26 III-A4-26-S 39 IV-A4-39-S

4.2 Kết quả xác định các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa
Sau khi xác định các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa 39 chủng vi khuẩn, có
8 chủng vi khuẩn cho kết quả gần giống với các chỉ tiêu định danh B. subtilis.