tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm tại phòng kiểm nghiệm intertek - cần thơ

LỜI CẢM ƠN
œ¯•
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin chân thành cảm ơn:
Quý thầy cô trong bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản cùng
quí thầy cô Trường Đại học Cần Thơ đã trang bị cho em những kiến thức vô
cùng quý giá trong suốt quá trình học tập.
Qua thời gian thực hiện đề tài em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh
Hoàng Bá Nghị, chị Phạm Bích Kiểu và các anh chị khác ở phòng kiểm
nghiệm Intertek đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập trong thời gian qua.
Em xin gởi lời cảm ơn đến thầy Vương Thanh Tùng, giáo viên hướng
dẫn đã tận tình chỉ dạy cho em phương pháp thực hiện đề tài, cung cấp cho em
nhưng tư liệu quí giá.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động
viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài.

Cần Thơ, tháng 05 năm 2009
Sinh viên thực hiện
DƯƠNG THỊ CẨM TRÚC


NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
@&?

Cần thơ, ngày……tháng……năm 2009

iv

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
@&?

Cần thơ, ngày……tháng……năm 2009

v

TÓM LƯỢC
–&—
Trong tình hình hiện nay, việc xuất khẩu thuỷ sản của nước ta đang phải
đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dư lượng thuốc kháng sinh,
hóa chất, kim loại nặng trong thủy sản và sản phẩm thủy sản.
Sự tồn lưu kháng sinh, hóa chất trong mặt hàng thủy sản khi xuất khẩu
nếu không được kiểm soát chặt chẽ sẽ gây ra những thiệt hại nặng nề cho doanh
nghiệp chế biến thủy sản và cho uy tín của nước nhà. Trước tình hình xuất khẩu
ngày càng nghiêm ngặt đòi hỏi sản phẩm xuất đi phải được kiểm định bởi các cơ
quan kiểm nghiệm chất lượng có uy tín cao cả trong nước và trên quốc tế, đảm
bảo sản phẩm được an toàn để có thể giải quyết được vấn đề rào cản an toàn vệ
sinh thực phẩm của các nước nhập khẩu. Vì vậy, đề tài “Tìm hiểu phương pháp
kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm Intertek – Cần Thơ”
có thể giúp ta tìm hiểu được phương pháp tối ưu để định lượng sự tồn lưu của
nhóm kháng sinh, kim loại nặng … trong sản phẩm thủy sản.
Qua quá trình tìm hiểu đã ghi nhận được một số phương pháp định lượng
kháng sinh, hóa chất, kim loại nặng…còn tồn lưu trong thủy sản và sản phẩm
thủy sản.
- Một số phương pháp kiểm kháng sinh

Định lượng Cloramphenicol trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc
ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS
Phương pháp xác định hàm lượng Leucomalachite Green bằng sắc ký lỏng
ghép khối phổ LC/MS/MS
Định lượng Nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký
lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS
- Phương pháp kiểm thuốc trừ sâu: Định lượng thuốc trừ sâu họ Chlor
bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GCMS)
- Một số phương pháp kiểm kim loại nặng
Phương pháp định lượng Cadmium (Cd) trong thủy sản và sản phẩm thủy
sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)
Phương pháp định lượng thủy ngân (Hg) trong thủy sản và sản phẩm thủy
sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)
Phương pháp định lượng chì (Pb) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản
bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

vi

Phương pháp định lượng Arsenic (As) trong thủy sản và sản phẩm thủy
sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

vii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
–&—
Những chữ viết tắt sau đây đã được sử dụng trong đề tài luận văn:
HACCP Hazard Analysis Critical Control Point
HPLC High pressure Liquid chromatography
UV – VIS Ultraviolet-visible spectroscopy
AAS Atomic Absorption Spectroscopy

AES Atomic Emission Spectroscopy
MS Mass spectrometry
MP Mobile phase
API Atmospheric Pressure Ionization
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization
LC-MS Liquid chromatography - Mass spectrometry
ESI Electrospray Ionization
FAAS Flame atomic absorption spectrometry).
ET Electrothermal
GFA Graphite Furnace Atomizer
HGAAS Hydride generation atomic absorption spectrometry
CV-AAS Cold Vapour Atomic Absorption Spectroscopy
CAP Cloramphenicol
m – CAP meta – cloramphenicol
ACN Acetonitrile
EtOAC Ethyl acetate
MeOH Methanol
MG Malachite green
LMG Leucomalachite green
AOZ 3-amino-2-oxazolidinon
AMOZ 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon
AHD 1-amino-hyđantoin hyđroclorit
SEM Semicarbazit
NPAOZ 3-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-2-oxazolidinon
NPAMOZ 5-metylmorfolino-3-((2-nitrophenyl)metylen)-3-
amino-2-oxazolidinon
NPAHD 1-(2-nitrophenyl)metylen-amino-hyđantoin
NPSEM (2-nitrophenyl) metylen-semicarbazit
2 – NBA 2-nitrobezaldehyd
GCMS Gas chromatography mass spectrometry

ppm Parts per million

viii

ppb Parts per billion
mm Micrometer
ng Nanogram
HA Hydroxylamine.HCl
TSA p-toluen sulfonic acid monohydrate
Đệm:ACN Dung dịch đệm : Acetonitrile


ix
DANH SÁCH HÌNH
–&—

Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống máy HPLC 7
Hình 4.1 Đồ thị khảo sát độ tuyển tính của As trong khoảng nồng độ từ 0.5ppb
đến 10ppb 50


x
DANH SÁCH BẢNG
–&—

Bảng 4.1. Mối liên hệ giữa thể tích và nồng độ của chuẩn CAP và nội chuẩn m-
CAP thêm vào để dựng đường chuẩn 16
Bảng 4.2. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích CAP 17
Bảng 4.3. Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm MG và LMG vào mẫu trắng
để dựng đường chuẩn 21

Bảng 4.4. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích MG và
LMG 22
Bảng 4.5. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích Nitrofuran27
Bảng 4.6. Điều kiện phân mảnh MS/MS của hỗn hợp dẫn xuất của các chất trong
nhóm Nitrofuran 28
Bảng 4.7. Chương trình nhiệt chạy trên NCI source khi phân tích thuốc trừ sau họ
Chlor 31
Bảng 4.8. Chương trình nhiệt chạy trên EI source khi phân tích thuốc trừ sau họ
Chlor 32
Bảng 4.9. Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm Hg vào mẫu trắng để dựng
đường chuẩn 35
Bảng 4.10. Chương trình cài đặt đối với lò graphit khi phân tích Cd bằng quang
phổ hấp thu nguyên tử AAS 39
Bảng 4.11. Chương trình cài đặt đối với lò graphit khi phân tích Cd bằng quang
phổ hấp thu nguyên tử AAS 42
Bảng 4.12. Các thông số cài đặt trên máy phá mẫu Multiwave 3000 46
Bảng 4.13. Thể tích chuẩn As 100ppb thêm vào để dựng đường chuẩn As 46
Bảng 4.14. Mối liện hệ giữa nồng độ và độ hấp thu của As khi chạy chuẩn 48
Bảng 4.15. Độ thu hồi của As trên mẫu spike 20ppb và mẫu spike 100ppb 49
Bảng 4.16. Độ tái lặp trên các nền mẫu khác nhau tại 20ppb 49
Bảng 4.17. Độ lặp lại trên mẫu tôm spike 1ppb ở 3 ngày khác nhau 50
Bảng 4.18. Độ hấp thu của As khi chạy 20 mẫu spike 20ppb và 20 mẫu blank 50

xi
MỤC LỤC
–&—
LỜI CẢM ƠN ii
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN iii
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN iv
TÓM LƯỢC v

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH SÁCH HÌNH ix
DANH SÁCH BẢNG x
MỤC LỤC xi
CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1 Giới thiệu về phòng kiểm nghiệm Intertek 2
2.2 Kháng sinh và vệ sinh an toàn thực phẩm thủy sản 2
2.2.1 Khái niệm về thuốc kháng sinh 2
2.2.2 Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm thủy sản 2
2.2.3 Ảnh hưởng bất lợi của thuốc kháng sinh 3
2.3 Quyết định của Bộ Thủy Sản 3
2.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký 4
2.4.1 Giới thiệu về sắc kí khí 5
2.4.2 Sắc kí lỏng cao áp_ hệ thống HPLC 6
2.4. 3 Giới thiệu hệ thống AAS 11
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
3.1 Các phương pháp và phương tiện thực nghiệm 13
3.1.1 Các phương pháp 13
3.1.2 Phương tiện thực hiện 13
3.2 Các bước thực hiện đề tài 13
3.3 Thời gian thực hiện đề tài 13
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ 14
4.1 Một số phương pháp kiểm các nhóm kháng sinh 14
4.1.1 Nhóm kháng sinh Cloramphenicol 14
4.1.2 Nhóm kháng sinh Malachite Green và Leucomalachite Green 18

xii
4.1.3 Nhóm kháng sinh Nitrofuran: 23
4.2 Phương pháp kiểm thuốc trừ sâu 28

4.3 Một số phương pháp phân tích kim loại nặng 33
4.3.1 Qui trình phân tích thủy ngân (Hg) tổng số trong thủy sản và sản
phẩm thủy sản 33
4.3.2 Qui trình phân tích Cadmium (Cd) tổng số trong thủy sản và sản
phẩm thủy sản 37
4.3.3 Qui trình phân tích Chì (Pb) tổng số trong thủy sản và sản phẩm
thủy sản 40
4.3.4 Qui trình phân tích Arsenic (As) tổng số trong thủy sản và sản
phẩm thủy sản 43
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 52
5.1 Kết luận 52
5.2 Đề xuất 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
PHỤ LỤC 55



1

Chương I: ĐẶT VẤN ĐỀ
Thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam,
nhưng hiện nay ngành thủy sản nước ta phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất
lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng thuốc kháng sinh trong thủy sản và sản
phẩm thủy sản. Dư lượng các thuốc kháng sinh còn tồn đọng trong thủy sản rất
có hại đối với sức khỏe con người và ảnh hưởng đến nền kinh tế thị trường nước
nhà.
Bộ Thủy sản cho rằng do hoạt động kiểm soát dư lượng, hóa chất kháng
sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc tại tất
cả các công đoạn từ nuôi trồng, đánh bắt, thu mua vận chuyển nguyên liệu, đến
chế biến, nên trong năm 2004 số lô hàng bị thị trường nhập khẩu phát hiện kháng

sinh có hại vẫn còn cao (EU: 22 lô, Mỹ: 13 lô, Canada: 27 lô). Tình trạng trên
không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng
nghiêm trọng đến uy tín chất lượng thuỷ sản Việt Nam trên thị trường thế giới.
Hậu quả là Tổng vụ Bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng EU (SANCO) đã cử Đoàn
cán bộ thanh tra đến Việt Nam để kiểm tra hoạt động ngăn chặn hoá chất, kháng
sinh có hại trong thủy sản ở Việt Nam trong tháng 4/2005; Cục Quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ đã kiểm tra chương trình HACCP (Hazard Analysis
Critical Control Point- Hệ thống phân tích các mối nguy cơ và điểm kiểm soát tới
hạn) của các doanh nghiệp có liên quan của Việt Nam trong tháng 9/2005.
TS. Nguyễn Tử Cương, Cục trưởng Cục Quản lý Chất lượng, An toàn Vệ
sinh Thú y Thuỷ sản, nhận xét: “Công tác quản lý chất lượng, an toàn vệ sinh và
thú y thuỷ sản đã duy trì ổn định, giải quyết kịp thời các rào cản của những thị
trường xuất khẩu quan trọng như Nhật Bản, EU, Nga Nhưng năng lực của các
cơ quan địa phương còn hạn chế, chính quyền địa phương đầu tư chưa đúng mức,
ngay cả ở các tỉnh trọng điểm”.
Trước tình hình xuất khẩu ngày càng nghiêm ngặt đòi hỏi sản phẩm xuất
đi phải được kiểm định bởi các cơ quan kiểm nghiệm chất lượng có uy tín cao cả
trong nước và trên quốc tế, đảm bảo sản phẩm được an toàn để có thể giải quyết
được vấn đề rào cản an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước nhập khẩu đối với
mặt hàng thủy sản của nước ta và Intertek cũng là một trong những công ty kiểm
định hàng đầu được quốc tế công nhận đã cung cấp dịch vụ đảm bảo chất lượng
cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau trong đó có lĩnh vực thực phẩm thủy sản
và đã được VILAS công nhận đạt chuẩn ISO 17025:2005. Vì vậy, đề tài “Tìm
hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm
Intertek – Cần Thơ” có thể giúp ta tìm hiểu được phương pháp tối ưu để định
lượng sự tồn lưu của nhóm kháng sinh, kim loại nặng… trong sản phẩm thủy sản.

2

Chương II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về phòng kiểm nghiệm Intertek
- Cty TNHH Intertek Việt Nam – chi nhánh Cần Thơ được thành lập
theo giấy phép số 011043000077 ngày 10/11/2008 do UBND thành phố Hà Nội
cấp; chứng nhận đăng ký hoạt động chi nhánh số 5714000009F cấp ngày
17/02/2008 do UBND TP. Cần Thơ, Sở kế hoạch đầu tư cấp, nghề kinh doanh:
kiểm nghiệm và giám định sản phẩm, xác nhận chất lượng, cung cấp dịch vụ
chứng nhận hệ thống quản lý chất lượng và sản phẩm, cấp chứng thư cho các sản
phẩm, tư vấn về hệ thống, kỹ thuật phòng kiểm nghiệm.
- Địa chỉ chi nhánh: M10, 11, 12, 13 Khu đô thị Nam Sông Cần Thơ,
Phường Phú Thứ, Quận Cái Răng, TP. Cần Thơ.
- Đại diện Cty: Ông Hà Ngọc Long – Giám đốc Cty.
- Phụ trách phòng kiểm nghiệm: Ông Hoàng Bá Nghị, trưởng phòng
kiểm nghiệm.
- Số mẫu phân tích hóa và sinh năm 2008: 15393 mẫu, 3 tháng đầu năm
2009: 2477 mẫu hóa ( mẫu thủy sản đông lạnh và đồ hộp), 1087 mẫu vi sinh
(mẫu cá tra và vệ sinh công nghiệp). Mẫu do Trung Tâm vùng 6 gửi nhà thầu phụ
là Intertek chi nhánh Cần Thơ phân tích: 41 mẫu hóa.
- Phòng kiểm nghiệm công ty đã được VILAS công nhận ISO 17025 :
2005 theo quyết định số 644/QĐ-CNCL ngày 31/12/2008 số hiệu VILAS 278,
lĩnh vực hóa học, sinh học.
- Chi nhánh gồm hai phòng, gồm phòng hành chính và phòng kiểm
nghiệm (gồm hóa và vi sinh).
2.2 Kháng sinh và vệ sinh an toàn thực phẩm thủy sản
2.2.1 Khái niệm về thuốc kháng sinh
Kháng sinh là một nhóm chất hữu cơ phức tạp đầu tiên do vi sinh vật sản
xuất ra trong lúc chúng sinh trưởng và với một lượng nhỏ có tác dụng gây hại đối
với vi sinh vật khác, một số vi khuẩn, vi nấm có khả năng tạo ra kháng sinh,
những kháng sinh này có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng của một số vi
khuẩn, virus, nấm bệnh và một số kí sinh trùng.

2.2.2 Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm thủy sản
Có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng
sinh. Có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong nuôi
trồng thủy sản như:

3

- Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho
thủy sản.
- Kháng sinh cho vào nước để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh.
- Kháng sinh cho thêm vào thức ăn thuỷ sản để bảo quản lâu hư.
- Kháng sinh dùng trong thuốc thúy y thủy sản để chữa bệnh hoặc cho
vào các sản phẩm thủy sản để kéo dài thời gian bảo quản .
Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm thủy sản tồn dư kháng
sinh, có ảnh hưởng không tốt đối với người tiêu thụ.
Bất cứ kháng sinh nào dùng để chữa bệnh cho người và động vật, nếu còn
tồn dư một lượng dù nhỏ nhất cũng có thể gây kháng thuốc. (Dựa theo nguồn tin
Báo Nông nghiệp 12 – 10 – 2006)
2.2.3 Ảnh hưởng bất lợi của thuốc kháng sinh lên con người, vật nuôi và
môi trường
- Tạo ra dòng vi khuẩn kháng thuốc
- Tiết enzyme phân hủy thuốc
- Giảm hấp thụ kháng sinh
- Thay đổi điểm tác dụng
- Đổi qui trình tổng hợp
- Sản xuất chất cạnh tranh với kháng sinh
- Đề kháng chéo
- Kháng chai lì
- Rối loạn tạp khuẩn ruột
- Độc tính cao

- Tác dụng ngoài ý, dị ứng.
2.3 Quyết định của Bộ Thủy Sản về việc ban hành danh mục các hóa
chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy
sản
Điều 1: Ban hành kèm theo Quyết định này:
Danh mục hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh
thuỷ sản nêu tại Phụ lục 1 và Danh mục hoá chất, kháng sinh hạn chế sử dụng
trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản nhằm khống chế dư lượng trong sản phẩm
thuỷ sản thấp hơn giới hạn tối đa cho phép nêu tại Phụ lục 2.
Điều 2: Không cho phép trộn lẫn quá 02 loại chất kháng sinh trong 01 sản
phẩm thuốc, hoá chất; không cho phép trộn lẫn các hoạt chất cùng nhóm
Fluoroquinolone với nhau. Trong trường hợp một sản phẩm có chứa 02 loại hoạt

4

chất kháng sinh, cơ sở sản xuất phải có đủ bằng chứng khoa học và thực tiễn để
đảm bảo trộn lẫn không làm giảm tính năng tác dụng của tứng loại và không phát
sinh tác dụng xấu đối với động vật nuôi và môi trường.
Mọi sản phẩm thức ăn, hoá chất tẩy rửa khử trùng, hoá chất tẩy rửa ao
đầm nuôi, thuốc thú y, hoá chất bảo quản thủy sản phải ghi nhãn theo Quyết định
số 178/1999/QĐ-TTg ngày 308/1999 của Thủ tướng Chính phủ, Thông tư số
03/2000/TT-BTS ngày 22/9/2000 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản và kèm theo dòng
chữ: “Không chứa các chất cấm sử dụng theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS
ngày 24 tháng 2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản”.
Điều 3: Quyết định này có hiệu lực thi hành sau mười lăm (15) ngày kể từ
ngày đăng Công báo và thay thế Quyết định số 01/2002/QĐ-BTS ngày 22/1/2002
của Bộ Thủy sản về việc cấm sử dụng một số hoá chất, kháng sinh trong sản
xuất, kinh doanh thủy sản và Danh mục thuốc thú y thủy sản hạn chế sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản ban hành kèm theo Quyết định số 17/2002/QĐ-BTS
ngày 24/5/2002 của Bộ Thủy sản. Riêng đối với các chất có số thứ tự từ 12 đến

17 tại Phụ lục 1 có hiệu lực thi hành từ ngày 1/7/2005.
Điều 4: Cục trưởng Cục Quản lý Chất lượng, an toàn vệ sinh và Thú y
thủy sản chịu trách nhiệm tổ chức thực hiện và kiểm tra việc thực hiện Quyết
định này.
Chánh Văn phòng Bộ; Thủ trưởng các Cục, Vụ, Thanh tra Bộ; Giám đốc
Trung tâm Khuyến ngư Quốc gia và Thủ trưởng các đơn vị sự nghiệp trực thuộc
Bộ; Giám đốc các Sở thủy sản, Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn có quản
lý Nhà nước về thủy sản; và các cá nhân, tổ chức sản xuất, kinh doanh, nhập
khẩu, sử dụng thức ăn, thuốc thú y, hoá chất, chế phẩm sinh học, vi sinh vật dùng
trong hoạt động thủy sản chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này.
2.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký được xác định như là một qui trình, theo qui trình này
chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học
cúa các chất này trong một hệ thống hai hay nhiều pha. Một trong các pha đó
chuyển động theo hướng nhất định và trong pha này các chất riêng biệt thể hiện
độ linh động khác nhau là do sự khác nhau về: sự phân bố, sự hấp thụ, điện tích,
kích thước phân tử, độ hòa tan, áp suất hơi.
Các chất riêng biệt được tách ra có thể xác định bằng các phương pháp
phân tích. Kỹ thuật chung của sắc kí đòi hỏi chất tan phải được phân bố giữa hai
pha:
- Một pha là cố định gọi là pha tĩnh

5

- Một pha chuyển dịch được gọi là pha động
2.4.1 Giới thiệu về sắc kí khí
Sắc kí khí là phương pháp tách những chất bay hơi (hay được làm cho bay
hơi) qua một cột. Những chất này được dẫn đi bằng một khí trơ gọi là khí mang.
« Cơ chế sắc kí khí có thể là:
Sắc kí phân bố giữa pha tĩnh và khí mang

Sắc kí hấp phụ trên pha tĩnh
Việc lựa chọn kiểu cột tách sẽ phụ thuộc vào các đặc tính lý hóa của chất
phân tích và sự khác biệt về áp suất hóa hơi (P)
« Các bộ phận cơ bản của hệ thống sắc kí khí
- Lò nung
- Nguồn mang khí
- Buồng tiêm mẫu
- Bộ phận phát hiện hay đầu dò (detector)
· Đầu dò dẫn nhiệt
· Đầu dò ion hóa ngọn lửa
· Đầu dò nhiệt ion hóa
· Đầu dò cộng kết điện tử
- Bộ nhận ghi tính hiệu
- Cột sắc kí
« Nguyên lí hoạt động
Phương pháp sắc kí khí dùng nhiệt để tách chất nên dùng để tách những
chất dễ bay hơi và bền nhiệt.
Đầu tiên mẫu được bơm vào thiết bị tiếp nhận mẫu. Có hai chế độ tiêm
mẫu và không tiêm mẫu. Khi cần tiêm mẫu bật sang chế độ tiêm mẫu để định
lượng chính xác thể tích mà chúng ta cần phân tích sau đó chuyển sang chế độ
không tiêm mẫu, phần dư sẽ tự động cho ra ngoài. Thiết bị tiêm mẫu có hệ thống
gia nhiệt nên mẫu bị bay hơi tức khắc và được đẩy vào cột khí bằng khí mang.
Trong cột sắc kí xảy ra quá trình tách chất. Mỗi chất đi qua cột với thời
gian lưu nhất định. Các chất trong cột được tách ra do ái lực của nó với chất áo
trên cột. Ái lực của chất với cột mạnh thì nó sẽ bị giữ lại trong cột lâu, thời gian
lưu dài, chất có ái lực với cột nhỏ sẽ được khí mang ra khỏi cột trước, thời gian
lưu nhỏ. Trong cột sắc kí, các chất tách ra phụ thuộc rất nhiều vào quá trình thay
đổi nhiệt độ (lập trình nhiệt). Nếu lập trình nhiệt không hợp lý các peak sẽ rất gần
nhau rất khó đọc.

6

Các chất tách ra từ cột lần lượt được đưa đến đầu dò gọi là Detector là một
máy biến năng chuyển bứa xạ điện tử thành tín hiệu điện.
Dòng tín hiệu từ đầu dò đi ra được khuếch đại đưa vào hệ thống ghi nhận
kết quả và hiển thị trên màng hình máy vi tính.
2.4.2 Sắc kí lỏng cao áp_ hệ thống HPLC
2.4.2.1 Sơ lược về hệ thống máy – nguyên tắc, cấu tạo của hệ thống máy
Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC,
chúng ta phải có hệ thống trang bị về kỹ thuật này. Hệ thống trang bị của HPLC
đơn giản và đủ để làm việc được theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính
sau đây:


Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống máy HPLC. (1)- Bình chứa dung môi động; (2)-
Bơm cao áp; (3)- Bộ phận tiêm mẫu; (4)-Cột HPLC; (5)- Detector; (6)- Máy ghi
nhận tín hiệu
a) Bình đựng dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Trong trường hợp rửa giải thường (isocratic) chỉ cần một bình dung môi.
Trong trường hợp rửa giải gradient: thường dùng 2, 3, 4…bình dung môi
khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp các dung môi trên được trộn trong
quá trình sắc ký với tỷ lệ biến đổi theo chương trình đã định và có bộ phận đuổi
khí dung môi trước khi vào cột
b) Bơm cao áp

7

Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất
tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar), để
tạo ra những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình

sắc ký nằm trong vùng 0.5 – 3 ml/phút.
c) Bộ phận bơm mẫu
Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định
không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có
thể tích 20, 50 hay 100ml. Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu nhưng đối với van
10 chiều thì có tới 3 vòng mẫu.
d) Cột HPLC
Là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc ký, nó là một yếu tố
quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột tách có nhiều
cỡ khác nhau, tùy thuộc vào mức độ sắc ký. Nói chung, các cột tách phân tích
thường có kích thước chiều dài từ 10 – 25 cm; đường kính trong từ 2 – 5 mm.
e) Trang bị phát hiện chất phân tích (detector)
Đây thường là các Detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ví
dụ:
- Detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV–VIS.
- Detector phổ nguyên tử AES hay AAS.
- Detector phổ huỳnh quang .
- Detector điện hóa (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng).
- Detector chiết suất.
- Detector đo độ dẫn nhiệt…
- Detector diode phát quang và diode mảng.
- Detector đo khối lượng (khối phổ: MS).
Tất nhiên, phải tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù
hợp để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như đo định lượng
chúng.
f) Trang bị chỉ thị kết quả
Ở đây có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi
(recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các peak của các chất, rồi đến bộ tích
phân kế (Intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết quả và in
kết quả.

Đó là 6 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HPLC.
Ngày nay, hệ thống HPLC còn có thêm bộ chương trình gradient dung môi (pha

8

động), bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu, bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho
cột tách sắc ký, máy tính và các phần mềm điều khiển toàn bộ hệ thống để xử lý
kết quả tách, in kết quả tách….
2.4.2.2 Pha động và pha tĩnh trong HPLC
a) Pha tĩnh trong HPLC
Pha tĩnh (Stationary phase) trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) chính là chất
nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích. Nó là những
chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3 – 10 mm, diện tích
bề mặt riêng thường từ 50 –500 m
2
/g. Pha tĩnh, ta chia nó ra làm nhiều loại như:
pha tĩnh loại hấp phụ, phân bố, trao đổi ion.
Pha tĩnh trong HPLC cũng phải thỏa mãn những điều kiện cơ bản sau đây:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không
có các phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, đảm
bảo cơ chế của sự tách theo đúng bản chất chính của pha tĩnh, không mất chất
phân tích cần tách.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định.
- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt có đặc trưng độ xốp của nó và
không bị thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dưới áp
suất cao của quá trình tách sắc ký.
- Cân bằng động của quá trình tách sắc ký phải xảy ra nhanh và lập lại
tốt. Có như thế mới đảm bảo thu được kết quả tách tốt.
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất, nghĩa là đường kính của các hạt lớn

nhất so với các hạt nhỏ nhất không chênh lệch nhau quá 10%, và trên 85% số hạt
phải nằm trong vùng kích thước trung bình. Có như thế cột tách mới có hiệu lực
cao.
Đó là các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật tách HPLC .
b) Pha động trong kỹ thuật HPLC
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra
khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Pha động trong HPLC có thể chỉ là
một dung môi hữu cơ đơn, như methanol, acetonitrile, benzene, n-hexane, nước
hay cũng có thể là hỗn hợp của 2 hoặc 3 dung môi được trộn với nhau theo
những tỷ lệ phù hợp. Ví dụ hỗn hợp của methanol với nước (MeOH + H
2
O) trong
tỷ lệ 70/30 (V/V), acetonitrile với nước (CH
3
CN + H
2
O) trong tỷ lệ 80/20
(V/V),…Nó cũng có thể là dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo

9

phức, chất làm chậm,…với nồng độ nhất định. Nói chung, với mỗi loại sắc ký sẽ
có các hệ dung môi (pha động: MP) rửa giải riêng phù hợp với nó, để có thể thu
được hiệu quả tách tốt nhất.
Trong kỹ thuật HPLC pha động cần phải thỏa mãn một số điều kiện sau
đây:
- Pha động phải trơ đối với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất
kỳ một tính chất nào trong quá trình sắc ký. Không có sự tương tác phụ với pha
tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp cho quá trình tách.
- Pha động phải hòa tan được chất mẫu. Có như thế mới làm cho chất

mẫu được vận chuyển tốt từ đầu cột tách (lúc nạp mẫu vào) đến cuối cột tách (lúc
chất mẫu ra khỏi cột tách), khi thực hiện quá trình rửa giải (sắc ký).
- Pha động phải bền vững theo thời gian, có thành phần khống chế được
trong quá trình sắc ký. Nghĩa là nó không bị phân hủy hay thay đổi không theo ý
muốn khi chạy sắc ký.
- Pha động phải có độ tinh khiết cao, để đảm bảo không bị nhiễm bẩn
mẫu phân tích, gây sai số cho kết quả tách. Nghĩa là các chất để pha chế pha
động phải có độ tinh khiết cao. Vì thế, người ta thường dùng các loại hóa chất có
độ sạch ở mức độ mg (Chemicals for HPLC).
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng hấp phụ,
phân bố, trao đổi ion, tùy theo bản chất của từng loại sắc ký.
- Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích,
không làm hư hại đến flowcell của detector. Ví dụ: dùng loại detector UV hay
UV-VIS thì pha động phải trong suốt trong các vùng phổ đó, dùng detector
huỳnh quang thì pha động phải không có tính huỳnh quang…
- Điều kiện cuối cùng là pha động đó phải có tính chất kinh tế, không
hiếm, không quá đắt. Tất nhiên, yếu tố này trong sắc ký điều chế có ý nghĩa rất
lớn, nhưng trong phân tích, không ít trường hợp ta phải chấp nhận pha động đắt
tiền để đảm bảo kết quả phân tích chính xác theo yêu cầu đặt ra, đặc biệt là việc
phân tích lượng vết bên cạnh một lượng lớn chất khác.
Đó là các yêu cầu cần thiết đối với một hệ pha động trong kỹ thuật tách
HPLC cho sự tách và phân tích một hỗn hợp mẫu nhất định. Tất nhiên, các điều
kiện đó cần được xem xét cụ thể trong mỗi trường hợp của hỗn hợp mẫu phân
tích, để xem có thể bỏ qua được yếu tố nào, từ đó chọn một pha động tốt nhất cho
đối tượng nghiên cứu.
2.4.2.3 Một số yêu cầu đối với detector dùng trong kỹ thuật HPLC

10

Detector cần phải thoả mãn được một số yêu cầu sau đây, mới có thể dùng

được trong kỹ thuật HPLC.
- Có tính chất chọn lọc cho chất phân tích hay một nhóm các chất phân
tích, độ chọn lọc càng cao càng tốt.
- Có độ nhạy cao đối với chất phân tích trong hỗn hợp mẫu. Có như thế
mới phát hiện và đo định lượng được các nồng độ nhỏ.
- Phải hoạt động ổn định và bền vững với những điều kiện nhất định của
hệ pha trong quá trình sắc ký.
- Vùng tuyến tính động học của phép đo không quá nhỏ. Nghĩa là càng
rộng càng tốt cho việc phát hiện và định lượng được các chất trong một vùng
nồng độ rộng.
- Không bị ảnh hưởng hoặc ít bị ảnh hưởng của các tác động của môi
trường xung quanh, như độ ẩm, áp suất, nhiệt độ.
- Không quá phức tạp,không khó sử dụng và không quá đắt tiền.
- Độ nhiễu tự thân của detector phải nhỏ.
- Ngày nay, có rất nhiều loại detector đã thoả mãn được những yêu cầu
trên và đã được đưa vào sử dụng phổ biến với kết quả tốt.
2.4.2.4 Phép ghi phổ khối lượng
a) Nguyên lí máy phổ khối lượng
Nói một cách đơn giản, máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện ba
nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí (làm bay hơi mẫu
nghiên cứu ở áp suất thấp và nhiệt độ thích hợp); tạo ra các ion từ các phân tử khí
đó; phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lượng / điện tích (m/z)
của chúng. Bởi vì, xác suất tạo thành các ion có z >1 là rất nhỏ và vì e = const (e
là điện tích của một electron), do đó thông thường m/z là khối lượng của ion.
Như thế, máy phổ khối lượng là một thiết bị “ sản suất “ ra các ion xác định khối
lượng của chúng (phân tích các ion).
Về mặt nguyên lí hoạt động, có thể sơ đồ hóa một máy phổ khối lượng
thành bốn khối: 1) Khối làm bay hơi mẫu, 2) Khối tạo ra các ion, 3) Khối phân
tách các ion và 4) Khối thu nhận tín hiệu các ion, khuếch đại rồi ghi thành phổ.
Tất nhiên, máy phổ khối lượng phải được nối với máy tính để tự động hóa, để

tăng hiệu quả sử dụng và khai thác các kết quả thu được.
b) Nguyên tắc
Nguyên tắc là bằng một hiện tượng hóa lý thích hợp, ion được sinh ra từ
một phân tử hóa chất ban đầu. Các ion này được tách ra tùy theo khối lượng và
điện tích của ion, rồi được hứng bằng một hệ thống vật lý thích nghi về một bộ

11

phận thu ion. Dòng điện sinh ra từ các ion được khếch đại và được ghi nhận dưới
dạng mũi ion trên một giản đồ cường độ mũi theo m/z (m: là khối lượng và z: là
điện tích ion). Nếu z = 1 thì đó là giản đồ của tập hợp các mũi theo khối lượng.
Từ đó khối phổ được gán cho giản đồ này. Hiện nay, khối phổ thường được biểu
diễn dưới dạng giản đồ vạch.
Khối phổ cho biết khối lượng của phân tử và khối lượng của các mảnh vỡ
được tạo ra từ nó. Trong giản đồ MS trên, trục hoành chỉ khối lượng (thực tế là
m/z, tỉ số của khối lượng đối với điện tích của ion), còn trục tung chỉ cường độ
tương đối.
Thông tin từ MS:
- Trong MS chúng ta đo khối lượng của chất, thực tế là tỉ số khối lượng
trên điện tích (m/z).
- Những thuận lợi của MS: chỉ cần một lượng rất nhỏ vật liệu đầu (mẫu)
để đo, có thể phân tích hỗn hợp.
- Những bất lợi: phá vỡ cấu trúc phân tử, những phân tử phức tạp thì
khó suy luận kết quả chính xác.
- Mẫu sử dụng có thể là vô cơ hay hữu cơ tinh khiết, có thể là hỗn hợp
phức tạp như các mẫu sinh học.
2.4. 3 Giới thiệu hệ thống AAS
2.4.3.1 Nguyên tắc của phép đo AAS
Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích
từ trạng thái ban đầu thành trạng thái hơi của nguyên tử tự do. Đó là quá trình

hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu. Nhờ đó ta có được đám hơi của các nguyên tử tự
do của nguyên tố trong mẫu phân tích.
Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua
đám hơi nguyên tử vừa điều chế ở trên. Các nguyên tử của nguyên tố cần xác
định trong đám hơi đó sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp
thụ của nó
Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ thu toàn bộ chùm sáng , phân li
và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của
nó. Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử.
Thông thuờng có các kỹ thuật nguyên tử hóa trong hấp thu nguyên tử:
a. Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa khí cháy (FAAS: flame atomic
absorption spectrometry).

12

b. Nguyên tử hóa dùng lò nhiệt điện (electrothermal hay ET) mà phương
tiện hay dùng là lò graphic (graphite furnace), có thể gọi phương pháp này là ET-
AAS hay GF-AAS.
c. Nguyên tử hóa thông qua việc tạo các hơi hydrua dễ nguyên tử hóa
(HGAAS: hydride generation atomic absorption spectrometry).
d. Nguyên tử hóa qua phản ứng hóa học ở nhiệt độ thấp, CV-AAS (cold
vapour AAS).
2.4.3.2 Nguyên lý hoạt động của hệ thống hóa hơi FIAS – 100 (dùng trong
phân tích Arsenic)
Khi hoạt động, chất mang và chất khử được hút liên tục vào hệ thống phản
ứng nhờ một hệ thống bơm nhu động với lưu lượng tương ứng là 10 – 20ml/phút
và 4-6ml/phút. Khi thực hiện phép đo, 0.5ml mẫu được hút vào trong 10 giây và
được trộn đều với chất mang và chất khử để nâng cao hiệu quả phản ứng. Phản
ứng được tiến hành trong 15 giây, khí AsH
3

sinh ra cùng dung dịch sau phản ứng
được đưa đến hệ thống phân tách lỏng khí, ở đây dưới tác dụng của dòng khí
mang AsH
3
được tách ra và được đưa đến ống hấp thu đã được nung nóng ở
900
o
C, tại đây hơi AsH bị phân hủy và As được nguyên tử hóa để cho tín hiệu
hấp thu


13

Chương III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Các phương pháp và phương tiện thực nghiệm
3.1.1 Các phương pháp
Ø Phương pháp tổng kết kinh nghiệm:
- Nhận đề tài.
- Sưu tầm và đọc tài liệu.
- Xây dựng cơ sở lý thuyết.
- Viết bài.
Ø Phương pháp thực nghiệm:
- Chuẩn bị
+ Nhận đề tài và địa điểm thực tập
+ Đọc trước lý thuyết và chuẩn bị những kiến thức cần thiết để
thực tập.
- Thực tập tại công ty và viết bài
3.1.2 Phương tiện thực hiện
- Các tài liệu có liên quan.
- Các giáo trình thực tập.

- Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm, cùng một số phương tiện khác có liên
quan, cần thiết có sẵn tại phòng thí nghiệm của công ty.
3.2 Các bước thực hiện đề tài
- Nhận đề tài.
- Sưu tầm tài liệu.
- Nghiên cứu các tài liệu có liên quan.
- Thực tập tại công ty để tìm hiểu các phương pháp kiểm kháng sinh,
kim loại nặng
- Rút ra qui trình phân tích
- Viết bài báo cáo.
3.3 Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 02/2009 đến 05/2009


14

Chương IV: KẾT QUẢ
Qua quá trình tìm hiểu các phương pháp kiểm nghiệm tại phòng kiểm
nghiệm Intertek – Cần Thơ trên mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản thu được một
số phương pháp phân tích kháng sinh, hóa chất, kim loại nặng trên nền mẫu thủy
sản và sản phẩm thủy sản
4.1 Một số phương pháp kiểm các nhóm kháng sinh
4.1.1 Nhóm kháng sinh Cloramphenicol
ĐỊNH LƯỢNG CLORAMPHENICOL
TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG
SẮC LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS
1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này hướng dẫn xác định hàm lượng cloramphenicol trong
thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện
của phương pháp là 0.08ppb.
2. Nguyên tắc

Cloramphenicol được chiết tách từ mẫu thủy sản bằng etylacetat, cô dịch
chiết bằng khí nitơ ở 50
o
C, cặn khô được hòa tan trong dung dịch acid acetic
0.05%, sau đó được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (SPE C18).
Hàm lượng cloramphenicol được xác định bằng LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện
là 0.08ppb.
3. Thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống sắc ký lỏng gồm: bơm và bộ tiêm mẫu tự động.
- Đầu dò MS (ThermoQuest Finnigan TSQ Quantum)
- Phần mềm điều khiển: Xcalibur Version 1.3.
- Cột LC: Waters brand Xterra C18 kích thước 2.1 x 150mm, kích thước
hạt 3.5mm.
- Máy Vortex, máy lắc
- Bộ thổi khí nitơ N – EVAP
- Cột SPE: C18 Varian Bond Elul 6cc/500mg
- Một số hóa chất sử dụng cho HPLC như: acetonitrile, ethyl acetate,
ammonium hydroxide (NH
3
30%), axit acetic.
- Màng lọc Acrodisc (đường kính màng 13mm, đường kính lỗ 0.45mm)
4. Hóa chất