Kỹ thuật sắc ký cột hở

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (987.2 KB, 30 trang )

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT

1

Phương pháp sắc ký

2

Dụng cụ - hóa chất

3

Kỹ thuật tiến hành

4

Ưu - nhược điểm

Phương Pháp Sắc Ký

Nguyên tắc phương pháp sắc ký
Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai
pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định.
-

Pha tĩnh: đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích

- Pha động di chuyển qua pha tĩnh bởi áp suất hoặc do trọng lực.

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống trơ về mặt hóa học đối với các chất trong quá trình sắc ký
có thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng

1

Nguyên tắc phương pháp sắc ký
Chất hấp phụ thuường dùng là alumina, silica gel, CaCO3, than hoạt tính, polyamid, các loại có gắn nhóm ion,... Các
chất này phải được tiêu chuẩn hóa.
Dung môi dùng có thể là một hoặc hỗn hợp nhiều loại dung môi có tỉ lệ thích hợp. Quy trình rửa giải là sử dụng dung
môi có tính chất hướng về một phía hoặc tăng hoăcc̣ giảm về tính chất. Với các chất hấp phụ pha thuận cở điển, dung
môi sử dụng có độ phân cực tăng dần.
Việc tách hai hợp chất đạt kết quả tốt hay không là tùy thuộc vào hệ số phân chia . Bất kỳ một hợp chất nào khi được
đặt vào một hệ thống gồm có 2 pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ
nồng độ cố định, tỉ lệ này thay đởi tùy vào các tính chất động học của các hợp chất và của cả hai pha
Do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

2

Phân loại sắc ký
Theo pha động:

Theo khơng gian:

•
•
•

•

•
•

Sắc ký khí: pha động là khí
Sắc ký lỏng: pha động là lỏng
Sắc ký chất lỏng siêu tới hạn: CO2 lỏng

Theo cơ chế:
•
•
•
•

3

Sắc ký hấp phụ
Sắc ký phân bố
Sắc ký ion
Sắc ký rây phân tử

Sắc ký cột
Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký giấy

Dụng cụ, hoá chất

Dụng cụ, hố chất
1. Cột

Cột là những ớng hình trụ bằng thủy tinh dài 30-70 cm,
đường kính 1-5 cm, đầu dưới có một vòi thủy tinh và 1 khóa
để điều chỉnh tốc độ chảy.
Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu chất cần phân
tách

4

-

Trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 25- 50 lần trọng
lượng mẫu cần sắc ký.

-

Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp phụ và đường kính trong
của cột vào khoảng 10:1

Dụng cụ, hố chất
2. Pha tĩnh
Silica gel
•

Silica gel pha thường: đường kính trung bình 40 – 200µm, các lỡ rỡng có đường kính trung bình 40 – 300Å,
diện tích bề mặt khoảng 100 – 800 m2/g.

•

Vị trí hoạt động: nhóm silanol, hoạt động mạnh tạo nối hydrogen mạnh với những hợp chất được sắc ký,

những chất phân cực bị silica giữ chặt lại trong cột và giải ly chậm hơn và ngược lại.

•

Có thể điều chỉnh hoạt tính bề mặt của silica gel bằng cách:

- Thêm nước (giảm hoạt tính) hoặc loại bỏ nước (tăng hoạt tính).
- Kết hợp với những hợp chất khác (silica gel cơ chế hóa)

5

Dụng cụ, hoá chất
2. Pha tĩnh
Alumina
Alumina là oxid aluminium Al2O3, qui trình điều chế tương tự silica gel nhưng trên
nguyên liệu là hydroxid aluminium, hơn thế nữa có thể điều chỉnh độ pH của dung dịch
phản ứng để sản xuất ra hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính kiềm hay trung tính.
-

Alumina trung tính: pH từ 6,5-7
Alumina axit: pH 4
Alumina base: chứa khoảng 0,1-0,5% NaOH bám trên mặt alumina ở dạng natri
aluminat, có pH 10

Muốn có alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun nóng alumina ở 400-450 oC trong 12-16
giờ.
Muốn giảm hoạt tính alumina, thêm nước vào.
6

Dụng cụ, hoá chất
2. Pha tĩnh
Kieselguhr - Celite

Gel

Là đất sét diatomit, có các lỡ rỡng lớn, diện tích bề

Là các loại pha tĩnh điều chế từ tinh bột, agar

mặt lớn, tính hấp phụ rất yếu; giảm khả năng hấp

(polysaccarid) hoặc polyacrylamide

phụ bằng cách thêm HCl 3%, rửa sạch clor và sấy
khố ở 80 sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân
chia.

7

Dụng cụ, hoá chất
3. Dung môi:
Đây là lựa chọn khó nhất và cũng quan trọng nhất.
Sắc ký cột, thường tiến hành với một hỗn hợp 2 dung môi được dùng làm pha động: một dung môi phân cực và
một dung môi không phân cực. Đôi khi có thể dùng một dung môi duy nhất hoặc hỗn hợp 3 dung môi khác nhau.
Muốn phân tách sản phẩm và
tạp chất tốt nhất và dùng tiết
kiệm dung môi phải chạy mẫu

trên sắc ký bản mỏng (TLC) –
bản nhôm hoặc kính phủ silica
(thường là bản nhôm vì rẻ hơn).

8

Dụng cụ, hoá chất
3. Dung môi:
Bước 1: Mẫu cần sắc kí được hòa tan hoàn toàn trong dung
môi phù hợp, với nồng độ 10mg/ml gọi là dung dịch mẫu (A).
Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5 x 10 cm. Chấm lên
những tấm bản này mỗi tấm 1 chấm khoảng 2-5μl dung dịch
(A).
Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với 1 loại dung môi giải
ly khác nhau, kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV
hoặc bằng các thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy
được dung môi nào là phù hợp. Tìm một hỗn hợp dung môi,
trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân
cực.

9

Dụng cụ, hố chất

Bước 4:

10

•

Với hỡn hợp mẫu chất là kết quả của phản ứng tổng hợp hữu cơ, ta
chọn hệ dung môi có thể đẩy hợp chất cần quan tâm lên ở vị trí trên
bản với Rf = 0,2-0,3.

•

Với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ, chọn dung môi giải ly đầu tiên
là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở
bản với Rf = 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi
có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bản với Rf =
0,2.

Dụng cụ, hố chất
Có 2 ́u tớ khác cần xem xét khi chọn dung môi:
Giá thành
Nếu 2 hệ dung môi cho hiệu quả phân tách tương đương nhau, đương nhiên nên lựa chọn dung môi không bị
halogen hóa và rẻ hơn. Điển hình là hỗn hợp dung môi hexan:etyl axetat
Điểm sôi
Thường lựa chọn dung môi có nhiệt độ sôi thấp hơn. Sẽ tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức khi phải
tiến hành thí nghiệm lâu vì dung môi có nhiệt độ sôi cao hơn sẽ tốn thời gian để bay hơi hơn và cần nhiệt cao
hơn hay áp suất thấp hơn để loại bỏ

11

Dụng cụ, hoá chất
4. Mẫu sắc ký

Mẫu thử trước khi phân tích phải được loại tạp chất bằng phương pháp thích hợp.
Mẫu thử có thể ở 2 dạng:
- Dạng dung dịch khá đậm đặc: hòa tan mẫu trong dung môi không quá phân cực so với
hệ dung môi pha động.
-

Dạng bột khô: hòa tan mẫu trong dung môi như etyl axetat hoặc methanol, thêm vào
silica gel hạt lớn vừa đủ, cô quay hỗn hợp để đuổi hết dung môi thu được mẫu ở dạng
bột mịn tơi xốp.
Dạng dung dịch
đậm đặc

12

Dạng bột khô

1. Kỹ Thuật Tiến Hành

1.Nhồi cột
Cách 1:
1.Cho dung môi vào cột, cho chạy qua cát và miếng đêm bông
vải để loại bọt khí trong đó (Hình 4, bước B)
2.Đặt phễu khô trên đỉnh cột và đổ từ từ silica hoặc alumina (pha
tĩnh) vào trong dung môi này. Để dung môi chảy ra từ từ tránh bị
tràn (hình 4, bước C)
3.Để pha tĩnh lắng xuống và nhẹ nhàng đóng van cột lại để
silica/alumina được nhồi chặt trong cột (Hình 4, bước D)
4.Tháo dung môi đến mức chạm vào bề mặt pha rắn (hình 4,

bước E)

13

1.Nhồi cột
Cách 2:
1. Thêm silica gel khô vào cột và nối chân không bằng cách nối ống chân
không vào đầu ra của cột (hình 5, bước B). Chân không giúp quá trình
nén silica gel và giữ nó ổn định cho bước tiếp theo.
2. Khi tạo độ chân không rồi, rót từ từ dung môi vào (Hình 5, bước D)
3. Để dung môi chảy qua cột tới khi chảy đến đáy cột. Tại điểm này, đóng
van và tắt chân không (Hình 5, bước E)
4. Để dung môi qua cột với lượng khoảng 5 – 6 lần lượng dung môi đầy cột
để đảm bảo hoàn thành quá trình nhồi cột
5. Tháo dung môi cho tới khi mức dung môi trong cột chạm vào bề mặt pha
tĩnh (hình 5, bước F)
14

1.Nhồi Cột
Cách 3:
1. Rót dung môi vào khoảng 1/3 dung tích cột (Hình 6, bước B).Dùng
cớc có mỏ, đong lượng silica/alumina vừa đủ
2. Đong lượng dung môi gấp khoảng 1,5 lần lượng silica. Thêm silica
vào dung môi, từng ít một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, khuấy lên.
3. Rót hoặc dùng pipet để thêm hỗn hợp silica và dung môi vào cột.
Để dung môi thoát ra khỏi cột tránh bị tràn (Hình 6, bước C).Gõ nhẹ
vào cột để bọt khí thoát ra và silica lắng xuống (Hình 6, bước D)
4. Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột đến khi tất cả lượng silica/alumina

hết.Rửa thành cột bằng cách rót dung môi lên thành trong của cột.
5. Mở van tháo dung môi đến khi mức dung môi trong cột chạm đến
bề mặt của pha tĩnh (Hình 6, bước E)
15

Nạp mẫu
Nạp mẫu dạng dung dịch
•

Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng
của chất hấp phụ trong cột.

Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột
•
•
•
•
•

16

Đóng khóa lại, dùng pipette hút dung dịch mẫu chất và nạp vào đầu cột. Đặt đầu của pipette gần sát với mặt
thoáng của chất hấp phụ trong cột, vừa bóp vừa rây pipette dọc quanh thành trong của cột, cho dung dịch chất
chảy ra dọc theo thành trong của cột chạm xuống bề mặt của chất hấp phụ .
Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp phụ trên
đầu cột.
Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, dùng dung môi này để rửa sạch dung dịch mẫu chất
đã dính trên thành cột. Tiếp tục mở khóa cho dung môi chảy qua. Lặp lại vài lần như thế để dung dịch mẫu thấm
sâu vào phần chất hấp phụ ở phần đầu cột và phần dung môi trên đầu cột trở nên trong suốt.

Cho một lớp cát (hoặc bông gòn) dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ
mặt cột.
Sau khi nạp mẫu xong cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.

Nạp mẫu
Nạp mẫu dạng bột khơ:
•

Đặt mẫu khô lên đầu cột, dùng dung môi bắt đầu sắc ký cột thấm ướt toàn bộ silica gel.

•

Cho một lớp bông gòn trên bề mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ.

•

Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.

17

Giải ly chất ra khỏi cột
Các phương pháp giải ly
•

Giải ly nhờ trọng lực: các hạt gel nạp vào cột co kớch thuc ln hon 60àm

ã

Gii ly s dng lc đẩy: dùng máy bơm tạo áp lực để đẩy dung môi qua pha tĩnh, kích thước hạt gel
40-63 µm, cột sắc ký có thành dày với lớp bao lưới che chắn bên ngoài để tránh vỡ cột khi có áp suất
cao

•

18

Giải ly sử dụng lực hút: dùng máy bơm hút chân không ở đầu ra của cột.

Giải ly chất ra khỏi cột
Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly
•

Giải ly sử dụng dung môi đơn nờng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung
môi nhưng trong hỗn hợp tỉ lệ giữa các thành phần không thay đổi để giải ly cho đến
khi việc tách chất hoàn tất.

•

Giải ly sử dụng dung môi có nờng độ tăng theo kiểu bậc thang: Việc sử dụng một loại
dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định và một số cấu tử khác có
tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Vì thế muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải
dùng một dung môi có ái lực mạnh hơn.

•

Giải ly sử dụng dung môi với nồng độ tăng dần tuyến tính: Dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần đều.

19

Giải ly chất ra khỏi cột
Vận tốc giải ly
•

Vận tớc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp phụ) cũng
không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuếch tán hoặc trải
dài theo mọi hướng làm xấu quá trình tách.

•

Thông thường trong đa sớ sắc ký cột, vận tớc giải ly khoảng 5-50 giọt/phút hoặc 1-2 cm/phút.

20

Kỹ thuật sắc ký cột hở

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về