NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CONESSINE TRONG DƯỢC LIỆU MỨC HOA TRẮNG (Holarrhena pubescens Wall.ex G.Don)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA HÓA HỌC
..........

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH
CONESSINE TRONG DƯỢC LIỆU MỨC HOA TRẮNG (Holarrhena
pubescens Wall.ex G.Don)
Cán bộ hướng dẫn:
Nơi thực hiện:

HÀ NỘI - 2021

1

Viện Dược liệu


LỜI CẢM ƠN
Báo cáo Nghiên cứu khoa học được thực hiện tại Khoa Hóa Thực vật I –
Viện Dược liệu Trung Ương; số 3B, Quang Trung, phường Tràng Tiền, quận
Hoàn Kiếm, Hà Nội; tháng 8 năm 2020 – tháng 4 năm 2021.
Với tấm lòng trân trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới:
– Trưởng khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu đã giao đề tài và tạo điều
kiện giúp đỡ em trong quá trình viết bài luận.
– bộ mơn Hóa học hữu cơ, khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên –
Đại học Quốc gia Hà Nội đã tin tưởng và giới thiệu cho em có cơ hội được thực
hiện đề tài tại Viện Dược liệu
– Nghiên cứu viên, khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu đã tận tình chỉ bảo,
tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian qua.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh chị, bạn bè tại khoa Hóa
thực vật, Viện Dược liệu đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ để em hoàn thành đề tài
một cách tốt nhất.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, tháng 4 năm
2021
Sinh viên

2


ĐẶT VẤN ĐỀ
Mức hoa trắng là một cây thuốc nam quý của Việt Nam, được tìm thấy ở nhiều
quốc gia như Ấn Độ, Thái Lan, Malaysia hay Miễn Điện… Riêng ở nước ta, cây
mọc hoang khắp nơi. Điển hình nhất là các tỉnh miền Bắc như Cao Bằng, Vĩnh
Phúc, Lạng Sơn, Phú Thọ, Hịa Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang… Được sử dụng
rộng rãi để làm thuốc phục vụ đời sống con người. Theo Y học cổ truyền, Mức
hoa trắng có thành phần hóa học đa dạng và dược tính cao để điều trị các bệnh
như kiết lỵ và viêm đại tràng. Để góp phần nâng cao giá trị sử dụng của dược
liệu này, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp phân lập và
xác định conessine trong dược liệu Mức hoa trắng (Holarrhena pubescens
Wall.ex G.Don)” .

3


Contents
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................3
MỤC LỤC HÌNH ẢNH..................................................................................5
I.

TỔNG QUAN..........................................................................................7

I.1 Đặc điểm thực vật và phân bố sinh thái...............................................7
I.1.1 Vị trí phân loại chi Holarrhena..............................................................7
I.1.2

Đặc điểm chung của họ Trúc đào (Apocynaceae).................................7

I.1.3

Chi Holarrhena ở Việt Nam...................................................................8

I.1.4 Đặc điểm thực vật loài Mức hoa trắng (Holarrhena pubescens
Wall.ex) G.Don.....................................................................................................9
I.2 Thành phần hóa học của Mức hoa trắng ( Holarrhena pubescens
Wall.ex)...............................................................................................................11
I.3 Tác dụng dược lý..................................................................................12
I.3.1 Chữa bệnh kiết lỵ..................................................................................12
I.3.2

Ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm đại tràng........................................12

I.3.3

Chữa lỵ amip.........................................................................................12

I.4 Về Alcaloid............................................................................................13
I.4.1 Khái niệm về alcaloid...........................................................................13
I.4.2

Các phương pháp định tính và định lượng alcaloid..........................13

I.5 Về alcaloid trong mức hoa trắng..........................................................15
I.5.1 Một số phương pháp phân lập alcaloid toàn phần................................15
I.5.2 Các phương pháp phân lập conessine trong dược liệu.........................16
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................17
II.1 Đối tượng nghiên cứu............................................................................17
II.2 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu..................................................17
II.3 Hóa chất, dung mơi................................................................................18
II.5 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng...................................18
III. Thực nghiệm..........................................................................................18
IV. Kết quả và bàn luận................................................................................19
IV.1 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH = 7/3........................................19
IV.2 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/1%......................19
IV.3 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/0,5%....................20
4


IV.4 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/0,25%..................21
V. Tài liệu tham khảo................................................................................23

MỤC LỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
P
L
C
L
C

Sắc kí lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
Sắc kí lớp mỏng
(Thin Layer Chromatography)

5


Sắc kí đồ
K
Đ
Ethylacetate
tO
A
c
Cloroform
H
Cl
3

Dichloromethane
C
M
Methanol
e
O
H
Trimethylamine
M

A
Natri cacbonat
a2
C
O

6


I. TỔNG QUAN
I.1 Đặc điểm thực vật và phân bố sinh thái.
I.1.1

Vị trí phân loại chi Holarrhena.

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987, chi Holarrhena thuộc[3],[4],
[6]:
-

Giới thực vật (Plantae)

-

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

-

Lớp Ngọc lan (Magroliopsida)

-

Phân lớp Hoa môi (Lamiidae)

-

Liên bộ Long đởm (Gentiananae)

-

Bộ Long đởm (Gentianales)

-

Họ Trúc đào (Apocynaceae)

-

Chi Holarrhena

7


I.1.2

Đặc điểm chung của họ Trúc đào (Apocynaceae).

Họ Trúc đào có đặc điểm sau:
- Cây gỗ, bụi, có khi là dây leo hoặc cỏ. Cây có nhựa mủ trắng.
- Lá đơn, ngun, mọc đối hay mọc vịng, khơng lá kèm (ít khi mọc cách).
- Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, xếp thành chùm gồm nhiều cụm hoa đơn vị xim. Lá

đài thường có vảy tuyến. Cánh hoa có 5 thùy ở phần trên, xếp xoắn ốc và hợp
lại ở dưới thành ống. Ống tràng có phần phụ ở phía trong, thùy tràng xếp vặn (ít
khi xếp lợp). Nhị đẳng số, đính trên ống tràng và xen kẽ với các thùy của tràng.
Chỉ nhị ngắn hình mũi tên, bao phấn dài nhọn chụm lại ở đỉnh hay dính với đầu
nhụy. Có triền hình vịng hay hình chén hoặc là những tuyến mật riêng rẽ. Bộ
nhụy thường gồm 2 lá noãn, các lá nỗn thường chỉ dính ở gốc hoặc ở đỉnh vịi,
với núm nhụy phình rộng. Hạt phấn rời. Đĩa tuyến mật bao quanh bầu. Bầu dưới
có hai lá nỗn chỉ gắn liền với nhau ở phần trên.[3],[4],[6]
- Quả gồm 2 đại dài hay hình cầu chỗi ra, hoặc quả khơ khơng mở. Hạt thường
có cánh hay có chùm lơng ở 1 hoặc ở cả 2 đầu.

8


Hình I.1.2 Cành, lá, hoa, quả cây Mức hoa Trắng(Holarrhena pubescens Wall.ex)

Họ Trúc đào có khoảng 200 chi với 2000 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới, một số ở vùng ơn đới, Việt Nam có khoảng 52 chi, 170 loài, phần
lớn mọc hoang, một số được trồng làm cảnh.
I.1.3

Chi Holarrhena ở Việt Nam

Holarrhena R.Br. là một chi nhỏ, có 4 lồi ở vùng nhiệt đới châu Phi và châu
Á. Ở Việt Nam có 3 lồi:
- H. antidysenterica Wall. (H. pubescens Wall. ; H. malaccensis Wight.).
- H. curtisii King et Gamble (H. crassifolia Pierre in spire).
- H. similis Craib.
Trong đó, H. curtisii và H. similis là những loài chưa được nghiên cứu.[1]
I.1.4

Đặc điểm thực vật loài Mức hoa trắng (Holarrhena pubescens

Wall.ex) G.Don
I.1.4.1

Tên gọi
-

Tên khoa học: Holarrhena antidysenterica Wall., họ Trúc đào

(Apocynaceae).[3]
-

Tên khác: Mức lông, Sừng trâu, Thừng mực lá to, Mực hoa trắng.[4]

-

Tên đồng nghĩa: Echites antidysenterica Roxb. ex Flem., Holarrhena

antidysenterica (Roxb. ex Flem.) A. DC.
9


-

Tên nước ngoài: Conessi bark, kurchi bark, bitter oleander, dysentery

rose-bay, tellicherry bark (Anh); ecorce de codagapala (Pháp).
I.1.4.2

Đặc điểm thực vật
Cây gỗ to mọc thẳng đứng có thể cao trên 10 m, có nhựa mủ trắng. Thân già

màu nâu đen xù xì có lớp vỏ dày, thân non màu xanh hoặc màu đỏ nâu có nhiều
lơng che chở màu trắng. [3],[4],[6]
Lá đơn, nguyên, mọc đối; phiến lá hình xoan hoặc hình trứng đỉnh kéo dài
thành mũi nhọn dài 0,5-1 cm, màu xanh đậm mặt trên hơn mặt dưới, có lơng
trắng ở mặt dưới nhiều hơn mặt trên, kích thước dài 7-11 cm, rộng 5-6 cm. Gân
lá hình lơng chim, 9-13 cặp gân phụ cấp 1 hơi chếch không đối nhau chạy sát
mép và nối nhau ở mép rất mờ, gân phụ cấp 2 hình lưới rõ. Cuống lá ngắn, hình
trụ, dài 0,5-0,6 cm, màu xanh, nhiều lơng. Khơng có lá kèm. Cụm hoa xim 2
ngả mọc ở nách lá hoặc ở ngọn cành, cuống cụm hoa dài 1,5-2 cm.
Hoa màu trắng, thơm, đều, lưỡng tính, mẫu 5. Cuống hoa dài 1-1,5 cm, màu
xanh, có lơng dày. Lá bắc và lá bắc con dạng vẩy màu xanh có lơng, tồn tại lâu.
Đài hoa: 5 lá đài nhỏ, đều, rời, màu xanh, dạng vẩy dài 0,15-0,2 cm, rộng 0,7-1
cm, mặt ngồi có nhiều lơng màu trắng; có các tuyến hình vảy màu vàng ở gốc
mặt trong của lá đài, tiền khai năm điểm. Tràng hoa: 5 cánh hoa đều, màu trắng,
dính phía dưới tạo thành ống phình to ở gần đáy dài 0,4-0,5 cm, 5 phiến phía
trên hình thn dài đầu tù, dài 1,3-1,5cm, rộng 0,3-0,4 cm, mặt trong của phiến
có lơng tiết dính, mặt ngồi có lơng che chở, tiền khai vặn theo chiều kim đồng
hồ; họng tràng có tràng phụ dạng bản mỏng chia 2-3 thùy, dài 0,8-1 cm, rộng
0,2-0,3 cm, màu hồng, có lơng. Bộ nhị: 5 nhị đều, rời; chỉ nhị ngắn đính trên
họng tràng; bao phấn màu vàng chụm vào nhau, chung đới kéo dài thành mũi
nhọn và dính với đầu nhụy, dài 0,7-0,8 cm. Hạt phấn rời, hình cầu màu vàng,
đường kính 52,5 µm. Bộ nhụy: 2 lá nỗn rời, bầu trên, màu xanh, hình trứng cao
0,1-0,15 cm, nhiều nỗn đính bên. 1 vịi nhụy hình trụ trịn, màu trắng, dài 0,6
-0,7 cm; đầu nhụy hình nón dài 0,5 mm màu vàng nhẵn.
10

I.1.4.3

Phân bố, sinh thái
Mức hoa trắng phân bố rải rác ở vùng Nam Á và Đông Nam Á, bao gồm Ấn

Độ, Srilanca. Mianma, Thái Lan, Bắc Malaysia, Campuchia, Lào, Việt Nam và
Nam Trung Quốc. Cây cũng có ở vùng nhiệt đới châu Phi. Ở Việt Nam mức hoa
trắng là cây thường thấy ở vùng núi thấp và trung du, thuộc các tỉnh từ Tây
Ninh, Bình Dương, Đồng Nai, Lâm Đồng dọc theo miền Trung đến các tỉnh
giáp biên giới Trung Quốc như Cao Bằng, Quảng Ninh, Lạng Sơn. Độ cao phân
bố dưới 600m.[6]
Mức hoa trắng là cây ưa sáng, chịu hạn tốt do có bộ rễ cọc rất phát triển. Cây
thường mọc trong các quần hệ thứ sinh ít có cây gỗ to, ở đồi hay trong kiểu
rừng thưa nửa rụng lá ở các tỉnh Nam Tây Nguyên (Đắc Lắc, Bình Thuận, Đồng
Nai,…). Đơi khi cũng gặp trong kiểu rừng xen tre nứa. Cây sinh trưởng mạnh
trong mùa mưa ẩm, rụng lá vào mùa đông. Sau khi ra lá, cây mới có hoa; hoa
thụ phấn nhờ cơn trùng. Lượng hoa quả trên một cây thường rất lớn. Quả già
tách thành hai mảnh, hạt có túm lơng, phát tán nhờ gió. Ở Ấn Độ người ta đã
xác định 1 kg hạt có từ 32.000 – 35.000 hạt; hạt tươi có sức nảy mầm cao trong
vòng 2-3 tuần. Hạt để sau một năm khơng cịn khả năng nảy mầm . Mức hoa
trắng có khả năng tái sinh cây chồi khỏe sau khi bị chặt. Cây tồn tại được qua
đợt cháy rừng, do có phần vỏ thân dày và nhiều nhựa mủ, tái sinh vơ tính từ
đoạn thân, cành hay rễ.
Nguồn mức hoa trắng ở Việt Nam tương đối dồi dào, nhất là ở các tỉnh phía
nam, từ Nghệ An trở vào.
I.2 Thành phần hóa học của Mức hoa trắng ( Holarrhena pubescens
Wall.ex)
Vỏ thân chứa 9,5% gôm; 6,2% chất nhựa; 1,14% tannin; triterpen alcol;
lupeol; β-sitosterol; ankan và nhiều alcaloid. [3],[4]

Hàm lượng alcaloid thay đổi tùy theo sự phát triển của cây, cao nhất vào lúc
cây 8 – 12 tuổi. Hàm lượng alcaloid toàn phần: 0,22 – 4,2% trong vỏ. Cho tới
nay đã tìm thấy nhiều alcaloid như:
11


-

Conessimin (C23H28N2)

-

Isoconessimin (C23H38N2)

-

Holarimin (C21H34N2O)

-

Conimin (C22H36N2)

-

Conarimin (C21H34N2)

-

Holaremin (C24H38ON2)

-

Cokurchin (C21H32N2)

-

Conessine (C24H40N2)…
Trong

đó

conessine

Hình I.2.1- Công thức phân tử của Conessine

là

alcaloid chủ yếu trong cây.
Conessine có tinh thể hình lăng
trụ (kết tinh trong acetone) điểm
chảy 125°, [a]D= -l,9°(CHCl3)
hoặc +21°6(C2H5OH). Muối chlohydrat, bromhydrat và oxalat của conessine
tồn tại dưới dạng tinh thể. Độ tan trong nước của Conessine base là 1/5, độ tan
trong ethanol 90° là 1/11, ít tan trong ether.
- Thành phần hóa học khác trong cây:
+ Chất nhựa: Chất nhựa mủ trong cây (chứa nước và chất tan trong nước) chiếm
57,91%, cao su chiếm 1,5-9,7%, chất tủa keo có cao su chiếm 15-22,8%, nhựa
chiếm 74,1 - 82,8%, chất không tan chiếm 0,9-5,9%. Hai chất alcol nhựa
(resinol) được tách từ nhựa mủ là: Lettoresinol A (C 28H50O5) độ chảy 227280°C, Lettoresinol B (C28H56O2) độ chảy 136-137°C. Ngồi ra, mức hoa trắng
cịn chứa triterpen alcol, lupeol và (3 –sitosterol).

+ Gơm: Chất gơm có màu nâu, vị đắng, có tỷ trọng 1,092; chỉ số acid 65,28; chỉ
số ether 106; chỉ số xà phòng 171,42 và chỉ số acetyl 150,52.
+ Glycosid: Nhóm tác giả ở Pháp đã phân lập được từ vỏ 3 glycosid:
Normitiphyllin, holarosin A và holarosin B.

12


+ Các hợp chất vô cơ: Tro từ gỗ mức hoa trắng giàu chất kali gồm 17,5% chất
tan có: K2CO3 (10,82%), KC1 (4,2%), K2SO4 (2,48%) và chất tro không tan
80,24%.
I.3

Tác dụng dược lý

I.3.1
Chữa bệnh kiết lỵ
- Kiết lỵ là một bệnh đường ruột gây ra do vi khuẩn như salmonella và
shigella. Để chữa bệnh kiết lỵ, bạn cần bổ sung chất lỏng bị mất đi do tiêu
chảy. Cách chữa kiết lỵ từ mộc hoa trắng khá đơn giản:
+ Chuẩn bị: Phần vỏ cây mộc hoa trắng với lượng tùy ý.
+ Thực hiện: Đem phơi khô dược liệu rồi đi tán thành bột mịn. Có thể sắc với
nước hoặc hịa với nước sôi ấm uống mỗi ngày 10 – 15g. Dùng liên tục và đều
đặn đến khi các triệu chứng của bệnh thuyên giảm.
I.3.2

Ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm đại tràng
-

Là căn bệnh phổ biến ở hệ tiêu hoá, rất khó để điều trị dứt điểm. Người

bệnh thường xuyên bị làm phiền bởi những cơn đau đại tràng và tình trạng
rối loạn tiêu hố. Ngun nhân có thể bắt nguồn từ việc nhiễm khuẩn đường
tiêu hố hoặc thói quen ăn uống thiếu vệ sinh. Một số bài thuốc trị viêm đại
tràng từ mộc hoa trắng:

+ Bài thuốc 1: Cần chuẩn bị vỏ cây mộc hoa trắng với lượng tùy ý. Đem đi tán
thành bột mịn. Mỗi ngày dùng 10g sắc chung với nước để uống khi còn ấm.
+ Bài thuốc 2: Cần chuẩn bị phần hạt của mộc hoa trắng. Cũng đem tán dược
liệu thành bột rồi mỗi ngày lấy khoảng 10 -15g sắc lấy nước uống trong ngày.
Mỗi ngày có thể uống nhiều lần và cần duy trì trong thời gian dài.
I.3.3 Chữa lỵ amip
- Là một bệnh nhiễm ký sinh trùng đường ruột gây ra bởi các sinh vật đơn bào
(entamoeba histolytica). Bệnh tiến triển kéo dài và trở thành mạn tính nếu
khơng điều trị đúng cách. Do đó việc kiểm sốt thực phẩm cần hết sức
nghiêm ngặt, nhất là nguồn rau, củ, quả...
13


+ Vỏ cây, vỏ cành lớn của cây mức hoa trắng tán bột mịn, mỗi lần uống 10g
bột. Hoặc sắc với nước.
+ Mức hoa trắng, hoàng đằng, mỗi vị 10g, sắc uống trước bữa ăn khoảng 1,5
giờ. Không nên uống lúc q đói, để tránh bị nơn nao, cồn cào ruột gan. Khi
uống cần kiêng ăn các thức ăn có tính tanh, lạnh như cua, cá, ốc...
+ Hạt mức hoa trắng 3-6g, tán bột hoặc sắc nước uống.
+ Cao lỏng hạt mức hoa trắng uống ngày 1-3g.
Trên lâm sàng đã sử dụng dạng bào chế của conessine hydroclorid hay
hydrobromid để chữa lỵ amip, đạt hiệu lực như thuốc trị lỵ amip truyền thống
emetin, nhưng ít độc hơn và tiện dùng hơn emetin. Vì conessine có tác dụng cả
với kén và amip.
I.4 Về Alcaloid

I.4.1 Khái niệm về alcaloid
Alcaloid có nguốn gốc từ chữ: alkali tiếng Ả rập là kiềm. Alcaloid là:
- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vịng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở trong
nhiều lồi thực vật và đơi khi cịn tìm thấy trong một vài lồi động vật.
- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh.
- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng.
- Có một số phản ứng chung là tạo “ kết tủa” cần thiết cho sự xác định chúng.
I.4.2 Các phương pháp định tính và định lượng alcaloid
Người ta có thể định tính, định lượng toàn bộ alcaloid hay chỉ một hoặc vài
alcaloid là hoạt chất trong một dược liệu. Có nhiều phương pháp định tính, định
lượng như phương pháp cân, phương pháp HPLC, phương pháp sắc ký bản
mỏng TLC.[5]
I.4.2.1 Phương pháp cân
- Phạm vi sử dụng: những alcaloid có tính base rất yếu, vì những alcaloid
này không chuẩn độ được bằng phương pháp acid – base, do hằng số điện ly
quá bé sẽ không có bước nhảy trên đường cong chuẩn độ nên khơng quan sát
14


được sự chuyển màu rõ rệt của chỉ thị. Ngoài ra, phương pháp cân còn được
dung trong trường hợp định lượng những alcaloid chưa xác định rõ cấu trúc hóa
học hoặc hỗn hợp nhiều alcaloid có phân tử lượng rất khác nhau.
Để định lượng alcaloid bằng phương pháp, cần phải chiết được alcaloid tinh
khiết bằng một dung mơi thích hợp, đem cô dung môi, sấy cắn tới khối lượng
không đổi rồi đem cân (Nếu hàm lượng alcaloid thấp thì định lượng bằng
phương pháp cân trực tiếp khó chính xác, do đó có thể tạo ra các dẫn xuất có
khối lượng phân tử lớn bằng cách cho alcaloid tác dụng với thuốc thử tạo kết
tủa).
I.4.2.2 Phương pháp HPLC [5]
- Ưu điểm: Phương pháp HPLC có độ chính xác và độ nhạy cao, có tính đặc

hiệu, thực hiện tương đối nhanh và thuận tiện.
Cách tiến hành định lượng alcaloid bằng phương pháp HPLC:
- Alcaloid tinh khiết làm chất chuẩn.
- Xây dựng phương pháp chiết alcaloid trong dược liệu đáp ứng yêu cầu định
lượng.
- Xây dựng chương trình phân tích trên máy HPLC (pha tĩnh, pha động,
detceter, tốc độ dịng, thể tích tiêm, nhiệt độ phân tích)
- Tính kết quả: hàm lượng alcaloid cần định lượng được tính dựa trên diện
tích pic chất chuẩn và chất thử thu được trên sắc ký đồ theo cơng thức:
Sr: diện tích pic của alcaloid cần định lượng thu được trên sắc ký đồ của dung
dịch thử
Sc: diện tích pic của alcaloid chuẩn thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn
mc: lượng cân mẫu chuẩn (mg)
mr: lượng cân mẫu thử (mg)
Cc: hàm lượng alcaloid chuẩn (%)
b: độ ẩm của dược liệu

15


I.4.2.3 Phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC)
Muốn định tính các alcaloid phải chiết xuất alcaloid ra, loại các chất trở ngại
cho phản ứng, sau đó làm các phản ứng tạo tủa, tạo màu bằng thuốc thử chung
alcaloid. Ngày nay, kết hợp phương pháp sắc ký lớp mỏng có alcaloid tinh khiết
làm chất chuẩn so sánh.
Trong sắc ký bản mỏng có thể dùng:
- Chất hấp phụ là silicagel, nhơm oxit, bột cellulose…
- Tùy theo alcaloid mà người ta chọn hệ dung mơi khai triển cho thích hợp.
Một và hệ dung môi hay dung như: CHCl 3 – MeOH – NH4OH = (50:9:1),
Toluene: ethyl acetate: đietyl amin = (6,5:2,5:1).

- Thuốc thử:
+ Thuốc thử Mayer (K2HgI4 = Kali tetra iodo mercurat): cho tủa trắng, và
vàng nhạt.
+ Thuốc thử Bouchardat (Ido - iodua): cho tủa nâu.
+ Thuốc thử Dragendorff (KBiI4): cho tủa màu vàng da cam đến đỏ gạch.
+ Thuốc thử Bertrand (acid silicotungstic): cho màu vàng hay trắng.
+ Thuốc thử muối Reinecket {NH4Cr(CNS)4 (NH3)2} =Ammoni tetra
sulfocyanur diamin cromat III.
+ Thuốc thử acid picric bão hịa: cho tinh thể picrat alcaloid.
+ Ngồi ra còn thuốc thử AuCl3; PtCl3; picrolonic...
Thuốc thử bắt màu thường dung là Dragendorff (KBiI4).
I.5 Về alcaloid trong mức hoa trắng
I.5.1 Một số phương pháp phân lập alcaloid toàn phần
I.5.1.1 Nghiên cứu trong nước
Phạm Thanh Kỳ và cộng sự [1] phân lập Conessin và Norconessin trong
alcaloid toàn phần chiết xuất từ vỏ thân cây Mức hoa trắng bằng sắc kí cột theo
qui trình sau: Cột sắc ký kích thước 2cm x 50cm được lắp thẳng đứng trên giá.
Vặn chặt khóa cột. Lót một lớp bơng mỏng ở đáy cột. Cho từ từ silicagel trong
cloroform vào cột. Lót một miếng giấy lọc có đường kính bằng đường kính cột
16


trên bề mặt silicagel. Cuối cùng đặt một lớp bông mỏng trên miếng giấy lọc.
Mở khóa cho dung mơi chảy từ từ đến khi lớp cloroform trong cột vừa đến bề
mặt của bơng. Vặn khóa cột lại. Hịa 0,471 g cắn alcaloid toàn phần trong một
lượng tối thiểu cloroform vào cốc có mỏ. Đổ từ từ dịch cloroform vào cột. Rửa
giải alcaloid trong cột bằng cloroform và methanol, tăng dần độ phân cực như
sau:
CHCl3 (99,5 ml) : MeOH (0,5 ml) (I)
CHCl3 (99 ml) : MeOH (1 ml) (II)

CHCl3 (98,5 ml) : MeOH (1,5 ml) (III)
CHCl3 (98 ml) : MeOH (2,0 ml) (IV)
Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 2 ml. Kiểm tra dịch rửa
giải bằng TLC, thu được các phân đoạn tinh khiết chỉ cho 1 vết trên SKĐ, từ
ống 33 – 36 được xác định là Conessin, từ ống 85–98 được xác định là
Norconessin.
I.5.1.2 Nghiên cứu nước ngoài
Kumar N. [7] phân lập Conessin từ cắn alcaloid tồn phần ở trên bằng sắc kí
cột theo qui trình sau: 11,9 g cắn alcaloid được nạp vào cột, pha tĩnh là alumina,
pha động là benzen dầu hỏa (60-80 ◦C) : EtOAc với tỉ lệ EtOAc tăng dần. Kiểm
tra các phân đoạn bằng TLC. Phân đoạn từ ống 19–23, có tỉ lệ dung môi là
benzen dầu hỏa : EtOAc (95 : 5) cho 1 vết trên SKĐ, được xác định là
Conessin.
I.5.2 Các phương pháp phân lập conessine trong dược liệu
I.5.2.1 Nghiên cứu trong nước
Hoàng Thị Tuyết Nhung [2] phân lập conessine từ alcaloid toàn phần: 12,0 g
cắn alcaloid toàn phần được hòa tan trong 300 ml ether dầu hỏa, rửa giấy lọc và
tủa bằng 50 ml ether dầu hỏa. Lắc 3 lần dịch chiết ether dầu hỏa với dung dịch
HCl 10%, mỗi lần 150 ml. Gộp các dịch chiết nước acid và kiềm hóa dịch chiết
nước acid bằng Na2CO3 đến pH = 9 - 10 bằng cách cho từ từ Na 2CO3 vào dung
dịch, đồng thời khuấy đều đến khi dung dịch trong và khơng có bọt. Chiết bằng
17


ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 300 ml. Gộp các dịch chiết ether dầu hỏa và làm
khan dịch chiết bằng cách lọc dịch chiết ether dầu hỏa qua giấy lọc khô, cất thu
hồi ether dầu hỏa, cắn thu được hòa tan trong 50 ml dung dịch acid oxalic
17,5% trong ethanol. Để yên ở nhiệt độ phòng để thu được tinh thể Conessine
hydrooxalat, lọc lấy tinh thể. Hòa tan tinh thể thu được trong 300 ml nước.
Kiềm hóa dung dịch đến pH = 9 - 10 bằng cách cho từ từ Na2CO3 đến khi hết

bọt để tạo tủa Conessine base. Chiết Conessine base 4 lần bằng ether dầu hỏa,
mỗi lần 50 ml. Gộp các dịch chiết ether dầu hỏa và làm khan dịch chiết bằng
cách lọc dịch chiết ether dầu hỏa qua giấy lọc khô, cất thu hồi ether dầu hỏa, thu
được sản phẩm 1. Đem kết tinh sản phẩm 1 trong acetone, để yên ở nhiệt độ
phòng thu được Conessine tương đối tinh khiết. Lọc lấy tinh thể, sấy dưới áp
suất giảm ở 60◦C trong 4 giờ, sử dụng chất hút ẩm là phosphor pentoxyd (P 2O5)
thu được 2,55 g sản phẩm 2. Xác định hàm lượng Conessine phân lập được đạt
độ tinh khiết khoảng 82,50%.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1 Đối tượng nghiên cứu.
Nguyên liệu: Mẫu cao chiết Mức hoa trắng.
Thời gian nhận mẫu: tháng 8 năm 2020. Mẫu được giám định tên khoa học ở
khoa Tài nguyên, Viện Dược liệu.
II.2 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu.
- Hóa chất: Dung mơi dùng trong chiết xuất là dung mơi cơng nghiệp đã cất lại.
Các hóa chất, dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của
Trung Quốc.
- Các dụng cụ cần thiết trong q trình thực nghiệm như bình nón, cốc có mỏ,
ống nghiệm, pipet, phễu,...
- Thu hồi dung mơi bằng máy cất quay Rotavapor R-114 của hãng BUCHI – Viện
Dược liệu.
- Cân phân tích PRECISA 262SMA-FR – Viện Dược liệu.
18


II.3 Hóa chất, dung mơi

-

Dung

mơi:

methanol,

trimethylamine,

ethyl

acetate,

toluen,

dichloromethane… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích, dung mơi dùng
trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi dùng.
- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck).
- Silicagel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck).
- Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phương pháp
hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
II.5 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng
- Phân lập conessine từ cao chiết Mức hoa trắng.
III. Thực nghiệm
III.1 Phân lập conessine từ thân vỏ Mức hoa trắng
Từ cao chiết Mức hoa trắng, phân lập bằng sắc ký cột với:
+ Chất nhồi cột là Silicagel có cỡ hạt 40 - 63 µm (Merck).
+ Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước 2 cm x 50 cm. Lắp thẳng đứng
cột trên giá. Vặn chặt khố cột lại. Lót một lớp bơng mỏng ở đáy cột. Cho từ từ
sillicagel trong dichloromethane vào cột. Mở khố cho dung mơi chảy qua cột
nhiều lần. Để cột ổn định 12 giờ.
+ Tiến hành sắc ký cột:

Mở khố cho dung mơi chảy từ từ đến khi lớp dichloromethane trong cột vừa
đến bề mặt của bông. Vặn khoá cột lại. Nghiền 3g cao Mức hoa trắng với một
lượng tối thiểu sillicagel bằng cối rồi đổ vào cốc có mỏ. Đổ từ từ hỗn hợp vào
cột. Rửa giải conessine trong cột bằng dichloromethane, methanol, và
trimethylamine tăng dần độ phân cực. Xác định sơ bộ độ tinh khiết của chất
phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng TLC.

19


IV. Kết quả và bàn luận
IV.1 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH = 7/3

Hứng dịch rửa giải hệ (1) vào các bình nón, mỗi bình nón 100 ml.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng TLC, khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl
axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : 1 thu được kết quả như sau:
+ Từ bình nón 1 đến bình nón 10 có 1 vết khi phun thuốc thử Dragendorff.
Gộp bình nón 1 đến bình nón 10 đem đi cơ, thu được cắn (1).
Hịa tan cắn thu được bằng lượng tối thiểu Acetonitrile và tiếp tục kiểm tra
trên TLC khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine =
6,5 : 2,5 : 1 thu được kết quả như sau:
- Dung dịch cắn (1) xuất hiện 1 vết khi phun thuốc thử Dragendorff.
Nhận xét: 1 vết xuất hiện ở dung dịch cắn (1) khơng phải conessine vì R f
khác so với Rf của conessine trong mẫu chuẩn và cao chiết.
IV.2 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/1%

Thêm TMA để tăng dần độ phân cực của dung môi.
Hứng dịch rửa giải hệ (2) vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2 ml.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng TLC, khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl
axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : 1 thu được kết quả như sau:

+ Từ ống nghiệm 1 đến ống nghiệm 10 có 1 vết khi phun thuốc thử
Dragendorff.
Gộp ống nghiệm 1 đến ống nghiệm 10 đem đi cơ, thu được cắn (2).
Hịa tan cắn thu được bằng lượng tối thiểu Acetonitrile và tiếp tục kiểm tra
trên TLC khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine =
6,5 : 2,5 : 1 thu được kết quả như sau:
- Dung dịch cắn (2) xuất hiện 1 vết khi phun thuốc thử Dragendorff.
Nhận xét: 1 vết xuất hiện ở dung dịch cắn (2).
IV.3 Khai triển hệ dung mơi DCM/MeOH/TMA= 7/3/0,5%

Giảm thiểu lượng TMA vì TMA gây độc cấp tính và mãn tính đã được đề
xuất trong tài liệu y khoa thế kỷ 19. TMA có mùi khai (ở nồng độ cao), gây kích
ứng mắt và da.
20


Hứng dịch rửa giải hệ (3) vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2 ml.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng TLC, khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl
axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : 1 thu được kết quả như sau:
+ Từ ống nghiệm 1 đến ống nghiệm 8 không thấy xuất hiện vết khi phun
thuốc thử Dragendorff.
+ Từ ống nghiệm 9 đến ống nghiệm 23 thấy xuất hiện 1 vết khi phun thuốc
thử Dragendorff.
+ Từ ống nghiệm 24 đến ống nghiệm 40 thấy xuất hiện 1 vết khi phun thuốc
thử Dragendorff.
Gộp từ ống nghiệm 1 đến ống nghiệm 8, từ ống nghiệm 24 đến ống
nghiệm 40 đem đi cô, thu được cắn (3.1).
Gộp từ ống nghiệm 9 đến ống nghiệm 23, đem đi cơ, thu được cắn (3.2).
Hịa tan cắn thu được bằng lượng tối thiểu Acetonitrile và tiếp tục kiểm
tra trên TLC khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine

= 6,5 : 2,5 : 1 thu được kết quả như sau:
- Dung dịch cắn (3.1) không thấy xuất hiện vết khi phun thuốc thử
Dragendorff.
- Dung dịch cắn (3.2) thấy xuất hiện 1 vết khi phun thuốc thử
Dragendorff.

Hình IV.3 - SKĐ của hệ dung mơi (3)

Nhận xét: 1 vết xuất hiện ở dung dịch cắn (3.2) có R f trùng với Rf của
conessine trong mẫu chuẩn và conessine trong cao chiết.
21


IV.4 Khai triển hệ dung môi DCM/MeOH/TMA= 7/3/0,25%

Hứng dịch rửa giải hệ (4) vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2 ml.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng TLC, khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl
axetate : Trimethylamine = 6,5 : 2,5 : 1 thu được kết quả như sau:
+ Từ ống nghiệm 1 đến ống nghiệm 41 không thấy xuất hiện vết khi phun
thuốc thử Dragendorff.
+ Từ ống nghiệm 42 đến ống nghiệm 46 thấy xuất hiện 1 vết khi phun thuốc
thử Dragendorff.
+ Từ ống nghiệm 47 đến ống nghiệm 58 thấy xuất hiện 1 vết khi phun thuốc
thử Dragendorff.
Gộp từ ống nghiệm 1 đến ống nghiệm 41, từ ống nghiệm 47 đến ống
nghiệm 58 đem đi cô, thu được cắn (4.1).
Gộp từ ống nghiệm 42 đến ống nghiệm 46, đem đi cơ, thu được cắn (4.2).
Hịa tan cắn thu được bằng lượng tối thiểu Acetonitrile và tiếp tục kiểm
tra trên TLC khai triển hệ dung môi Toluen: Ethyl axetate : Trimethylamine
= 6,5 : 2,5 : 1 thu được kết quả như sau:

- Dung dịch cắn (4.1) không thấy xuất hiện vết khi phun thuốc thử
Dragendorff.
- Dung dịch cắn (4.2) thấy xuất hiện 1 vết khi phun thuốc thử

Hình IV.4 - SKĐ của hệ dung môi (4)

Dragendorff.

Nhận xét: 1 vết xuất hiện ở dung dịch cắn (4.2) có R f trùng với Rf của
conessine trong mẫu chuẩn và conessine trong cao chiết.
22


Kết luận: Q trình phân lập với hệ dung mơi tăng dần tính phân cực đã
phân lập được conessine nhưng do còn lẫn một số tạp chất nên conessine chưa
được kết tinh theo yêu cầu.

V. Tài liệu tham khảo
Tài liệu Tiếng Việt

23


1. Phạm Thanh Kỳ, Chu Đình Kính, Phí Tùng Lâm (2006), “Phân lập và
nhận dạng conessine và norconessine trong vỏ cây Mức hoa trắng thu hái
ở Hải Dương”, Tạp chí dược liệu, 11 (1), 6-8.
2. Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Viết Thân, Nguyễn Thị Thu Hương,
Hoàng Thị Tuyết Nhung (2010), “Nghiên cứu chiết xuất conessine từ mộc
hoa trắng dùng làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm”, Tạp chí Dược
học, 407, 32 - 35.

3. Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam, Nxb. Y học, Hà Nội.
4. Bộ Y tế, Dược liệu học, Tập II, Nxb. Y học, Hà Nội.
5. Võ Duy Lê Sơn (2012),” Nghiên cứu định tính, định lượng – chiết tách và
khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất alcaloid trong cây thuốc
thượng”, 3 – 14.
6. Bộ Y tế, Tra cứu dược liệu, Nxb Y học, Hà Nội
Tài liệu Tiếng Anh
7. Chakraborty A., Brantner A. H. (1999), “Antibacterial steroid alcaloids
from the stem bark of Holarrhena pubescens”, J. Ethnopharmacol., 68 (13), 339-344.
8. Houghton P. J., Dias Diogo M. L. (1996), “The conessine content of
Holarrhena pubescens from Malawi”, Pharmaceutical Biology, 4 (34),
305-307.
9. Kuma N., Singh B., Bhandari P., Gupta A. P., Kaul V. K. (2007),
“Steroidal Alcaloids from Holarrhena antidysenterica (L.), Wall”,
Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 55 (6), 912-914.

24