SẮC KÝ, PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ VÀ Ý NGHĨA CỦA CHÚNG TRONG QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH SẢN PHẨM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ
Học phần: Kỹ thuật thu hồi và hoàn thiện sản phẩm công nghệ
sinh học
Chuyên đề 5: SẮC KÝ, PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ
VÀ Ý NGHĨA CỦA CHÚNG TRONG QUÁ TRÌNH TÁCH
CHIẾT VÀ TINH SẠCH SẢN PHẨM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Lê Gia Hy
Sinh viên thực hiện : Vũ Thu Hằng
Lớp

: Cao học 2021-2023

Hà Nội – 2022
1
Vũ Thu Hằng


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU

3

NỘI DUNG

4

1. Lịch sử sắc ký

4

2. Sắc ký là gì?

4

3. Phân loại các kỹ thuật sắc ký

5

3.1. Theo bản chất vật lý các pha
3.2. Theo hiện tượng sắc ký
3.3. Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký
4. Các kỹ thuật sắc ký và ý nghĩa của chúng trong q trình tách chiết và tinh
sạch sản phẩm cơng nghệ sinh học

6

4.1. Sắc ký giấy
4.2. Sắc ký lớp mỏng
4.3. Sắc ký cột
4.4. Sắc ký trao đổi ion
4.5. Sắc ký gel
4.6. Sắc ký ái lực
4.7. Sắc ký tương tác kỵ nước
4.8. Sắc ký khí
5. Kết luận

15

TÀI LIỆU THAM KHẢO

16

2
Vũ Thu Hằng


MỞ ĐẦU
Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau. Các hợp chất này bao
gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng như các hợp chất có trọng lượng
phân tử nhỏ. Những hợp chất trên có thể hiện diện ở số lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay
ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo). Để phân tích các thành phần hóa học của tế bào, nhằm
hiểu rõ các quy trình biến đổi căn bản của nó, qua đó úng dụng và sử dụng các thành phần phù
hợp. Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học. Từ đó,
kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời với tên gọi sắc ký (chromatography). Kỹ thuật sắc ký đã
đem lại ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực, trong đó có thu hồi sản phẩm cơng nghệ sinh học,
từ đó, các sản phẩm dược phẩm sinh học có thể được sử dụng với độ tinh khiết cao, xác định
sớm, với hiệu quả đạt tiêu chuẩn sử dụng trên con người.
Ngày nay, sắc ký đã được sử dụng để tách tất cả các hợp chất có tính chất khác nhau về
mầu sắc, mùi vị, trọng lượng, điện tích, tính kỵ nước, ... Nhưng vì các phân tử sinh học rất thiên
hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay ít khác nhau
nên cần có đa dạng các phương pháp hay kỹ thuật sắc ký khác nhau phù hợp cho từng đặc tính
của chúng. Sau đây là nội dung về sắc ký, các kỹ thuật sắc ký và ý nghĩa của chúng trong tác
chiết và tinh sạch sản phẩm công nghệ sinh học.

3

Vũ Thu Hằng


NỘI DUNG
1. Lịch sử sắc ký
Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong
ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên đầu cột.
Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có
một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vịng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ
mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ơng đặt tên cho phương pháp tách này là sắc ký (Chromatography).
Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa là chất màu, graphein có nghĩa là viết. Tên gọi này ngày
nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất không màu.
Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật
khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực,..
Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điện tích theo
trọng lượng phân tử của chúng. Đến năm 1964, Moor gọi là “gel permeation chromatography”
hay gọi là sắc ký lọc gel.
Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát triển mạnh
mẽ, nhất là trong thập niên 1960.
Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp.
2. Sắc ký là gì?
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dừng để tách các thành phần của một hỗn
hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha
ln tiếp xúc và khơng hồ lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (Trong thí nghiệm của
Tvest: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động là ete dầu hoả). Pha tĩnh trì hỗn sự di chuyển của
các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ
khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống
trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được
chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố
khác nhau của các chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác

nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong
mơi trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua
như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate,...
Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học. Sắc ký là phương
pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương pháp được đề nghị trong
nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử.

4
Vũ Thu Hằng


3. Phân loại các kỹ thuật sắc ký
3.1. Theo bản chất vật lý các pha
Pha động có thể là một chất lỏng hay chất khí.
Pha tĩnh có thể là một chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay một chất lỏng (được giữ trên một
chất mang rắn).
Do đó, dựa vào bản chất các pha ta phân biệt các phương pháp (trong tên của phương
pháp, pha động được nêu trước pha tĩnh):
+ Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC)
+ Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC)
+ Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC)
+ Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC)
Hai phương pháp đầu gọi chung là sắc ký lỏng (LC).
Hai phương pháp đầu gọi chung là sắc ký khí (GC).
3.2. Theo hiện tượng sắc ký
+ Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh là một chất rắn có khả năng hấp
phụ, đó là các phương pháp sắc ký lỏng - rắn và khí - rắn.
+ Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng khơng hồ lẫn được
với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là giá hay chất
mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký

lỏng - lỏng và sắc ký khí - lỏng.
+ Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa trao đổi ion
chớp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với các ion cùng dấu của
dung dịch hỗn hợp sắc ký).
+ Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): còn gọi là sắc ký trên gel. Các
phân tử cỡ lớn sẽ được loạt các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kích thước do các
phân tử nhỏ di chuyển chậm hơn.
3.3. Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký
Theo phương pháp giữ pha tĩnh:
+ Sắc ký trên cột (column chromatography: CC) pha tĩnh được chứa trong một cột bằng
kim loại hay thuỷ tinh.
+ Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh được tráng đều và giữ trên
mặt phẳng của bản thuỷ tinh, nhựa hay nhôm. Lớp mỏng pha tĩnh thường là: silicagel,
nhôm oxit, xenlulozơ, chất nhựa trao đổi lớn và có chiều dày khoảng 0,25 - 0,5mm.
+ Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) được thấm trên một loại giấy
lọc đặc biệt gọi là giấy sắc ký.
Theo cách cho pha động chạy ta có:
5
Vũ Thu Hằng


+ Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép các chất chạy và
tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh).
+ Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy và kép các chất lần lượt ra
ngồi pha tính (ra khỏi cột, ra khỏi giấy).
4. Các kỹ thuật sắc ký và ý nghĩa của chúng trong q trình tách chiết và tinh sạch sản
phẩm cơng nghệ sinh học
4.1. Sắc ký giấy
Sắc ký giấy là một phương pháp phân tách dễ dàng các thành phần của một hỗn hợp (acid
amin). Trong sắc ký giấy, pha tĩnh là một tờ giấy bằng cellulose ( thí dụ như tờ giấy thấm, giấy

lọc trong phịng thí nghiệm). Các lọai giấy này có tính ái nước nên trên thực tế, pha tĩnh là một
lớp nước (H2O) thật mỏng đã được che phủ lên trên bề mặt của tờ giấy, chính vì thế sắc ký giấy
là lọai sắc ký phân chia. Pha động là chất lỏng( có thể là chất lỏng hay một hỗn hợp dung môi).
Phương pháp này thường được sử dụng để tách các chất ưa nước như amino acid, đường,..
Trong giấy, cellulose có dạng sợi, các sợi này khi nằm cạnh nhau sẽ tạo thành mạng lưới với
các lỗ rỗng to. Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi và các lỗ rỗng sẽ được phủ
đầy dung môi. Như thế, các chất tan bị phân tán nhiều trong lỗ rỗng khiến các vết sắc ký to hơn.
Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ lại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì
thế quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế phân chia.

Hình1. Sắc ký giấy, các chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với các điểm khác nhau.
(a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt ở một góc mảnh giấy lọc, một cạnh giấy
nằm trong dung môi.
(b) Dung môi di chuyển lên tấm giấy bằng lực hút mao mạch, các chất sẽ phân bố theo
các tỷ lệ khác nhau Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước của
6
Vũ Thu Hằng


phân tử của nó và hịa tan của nó trong dung môi.
(c) Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bảng , tạo thành
một sắc ký đồ.
Hiện nay, sắc ký giấy đang dần được thay thế bằng sắc ký lớp mỏng. Do phần lớn các
chất hữu cơ khơng có màu, nên sắc ký giấy sẽ khơng cho thấy được vị trí của mẫu chất
trong q trình dung mơi di chuyển đi lên giấy.
Nhược điểm sắc ký giấy: Trong giấy, cellulose ở dạng những sợi dài nằm song song kề
nhau một cách tự nhiên, và một hệ thống mạng như thế chắc chắn có các lỗ hỗng. Khi dung môi
giải ly di chuyển (mang theo các chất tan, solute) dọc theo bề mặt của sợi, các lỗ rỗng này sẽ
được dịp phủ đầy dung môi, và các chất tan có dịp khuếch tán vào các lỗ rỗng này, khiến các
chất tan càng lúc càng to dần so với vết chấm tạo mức xuất phát ban đầu. Còn nếu sợi cellulose

được nén chặt quá dòng chảy sẽ rất khó di chuyển.
4.2. Sắc ký lớp mỏng
4.2.1. Khái niệm và đặc điểm của sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào
hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung mơi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang
qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng
thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất
hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.

Hình 2. Bình sắc ký lớp mỏng
- Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.
- Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin,..)
được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu
trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một lọai polymer hữu cơ.
- Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng
khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một
7
Vũ Thu Hằng


điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn một chút so với mặ thoáng của chất lỏng
chứa trong bình.
- Pha động: dung mơi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng,
và lơi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung mơi di chuyển càng cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành
phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung mơi. Vận tốc di chuyển
này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha
tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
- Ưu điểm:
+ Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích
+ Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích.

+ Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng.
4.2.2. Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng
Khả năng phân tích của sắc ký lớp mỏng cũng rất đa dạng, từ những chất kém phân cực tới các
chất phân cực trung bình tới mạnh. Rất nhiều các nhóm hợp chất tự nhiên có giá trị trong trị liệu có thể
phân tích bằng sắc ký lớp mỏng. Tuy khả năng phân tách không cao và không nhạy bằng HPLC hay GC
nhưng sắc ký lớp mỏng hiện vẫn là phương pháp rất phổ biến và hữu ích trong phân tích dược liệu, trong
cơng nghệ sinh học, trong phân tách hóa học.
Trong nghiên cứu và sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học thường người ta vẫn sử sắc ký lớp
mỏng để định tính và định lượng các sản phẩm mong muốn, sơ bộ đánh giá độ tinh sạch và tinh sạch
các sản phẩm như phương pháp sắc ký giấy.

4.3. Sắc ký cột
4.3.1. Khái niệm và đặc điểm của sắc ký lớp mỏng
Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạt có kích thước
tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt trên
đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình
chứa dung mơi giải ly được đặt phái trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột
được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Phương pháp này thường làm cho
quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột
cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng
mẫu tương đối lớn.
4.3.2. Ứng dụng của sắc ký cột
Sắc ký cột được ứng dụng trong lĩnh vực hóa học để tách chiết một chất nào đó từ hỗn hợp.
Sắc ký cột thường được sử dụng trong các nhà máy dược để chiết xuất một lượng lớn các chất
dược liệu.

8
Vũ Thu Hằng

Hình 3. Sắc ký cột.
4.4. Sắc ký trao đổi ion
4.4.1. Khái niệm và đặc điểm của sắc ký trao đổi ion
Sự trao đổi ion là sự gắn kết có tính chất thuận nghịch giữa các phân tử có mang điện tích.
Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang điện tích. Giả sử cho đi
ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau,
chất tan nào có mang điện tích ngược dấu với điện tích của nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất
tan dẽ đuổi đối ion C ra thế chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong
cột, trong khi đó những chất khác của hỗn hợp mẫu chất ban đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra
khỏi cột. kỹ thuật này tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu.
RG- + S+ -----Hoặc RG+ +S- ---

RG-S+ +C+
RG+S- +C-

Trong đó: R là pha tĩnh hay gọi là nhựa (resin), G là nhóm chức mang điện tích được cố
định trên pha tĩnh hay cịn gọi là nhóm chức họat động của nhựa. C là đối ion của G. S là chất
hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G.
Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate.

9
Vũ Thu Hằng


Hình 4. Sắc ký trao đổi ion.
Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất
định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng.
Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình
được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương.
Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAEcellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế,

những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại
cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế
phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta
thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám
vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được
phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.
4.4.2. Ứng dụng của sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion là một công cụ mạnh mẽ và quan trọng đối với các nhà hóa học phân
tích dược phẩm. Sắc ký trao đổi ion được sử dụng để ước tính và phân tách các phân tử có
điện tích hoặc ion khác nhau bao gồm protein, peptit, axit amin, vitamin, cacbohydrat, enzim,
v.v ... riêng của nó hoặc cùng với các kỹ thuật sắc ký khác.
Điều này cũng có thể áp dụng để tách biệt và làm sạch các phân tử hữu cơ từ các nguồn
tự nhiên. Các phân tử khác nhau với cơng suất lớn cũng được phân tích. Các phân tử mong
muốn được tinh chế ở mức cao. Với chi phí thấp, kỹ thuật sắc ký trao đổi ion được áp dụng để
chuyển giao cho các quy mô sản xuất. Các sản phẩm tự nhiên có thể chiết xuất khơng dung
mơi có thể được theo dõi. Nó đóng một vai trò quan trọng trong việc khám phá thuốc hiện đại
để phân lập các sản phẩm tự nhiên.

10
Vũ Thu Hằng


4.5. Sắc ký gel
4.5.1. Khái niệm và đặc điểm của sắc ký gel
Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ đầy
dung môi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác
nhau cị thể tách riêng được hay khơng là tuỳ vào kích thước lỗ rỗng. Các phân tử có kích thước
lớn hơn lỗ rỗng, không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dịng chảy của pha
động đi ra khỏi cột. các phân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ
tồn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi cũng theo dòng chảy đi ra khỏi

cột nhưng sẽ chậm trễ hơn.
Dòng chảy pha động khiến các phân tử lớn không thể chui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh
chóng đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khi phân tử nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì còn chui vào
và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel. Như vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang
qua cột sắc ký gel, sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử
nhỏ đi ra khỏi cột sau.

Hình 5. Sắc ký gel.
4.5.2. Ứng dụng của sắc ký gel
Ứng dụng khử muối: polyme (chẳng hạn như protein, axit nucleic, polysaccharides, vv) giải pháp
của các tạp chất phân tử lượng thấp có thể được loại bỏ bằng phương pháp sắc ký gel, các hoạt động
được gọi là khử muối. Khử muối pháp luật là đơn giản, nhanh chóng, và các enzyme và các protein khác
trong quá trình khử muối khơng phải là dễ dàng thối hóa. Gel được áp dụng SephadexG-10, 15,25,
hoặc Bio-Gel-p-2, 4,6. Chiều dài Cột tỷ lệ đường kính 5-15, khối lượng riêng của khối lượng mẫu lên
đến 25% -30% để ngăn chặn sự giảm khả năng hòa tan khử muối kết tủa protein sẽ mẫu hấp phụ trên
cột, muối thường dễ bay hơi như amoni axetat đệm để cân bằng cột và sau đó thêm vào mẫu, bằng cách
sử dụng bộ đệm rửa giải đó, rửa giải được thu thập muối biến động loại bỏ bằng cách lyophilization.
Xác định trọng lượng phân tử của vật liệu polyme: một loạt các tiêu chuẩn về trọng lượng phân tử
được biết đến vào cột gel cùng và sắc ký trong cùng điều kiện, ghi thành phần tích rửa giải trong một
11
Vũ Thu Hằng


phút, và rửa giải khối lượng so với trọng lượng phân tử âm mưu logarit, trong một phạm vi trọng lượng
phân tử là một đường thẳng, đó là đường cong chuẩn trọng lượng phân tử. Xác định trọng lượng phân
tử của chất chưa biết, mẫu này có thể được thêm vào đường cong tiêu chuẩn xác định rửa cột gel sưng
lên, theo khối lượng của chất rửa giải trong các đường cong tiêu chuẩn của trọng lượng phân tử của nó.

4.6. Sắc ký ái lực
4.6.1. Khái niệm và đặc điểm của sắc ký ái lực

Sắc ký ái lực hấp thụ phát hiện các ái lực sinh học mà một phân tử sinh học có với một phân
tử khác được cố định trên một pha ổn định. Có nhiều phương pháp để rửa giải các phân tử ái
lực vì có nhiều loại sắc ký ái lực khác nhau, các bước theo gradient vẫn thường được sử dụng.
Thường sử dụng trên các hệ thống có áp suất thấp. Các giá thể (thường là agarose) thường chịu
được áp suất dưới 50psi.

Hình 6. Sắc ký ái lực.
- Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligand lên giá thể hoạt
hóa thường gặp nhiều khó khăn.
- Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh sạch trên protein A (protein A là antigen cho IgG), bước
bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng ngun thủy cịn họat tính với dạng biến tính.
- Sử dụng sắc ký ái lực cho tương tác giữa kháng nguyên kháng thể: ta có thể tinh sạch một
kháng nguyên bằng cách cho mẫu đi qua cột có chứa giá thể liên kết với kháng thể để thu nhận
protein. Ngược lại, một giá thể có liên kết với một kháng nguyên chuyên biệt sẽ bắt giữ kháng
thể chuyên biệt cho kháng nguyên đó. Ứng dụng nhiều nhất là gắn kết protein A vào gel để gắn
kết với các globulin miễn dịch.
4.6.2. Ứng dụng của sắc ký ái lực
Sắc ký ái lực có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng, bao gồm tinh sạch axit nucleic,
làm sạch protein từ dịch chiết loại bỏ tế bào và tinh chế protein từ máu. Sử dụng tính đặc hiệu
của kỹ thuật này được ứng dụng trong:
- Ái lực miễn dịch: làm sạch các kháng thể bằng sắc ký ái lực từ huyết thanh máu, nếu
12
Vũ Thu Hằng


huyết thanh được biết có chứa kháng thể chống lại kháng nguyên đặc hiệu (ví dụ, nếu huyết
thanh đến từ một sinh vật đã được miễn dịch chống lại kháng nguyên có liên quan), sau đó nó
có thể được sử dụng để tinh sạch ái lực của kháng nguyên đó. Điều này cũng được biết đến như
sắc ký ái lực miễn dịch vận chuyển. Ví dụ: Các peptid cùngchứa cystein cũng được cố định lên
nhựa agarose thông qua gốc cystein và sau đó được sử dụng để làm sạch các kháng thể. Hầu

hết các kháng thể đơn dòng được tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực dựa trên Protein A hoặc Protein
G đặc hiệu-immunoglobulin, được tìm thấy từ vi khuẩn.
- Sắc ký ái lực được cố định ion kim loại (IMAC) được dựa trên cơ sở liên kết đồng hóa trị
đặc hiệu của axit amin, đặc biệt là histidin, với kim loại. Kỹ thuật cho phép các protein có ái
lực với các ion kim loại được giữ lại trong một cột có chứa ion kim loại cố định, ví dụ như
coban, niken, đồng để tinh sạch protein hay peptid có chứa histidin; sắt, kẽm hoặc gali để tinh
sạch protein hay peptid phosphoryl hóa.
- Protein tái tổ hợp có thể sử dụng phổ biến nhất của sắc ký ái lực là để tinh sạch protein
tái tổ hợp. Protein có ái lực đã biết là protein đã được găn đầu để trợ giúp mức độ tinh sạch của
chúng. Protein có thể được biến đổi gen cho phép lựa chọn được liên kết ái lực, nó được hiểu
là protein dung hợp.
- Sắc ký ái lực lectin là một dạng của sắc ký ái lực mà ở đó lectin được sử dụng để tách các
thành phần trong mẫu. Lectin, như Concanavalin A, là các protein mà có thể liên kết các phân
tử hydratcarrbon (đường) đặc hiệu. Ứng dụng phổ biến nhất của sắc ký ái lực lectin là để phân
tách glycoprotein từ các protein khơng glycosyl hóa hoặc một dạng glycoprotein khỏi dạng
glycoprotein khác.
4.7. Sắc ký tương tác kỵ nước
Sắc ký tương tác kỵ nước là phuơng pháp bổ sung khá tốt cho các kỹ thuật phân tách khác.
Trong những năm gần đây, phương pháp này trở nên thông dụng như là bước đầu tiên trong
quá trình sắc ký.

Hình 7. Sắc ký tương tác kỵ nước.
13
Vũ Thu Hằng


Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất là nhóm kỵ nước, có thể là gốc methyl hay t-butyl. Các
gốc này hấp dẫn các gốc kỵ nước khác có trên bề mặt protein. Khi cho mẫu protein vào trong
điều kiện nồng độ muối cao ép các phần kỵ nước lại gần nhau và đính với nhau. Q trình rửa
giải được thực hiện bằng cách giảm dần nồng độ muối cho đến khi các phần kỵ nước đi lại vào

trong dung dịch.
Đặc điểm: + Phân tách các phân tử theo tính kỵ nước của phân tử
+ Các nhóm kỵ nước khác nhau đựợc cố đinh trên bề mặt giá thể.
+ Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ nước trên phân tử tương tác
các nhóm cố định.
+ Các phân tử gắn kết được rứa giải bằng cách giảm áp lực ion và vì vậy hịa tan các
phân tử ra khỏi giá thể.
Ưu điểm: Là bước cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu được thu nhận trong nồng
độ muối thấp.
Nhược điểm: một số protein có thể bị tủa ở nồng độ muối cao, khó nâng cấp quy mơ lớn.
4.8. Sắc ký khí
4.8.1. Khái niệm và đặc điểm của sắc ký khí
Sắc ký khí là phương pháp được dùng để tách các chất ở thể khí bay hơi, với pha động là
chất khí, gọi là khí mang (carrier gas). Sắc ký khí cịn áp dụng cho các chất khí, lỏng, rắn dễ
bay hơi và bền nhiệt độ cao, có TLPT M<500. Sắc ký khí rắn (GSC - gas solid chromatography):
pha tĩnh rắn là một chất hấp phụ, đây là sắc ký khí hấp phụ và sắc ký khí lỏng (GLC - gas liquid
chromatography): pha tĩnh lỏng được bao hay gắn trên một chất mang rắn (solid support) đây
là sắc ký khí phân bố.
Sử dụng phương pháp sắc ký khí có khả năng tách được hoàn toàn những chất hữu cơ tương
tự, ví dụ như o-; m-; p-xilen khơng thể tách được bằng phương pháp chưng cất phân đoạn nhưng
tách được khá đơn giản bằng sắc ký khí, cũng như sử dụng đề tách những hỗn hợp rất phức tạp
như khí thải ô tô chứa trên 300 hợp chất. Với việc ra đời của nhiều loại detector nhiều phương
pháp mới xuất hiện như: sắc ký khí - khối phổ (GS - MS), sắc ký khí - hồng ngoại (GC - IR)...
đã làm tăng khả năng phân tích của sắc ký khí.

14
Vũ Thu Hằng


Hình 8. Sắc ký khí.

4.6.1. Ứng dụng của sắc ký khí
Ứng dụng chủ yếu của sắc ký khí bao gồm kiểm tra độ tinh sạch của một chất cụ thể, hay
tách các chất khác nhau ra khỏi một hỗn hợp (khối lượng của các chất này cũng có thể được
xác đinh một cách tương đối). Trong một số trường hợp, kỹ thuật sắc ký khí có thể dùng để xác
định một hợp chất nào đó. Trong sắc ký điều chế, phương pháp ký khí được sử dụng để tinh
chế các hợp chất từ một hỗn hợp.
5. Kết luận
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế giới. Việt Nam
tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện cuộc sống ngày càng cao,
nên địi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để đáp ứng nhu cầu.
Trong công nghệ thu hồi sản phẩm các quá trình cơng nghệ sinh học, các kỹ thuật sắc ký
kết hợp cùng các phương pháp kết tủa, lọc đã đóng vai trị quan trọng trong các cơng đoạn tinh
sạch, định tính, định lượng các sản phẩm dược sinh học, protein tái tổ hợp,… Ví dụ như: kiểm
tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon
(clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu
đã bị cấm có trong thực phẩm và mỹ phẩm như: Sudan có trong trứng gia cầm và trong son
mơi, 3 MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có trong nước tương, formone có trong bánh phở,
xác định một số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sự phát triển của các nấm mốc
gây độc (có độc tố Aflatoxin) trong các lô hàng nông sản dự trữ và xuất khẩu đặc biệt đậu tương
và lạc …Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong dược
phẩm, dư luợng chất có thể gây độc hại… Ngồi ra cịn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
như quan trắc, mơi trường… Từ đó, với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương
pháp sắc ký phù hợp để phân tích mẫu tương ứng.

15
Vũ Thu Hằng


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1) Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM, 2007, Trang

151-451.
2) Trần Nhật Phương, Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học- Proteomic/Sắc ký, 2008,
12trang.
3) Nguyễn Tuấn Anh, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thế Hùng, Giáo trình phân tích mơi trường, ĐH
Nơng Lâm Thái Nguyên, trang 49-59.
4) Sắc ký giấy:
/> /> /> 20Chromatography.ppt
5) Sắc ký lớp mỏng:
Piia Salo, Thin-Layer Chromatography with Ultravioletand Mass Spectrometric Detection:
From Preparative-Layer to Miniaturized Ultra-Thin-Layer Technique, Division of
Pharmaceutical Chemistry Faculty of Pharmacy University of Helsinki, Finland.
/> />6) Sắc ký cột:
/>7) Sắc ký trao đổi ion:
/>/Pr inciplesofChromatography/IonExchange/
8) Sắc ký gel:
/>/Pr inciplesofChromatography/SizeExclusion/
9) Sắc ký tương tác kỵ nước:
/>/Pr inciplesofChromatography/HydrophobicInteraction/
10) Sắc ký ái lực: /> />/Pr inciplesofChromatography/Affinity/
11) Sắc ký khí: /> /> />
16
Vũ Thu Hằng