đề tài phương pháp pcr

1
Đề tài:
PHƯƠNG PHÁP PCR
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA THỦY SẢN
GVHD : LÊ THỊ PHƯƠNG HỒNG
1
2
Thành viên nhóm

Nguyễn Thị Huỳnh Nga 08141029

Phan Thị Bích Tuyền 08141063

Nguyễn Minh Quân 08141123

Mai Thị Nga 08141105
3
Mục lục
I. Giới thiệu
II. Nguyên tắc PCR
III. Điều kiện phản ứng PCR
IV. Quy trình phản ứng PCR
1.Giai đoạn biến tính
2.Giai đoạn bắt mồi
3.Giai đoạn kéo dài
V. Ý nghĩa và các ứng dụng PCR
VII. Các hạn chế
Tài liệu tham khảo
4

I. GIỚI THIỆU




PCR ( Polymerase Chain Reaction ) là phản ứng chuỗi
trùng hợp hay còn gọi là "phản ứng khuếch đại gen“.
Trong ngành thủy sản việc áp dụng kỹ thuật PCR để phát
hiện ra các mầm bệnh do virus gây ra như bệnh đốm trắng,bệnh
đầu vàng, hội chứng Taura… trên tôm.
5
II. Nguyên tắc PCR

PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA
đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạn
DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.

Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của
DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.
6
II. Nguyên tắc PCR

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp
nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
1 chu kỳ
GĐ
Biến tính
GĐ
Bắt mồi
GĐ

Kéo dài
7
III. Điều kiện phản ứng
PCR
Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ
các thành phần sau :
Hình : Thực nghiệm PCR
8
1. Nước
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh
khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase,
enzyme cắt giới hạn ….
9
2. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR:

Thành phần dung dịch đệm thường phụ thuộc vào loại
enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR, dung dịch
đệm thường chứa muối đệm Tris HCl 10 mM, KCl 50 mM và
MgCl
2
1.5 mM
Nồng độ MgCl
2
có thể dao động từ 0.5-5 mM. Chính ion
Mg
2+
gắn kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám
nối của mồi.
10
3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

Deoxyadenosine 5’ triphosphate
11
3. Deoxynucleotide triphosphat
(dNTPs):
Nồng độ khoảng chừng 100 mM cho mỗi nucleotide:
dATP, dCTP, dGTP, dTTP .
Nồng độ thấp khoảng 10 – 100 mM thì Taq polymerase có
độ chính xác cao hơn.
12
4. Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc
xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA.
Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm:
o
Mồi xuôi (forward primer)
o
Mồi ngược (reverse primer).
13
5.Enzyme DNA polymerase (Taq)
Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A,
T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp .
Enzyme sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA
polymerase I về sau sử dụng Taq polymerase vì nó không bị phá
hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá
trình phản ứng,có thể chịu nhiệt độ 90
o
C lặp lại nhiều lần mà
không mất khả năng tổng hợp DNA
14
6. DNA mẫu (DNA template)

Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các
đối tượng nghiên cứu. DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh
lẫn tạp chất.
Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm
(từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase
cho hiệu quả cao .
15
III. Quy trình phản ứng
PCR.

Trong phản ứng PCR nhiệt độ là vô cùng quan trọng
và kèm theo là yếu tố thời gian.

Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong
một chu kỳ:
16
1. Giai đoạn biến tính:

Sợi DNA mạch khuôn bị biến tính tách thành 2 sợi
đơn ở nhiệt độ 94
0
C trong vòng 30 giây đến 1 phút .

Sự biến tính DNA diễn ra với sự có mặt của hai đoạn
mồi và các dNTP.
17
2.Giai đoạn bắt cặp:

Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 50 – 65
0

C tốt nhất là
55
o
C trong khoảng thời gian 1 – 2 phút .

Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA
polymerase và chiều dài sản phẩm.
18
3. Giai đoạn kéo dài:

Nhiệt độ lúc này được nâng lên 72
0
C trong vòng 30 giây
đến 1 phút .

Nhờ tác dụng của men Taq polymerase các Nu có sẵn
trong ống nghiệm gắn vào các mồi theo nguyên tắc bổ
sung
=> Một bản sao DNA mới đã được hình thành .
19
3. Giai đoạn kéo dài:
20
Sơ đồ phản ứng PCR qua nhiều chu kỳ
21
Hình: Nhiệt độ của các chu kỳ phản ứng PCR
22
V. Ý nghĩa và các ứng dụng
23
a. Phương pháp này có ý nghĩa lớn vì nhiều lý do:


Độ tinh sach của mẫu không cần cao

Dễ thực hiện

Rẽ tiền và thời gian thực hiện ngắn

Độ chính xác cao đáng tin cậy
24
b. Các ứng dụng chủ yếu của PCR gồm:

Phát hiện đột biến

Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm

Chọn giống vật nuôi, cây trồng

Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm

Xác định mầm bệnh từ động vật thủy sản như bệnh tôm:
MBV, WSSV, YHV, TSV…và bệnh trên cá: VNN…
25