Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân và rễ loài lan hoàng thảo vôi trắng (dendrobiumcretaceum var alba )” giai đoạn in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT
ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ
PHÁT SINH THÂN VÀ RỄ LOÀI LAN HỒNG
THẢO VƠI TRẮNG (Dendrobium cretaceum var alba )
GIAI ĐOẠN IN VITRO’’.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành sư phạm Sinh học

Phú Thọ, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ
PHÁT SINH THÂN VÀ RỄ LOÀI LAN HỒNG
THẢO VƠI TRẮNG (Dendrobium cretaceum var alba )
GIAI ĐOẠN IN VITRO’’.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành sư phạm Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. TRẦN TRUNG KIÊN

Phú Thọ, 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời
cảm ơn chân thành nhất tới giảng viên hƣớng dẫn thầy giáo TS. Trần Trung Kiên
đã quan tâm hƣớng dẫn tận tình và động viên em hồn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầ c gi o trong rung
tâm nghiên cứu C ng nghệ inh h c – trƣờng

ih c

ng ƣơng c ng tồn

thể các thầy cơ giáo trong Khoa Khoa h c Tự Nhiên- rƣờng

i h c Hùng

ƣơng đã t o điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hồn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, b n bè, những ngƣời
đã lu n bên c nh động viên, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện và
hồn thành khóa luận này.
Rất mong nhận đƣợc sự chỉ bảo, góp ý từ phía q Thầ (C ) để khóa
luận của em đƣợc hoàn thiện đầ đủ hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

ii

LỜI CAM ĐOAN
i xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
của riêng tơi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung
thực. M i sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận nà đã đƣợc cảm ơn và c c
thơng tin trích dẫn trong khóa luận đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc và đƣợc phép
công bố.
Phú Thọ, ngày … tháng 5 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Hồng Hạnh


iii

MỤC LỤC
Trang
MỞ ẦU
1. ính cấp thiết của đề tài

01

2. Mục tiêu đề tài

02

3. Ý nghĩa khoa h c và thực tiễn

02

3.1. Ý nghĩ khoa h c

02

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

02

C ƢƠNG 1: ỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số nét giới thiệu về chi Dendrobium và lồi lan Hồng thảo

03

vơi trắng(Dendrobium creataceum var alba)
1.1. Một số nét giới thiệu về chi Dendrobium và lồi lan Hồng thảo

03

vơi trắng(Dendrobium creataceum var alba)
1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium

03

1.1.2. Giới thiệu về loài lan Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium

04

creataceum var alba)

1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô- tế bào thực vật

05

1.2.1. Khái niệm

05

1.2.2. Lịch sử ph t triển của kỹ thuật nhân giống bằng nu i cấ m -

05

tế bào thực vật
1.2.3. Cơ sở khoa h c của nu i cấ m - tế bào thực vật

07

1.2.4. C c giai đo n trong kỹ thuật nhân giống in vitro

08

1.2.5. C c điều kiện nu i cấ in vitro

09

1.2.6. M i trƣờng nuôi cấy in vitro

11

1.2.7. Tầm quan tr ng của phƣơng ph p nu i cấy mô - tế bào thực vật

15

1.3. Tình hình nghiên cứu

15

1.3.1.Vai trị của các chất điều hịa sinh trƣởng trong nhân giống in vitro.

15

1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo

17

C ƢƠNG 2: ỐI ƢỢNG, NỘI DUNG À P ƢƠNG P ÁP NG IÊN CỨU


iv

2.1. ối tƣợng và ph m vi nghiên cứu

20

2.2. Nội dung nghiên cứu

20

2.3. Phƣơng ph p nghiên cứu

20

C ƢƠNG 3: KẾ QUẢ NG IÊN CỨU À

ẢO LUẬN

3.1. Ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến sự sinh trƣởng chồi Lan

24

hoàng thảo v i trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp của C tokinin/Auxin
đến sự ph t triển của thân, l

câ

lan

26

oàng thảo v i trắng

(Dendrobium cretaceum var alba)
3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến sự ph t triển của thân, l

26

câ lan oàng thảo v i trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá

28

cây lan Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
3.2.3. Ảnh hƣởng của sự phối hợp giữa BAP và NAA đến sự phát triển

29

của thân, lá cây lan Hoàng thảo vôi trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
3.2.4.Ảnh hƣởng của sự phối hợp Kinetin và NAA đến sự phát triển

31

của thân, lá cây lan Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ Auxin đến khả năng ra rễ cây lan

33

Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan

33

Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ cây lan

35

Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
3.3.3. Ảnh hƣởng của sự phối trộn NAA và IAA đến khả năng ra rễ

37

cây lan Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
KẾ LUẬN À KIÊN NG Ị

39

1. Kết luận

39

2.Kiến nghị

39

ÀI LIỆU

AM K ẢO


v

DANH MỤC VIẾT TẮT

BAP
C

: Benzylamino purine
:

ối chứng

IAA

: Indole acetic acid

KC

: Knudson C

MS

: Murashige & Skoog

NAA

: Naphthaleneacetic acid

TDZ

: Thidiazuzon


vi

DANH MỤC BẢNG
Tên bảng
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến sự sinh trƣởng chồi
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến sự phát triển của thân,
lá

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của

Trang
24

26

28

thân, lá
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa BAP và NAA đến sự

30

phát triển của thân, lá
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA

32

Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

33

Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ

35

Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa NAA và IAA đến khả

37

năng ra rễ


vii

DANH MỤC HÌNH
Tên hình

Trang

ình 3.1.1. Ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến sự sinh trƣởng chồi

24

ình 3.1.2.

25

ồ thị về ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến sự sinh

trƣởng chồi
ình 3.1.3. Ảnh hƣởng của m i trƣờng nền đến tỉ lệ ra chồi

25

ình 3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến sự phát triển thân và lá

27

ình 3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến sự phát triển thân và lá

27

ình 3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá.

29

ình 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá

29

ình 3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá

31

ình 3.4.2 Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự phát triển của thân, lá

31

ình 3.5.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA

32

ình 3.5.2. Ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA

32

Hình 3.6.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

34

Hình 3.6.2. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

34

Hình 3.6.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

35

Hình 3.7.1. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến chiều dài của rễ

36

Hình 3.7.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ

36

Hình 3.7.3. Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ

36

Hình 3.8.1. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa NAA và IAA đến

37

chiều dài rễ
Hình 3.8.2. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa NAA và IAA đến

38

khả năng ra rễ
Hình 3.8.3. Ảnh hƣởng của sự phối trộn giữa NAA và IAA đến
chiều dài rễ

38


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Phong lan được biết đến là một loài hoa đẹp mang nhiều ý nghĩa được
mọi người ưa chuộng. Phong lan thường được dùng làm cảnh và trang trí, và
một số lồi có tác dụng chữa bệnh. Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium
cretaceum var alba) thuộc chi Hồng thảo (Dendrobium) có mùi thơm nhẹ
nhàng mùi hoa nhài dễ chịu, rất đẹp nên được nhiều người yêu thích và lựa chọn.
Tuy nhiên, hiện nay số lượng lồi này trong tự nhiên cịn rất hiếm và khó nhân
giống bằng phương pháp thông thường [4].
Để hạn chế việc khai thác q mức lan Hồng thảo vơi trắng ngồi tự
nhiên cũng như để bảo tồn loài lan quý, hiếm này thì ngày nay cùng với sự phát
triển của cơng nghệ sinh học, vi nhân giống (in vitro) là công cụ đắc lực trong
việc bảo tồn và phát triển các lồi lan q hiếm. Hơn nữa cịn rất hiếm các cơng
trình nghiên cứu trên thế giới về lồi lan này và đặc biệt ở Việt Nam hiện chúng
tơi chưa tìm thấy cơng trình nào nghiên cứu về lồi lan Hồng thảo vôi đột biến trắng.
Nhân giống in vitro là một phương pháp nhân giống mang lại nhiều ưu
điểm như: hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng đều về mặt di truyền, sạch
bệnh, đồng thời có tiềm năng sinh học cao mà lại khơng tốn diện tích nhân giống.
Trong nhân giống in vitro, ngồi mơi trường ni cấy cơ bản, người ta
thường bổ sung thêm vào môi trường ni cấy các vitamin, các chất điều hịa

sinh trưởng, đường, than hoạt tính, nước ép các loại hoa quả như: chuối, nước
dừa, khoai tây…Trong đó, các chất điều hịa sinh trưởng có ảnh hưởng rất lớn
đến sự phát sinh chiều cao cây, lá cây và chất lượng của cây, cũng như có ảnh
hưởng lớn tới khả năng ra rễ của cây.
Chính vì vậy chúng tơi lựa chọn thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng
của một số chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát sinh thân và rễ loài lan
Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba )” giai đoạn in vitro.


2

Đề tài này được thực hiện sẽ góp phần hồn thiện quy trình nhân giống
in vitro cho lồi lan q này.
2. Mục tiêu của đề tài
Đánh giá được ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng của
chồi cây in vitro lan Hồng thảo vơi trắng.
Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều
hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân, lá của cây in vitro lan Hồng thảo vơi trắng.
Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều
hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Hồng thảo vơi trắng.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả đề tài nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về ảnh hưởng
của các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển
thân và rễ cây in vitro lồi lan Hồng thảo vơi trắng.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài được thực hiện sẽ là cơ sở cho việc hồn thiện quy trình nhân
giống in vitro cho lồi lan đẹp này. Kết quả đề tài góp phần nâng cao năng
suất, chất lượng cũng như hiệu quả kinh tế trong sản xuất giống lan Hồng
thảo vơi trắng trên địa bàn tỉnh Phú Thọ.

3

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium và lồi lan Hồng thảo vơi trắng
(Dendrobium cretaceum var alba)
1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium
1.1.1.1. Về phân loại
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan. Hiện nay,
chi này bao gồm hơn 1200 loài được chia thành 40 nhóm thuộc dịng
Dendrobinae. Chi Dendrobium được phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Nam Á,
Đông Á và Đông Nam Á cho đến Philippines, Borneo, Australia,
NewZealand, riêng ở Việt Nam có trên 110 lồi [4, 8].
Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ. Có người gọi là Hồng lan,
có người gọi là Đăng lan. Dendrobium chia thành 2 dạng chính:
 Dạng đứng (D. phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu
ẩm và ra nhiều hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hồng,
Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên…
 Dạng thịng (D. nobile) chịu khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc
vĩ, Long tu, Phi điệp vàng…
1.1.1.2. Về đặc điểm hình thái
Rễ chi Dendrobium thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được
bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng
và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần
rễ có các sắc lạp khơng bị ngăn bởi mơ xốp nên có thể giúp cây quang hợp.
Rễ của lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài,
rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết [3].
Thân thuộc loại giả hành có đặc điểm là những đoạn phình to, bên

trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất
dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khơ hạn khi cây sống bám trên cao.
Ngồi ra giả hành cịn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được. Hình dạng


4

và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thn dài hay hình trụ xếp
chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [6].
Lá có hình kim, trụ hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nước,
dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến
lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo
gân giữa như hình chữ V [3]. Các lồi thuộc giống Dendrobium đơi khi trút lá vào
mùa khơ hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [1].
Dendrobium có cụm hoa mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có
những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống.
Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành bởi 3
lá đài, 3 cánh hoa và một trụ hoa) [1].
Quả họ Orchidaceae có quả thuộc quả nang. Khi hạt chín, các nang
bung ra chỉ cịn dính lại với nhau ở đỉnh gốc. Ở một số lồi khi chín quả
khơng nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi bị mục nát. Quả chứa 10.000 –
100.000 hạt, đơi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phơi hạt cha
phân hóa. Sau 3- 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [2].
1.1.2. Giới thiệu về lồi lan Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba)
Lan Hồng thảo vơi trắng có tên khoa học là D.cretaceum var alba
thuộc: chi Dendrobium, họ Lan: Orchidacea, bộ Lan: Orchidales, lớp Một lá
mầm: Monocotyledone, ngành Ngọc Lan: Mangoliophyta [4, 18].
Lan Hồng thảo vơi trắng (Dendrobium cretaceum var alba) có thân
to dài 20- 40cm. Lá hình giáo, thn ở gốc, nhọn ở đỉnh, dài 7- 8cm, rộng
khoảng 1- 2cm, các đốt ngắn, thân phủ nhiều lớp vỏ phấn thường hay bị bong

tróc lớp vỏ này, có lẽ vì thế nên gọi là Hồng thảo vơi, tạo cho thân 1 lớp
mốc. Hoa nhiều lông ở cánh và lưỡi, thơm mùi hoa nhài có màu trắng, trên
lưỡi hoa có các tia đỏ chạy ra từ họng. Lan Hồng thảo vơi trắng ưa nắng
thường được trồng vào cuối đông khi cây đang nghỉ, các mắt đang ngậm nụ.
Phơi nắng trực tiếp từ khi bắt đầu ghép sẽ cho lứa cây con khỏe mạnh.Cây
cần rất nhiều nước trong thời gian phát triển, mùa thu bớt tưới cho đến khi
cây rụng hết lá thì dừng tưới. Nhiệt độ sống thích hợp từ 18 đến 250C, độ ẩm


5

từ 70 đến 90% là tốt nhất. Nhiệt độ để lan Hồng thảo vơi trắng ra hoa phải từ
13- 150C và kéo dài liên tục từ 4- 6 tuần lễ.
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.2.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là
thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn,
mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp
như muối khống, vitamin, đường và các chất điều hịa sinh trưởng thực vật
trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật cho phép tái
sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh
trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính
cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các
hóa chất đối với tế bào và mơ trong q trình ni cấy. Hiện nay, các nhà
khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn
đề có liên quan đến thực vật như sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và
cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật cũng mở rộng tiềm
năng nhân giống vơ tính đối với các lồi cây trồng quan trọng, có giá trị về
mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người.
1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào

thực vật.
Năm 1902, nhà thực vật học người Đức Gottlied Haberlandt lần đầu
tiên đưa ra ý tưởng cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể nhưng những thí
nghiệm của Haberlandt khi đó với các tế bào mơ mềm biểu bì đã bị thất bại do
chúng không thể phân chia được [14].
Năm 1922, Kotte là học trị của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp
lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hịa
thảo (cây ngơ). Hai tác giả đã nuôi được trong một thời gian ngắn (12 ngày)
trên môi trường lỏng có chứa đường glucozơ và muối khống kết quả thu
được hệ rễ nhỏ [14].


6

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực
vật khi White (người Mỹ) đã duy trì được sinh trưởng của đầu rễ cà chua
trong một thời gian khá dài, trên môi trường lỏng có chứa đường, một số
muối khống và dịch chiết nấm men [14].
Trong thời gian 1934-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trưởng
thuộc nhóm Auxin được ni cấy và tổng hợp thành công: axit Naphthalen
axetic (NAA); axit 2,4 D- dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…
Năm 1954, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều
khiển sự nhân chồi. Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ
kích thích sinh trưởng rõ rệt trong ni cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá.
Một năm sau, chất đó được tổng hợp thành cơng và được Skoog gọi là
Kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào. Skoog và Miller đã chứng minh
sự biệt hóa của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc
vào nồng độ tương đối của Auxin/Cytokinin và từ đó đưa ra quan niệm điều
khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật. Thành công
của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai

đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy, đánh
dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được
dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng
rộng rãi cho đến nay [14].
Trong khoảng thời gian từ 1954-1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã
được phát triển và hoàn thiện dần. Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế
bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dưỡng
định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo được cây hoàn chỉnh
từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các
chất trao đổi thứ cấp...
Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính địa lan
bằng ni cấy đỉnh sinh trưởng và đã tạo ra được các protocom từ địa lan. Từ
kết quả đó, lan được xem là cây ni cấy mơ đầu tiên được thương mại hóa.


7

Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi
phấn cây cà độc dược. Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành cơng với
cây thuốc lá. Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều lồi thực vật thơng qua
ni cấy bao phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền
và lai tạo giống. Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào
triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả người Nhật là
Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo
được cellulose. Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast
của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai
xa ở thực vật. Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có
khả năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngồi, do đó
chúng là những đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [14].

Từ đó đến nay, cơng nghệ ni cấy mơ- tế bào thực vật đã được phát
triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng rộng rãi trong
nhân giống nhiều lồi thực vật, chọn dịng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở
thực vật…
1.2.3. Cơ sở khoa học của ni cấy mơ - tế bào thực vật
1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào
Gottlibeb Haberlant (1902)- nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu
tiên cho ni cấy mơ tế bào thực vật. Ơng đã đưa ra giả thuyết về tính tồn
năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo
ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang tồn bộ lượng thơng tin
di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp,
mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hồn chỉnh” [14].
Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến ngày nay, các nhà khoa
học đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ
một tế bào riêng rẽ.
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa


8

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mơ chun
hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào
đã phân hóa thành mơ chức năng chúng hồn tồn mất khả năng phân chia
của mình. Trong những điều kiện mơi trường thích hợp, chúng lại có thể trở
về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào hợp tử ban đầu và
cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh. Q trình đó
được gọi là sự phản phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản
phân hóa là một q trình điều hồ hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó
trong q trình phát triển của cá thể có một số gen được hoạt hóa (mà vốn

trước đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ
hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu
trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào. Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một
khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách
riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mơ sẽ tạo điều kiện thuận lợi
cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, q trình hoạt hóa sẽ được xảy ra theo
một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó.
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro
Q trình ni cấy in vitro được chia ra 5 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh
virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện
mơi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hiệu quả
trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và
sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
* Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm
bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng
tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.
Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa,


9

cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để
nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì
dung hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là ngun liệu ni cấy thích hợp
để nhân nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể được sử dụng
làm mẫu cấy.

* Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo
phơi vơ tính. Phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích
hợp để có hiệu quả là cao nhất. Nếu mơi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích
thích tạo chồi. Điều kiện nuôi cấy thường là 25-27oC và 16 giờ chiếu sáng
một ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối
tượng ni cấy địi hỏi có chế độ ni cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần
quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan Phalenopsis ở giai
đoạn đầu cần che tối.
* Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi
trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ Auxin.
Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh
giàu Cytokinin sang môi trường không chứa chất điều hịa sinh trưởng.
* Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườm ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt được nhưng
tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Cây con cao 5- 7
cm và có từ 3- 4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vơ trùng có bổ
sung các chất dinh dưỡng. Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể
sạch, tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu
sáng của vườm ươm, cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [11].
1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro.
1.2.5.1. Điều kiện vô trùng


10

Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của q trình ni cấy

in vitro. Nếu trong q trình ni cấy khơng đảm bảo điều kiện vơ trùng thì
mẫu sẽ bị nhiễm nấm, khuẩn.
* Vô trùng dụng cụ và môi trường:
Để vô trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy, có thể sử dụng một trong các
phương pháp sau:
- Khử trùng khô: Phương pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim loại,
thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Các dụng cụ trước khi đem sấy phải
được gói kín bằng giấy nhơm và chỉ được mở trong tủ cấy vô trùng. Thiết bị
dùng khử trùng khô là lò sấy, tủ sấy, nhiệt độ thường dùng là khoảng 1210C1800, trong 90-120 phút.
- Khử trùng ướt: Là phương pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô
trùng môi trường và các dụng cụ nuôi cấy. Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô
trùng, nhiệt độ thường dùng ở 1210C.
- Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thước 0,025- 10
µm khỏi mơi trường nuôi cấy, nước cất... Đây là phương pháp phù hợp với
các môi trường mà thành phần của chúng bị phân huỷ ở nhiệt độ cao.
* Vô trùng mẫu cấy:
Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu cấy nhưng ở các vị trí
khác nhau thì phương pháp khử trùng mẫu cấy là khác nhau. Phương pháp
phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng
tiêu diệt vi sinh vật như cồn 70o, các chất làm giảm sức căng bề mặt như
Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol, thủy ngân hoặc các chất kháng sinh,…
Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hóa chất khử
trùng. Một hóa chất được lựa chọn để vơ trùng phải đảm bảo 2 thuộc tính: có
khả năng diệt vi sinh vật tốt và khơng hoặc ít ảnh hưởng mẫu thực vật [14].
1.2.5.2. Ánh sáng và nhiệt độ.
Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những phịng ni ổn định
về ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các trường hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng
trừ một số trường hợp ni cấy tạo mơ sẹo, nhưng q trình nhân giống của

11

chúng cũng cần có ánh sáng. Nhiệt độ của các phịng ni cấy thường được
duy trì từ 25- 280C nhờ các máy điều hồ nhiệt độ.
1.2.6. Mơi trường ni cấy in vitro
1.2.6.1. Thành phần của môi trường
Thành phần môi trường ni cấy mơ- tế bào thay đổi tuỳ theo lồi
thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mơ, cơ
quan nhưng mục đích ni cấy khác nhau thì mơi trường ni cấy khác nhau
cũng khá cơ bản. Mơi trường ni cấy cịn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng
và phát triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất
nhưng môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:
* Thành phần vơ cơ:
Bao gồm các muối khống (đa lượng và vi lượng) được bổ sung vào
môi trường ni cấy.
- Trong muối khống đa lượng, các ngun tố cần phải cung cấp là: Nitơ,
Phospho, Kali và Sắt.
+ Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng nitrat (NO3-) với hàm lượng
≈ 25 mM và amon (NH4+) với hàm lượng từ 2- 20 mM.
+ Phospho thường được đưa vào môi trường ở dạng muối phosphat, hai loại
hợp chất hay được dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lượng phospho
trong môi trong môi trường nuôi cấy từ 0,15- 0,40 mM.
+ Kali được cung cấp cho môi trường nuôi cấy dưới dạng KNO3, KCl và
KH2PO4. Nồng độ kali sử dụng từ 2- 25 mM [14].
- Yêu cầu về muối khống vi lượng của mơ thực vật trong ni cấy khá phức
tạp và ít được nghiên cứu. Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát
triển của mẫu nuôi cấy. Đây là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ nhỏ
hơn 30 ppm, chúng đóng vai trị quan trọng trong các hoạt động của enzyme.
+ Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit
amin tự do làm cho các tế bào không phân chia.

12

+ Bo: thiếu Bo trong môi trường nuôi cấy thường gây lên biểu hiện thừa
Auxin. Mơ ni cấy có biểu hiện tạo mơ sẹo hóa mạnh nhưng thường là mơ
xốp, mọng nước, kém tái sinh...
* Thành phần hữu cơ
- Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol:
+ Vitamin: Các vitamin hay được sử dụng là các vitamin nhóm B (B1, B3,
B6), ngồi ra mơi trường ni cấy cịn sử dụng một số vitamin khác như
vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E...với các nồng độ
khác nhau.
+ Myo-inositol là một loại đường- rượu liên quan đến quá trình tổng hợp
phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng trong tế bào, tham
gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường và trao đổi Hydratcacbon.
Hàm lượng sử dụng là 100 mg/l môi trường [10].
+ Các aminoaxit và amit: Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường phải
được bổ sung các aminoaxit, amit... vì chúng có vai trị quan trọng trong phát
sinh hình thái. Theo Skoog & Milles (1957) tất cả các dạng tự nhiên của
aminoaxit (dạng L) dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ, L-arginin dùng cho
nuôi cấy rễ, L- tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi, L- serin dùng cho nuôi cấy hạt
phấn. Nồng độ sử dụng mỗi loại 10- 100 mg/l [10].
- Thành phần hữu cơ phức hợp: Được dùng trong môi trường nuôi cấy để
cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất...Chúng
được sử dụng khi mơi trường khống xác định khơng đạt kết quả mong muốn
về sinh trưởng và phát triển của mẫu nghiên cứu. Một số chất được sử dụng
phổ biến là: Cazein thuỷ phân, dịch chiết nấm men, dịch chiết hoa, củ, quả,...
* Các chất điều hoà sinh trưởng:
Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu được trong môi

trường ni cấy, có vai trị quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in
vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại và
nồng độ chất điều hồ sinh trưởng sử dụng trong ni cấy.


13

- Nhóm Auxin: Được đưa vào mơi trường ni cấy nhằm thúc đẩy sự sinh
trưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi
chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính...
(Epstein&cs, 1989). Các loại Auxin thường sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α- NAA (α- Naphthalene acetic acid)
+ 2,4 D (2,4 diclorophenoxy acetic acid)...
IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm lượng
cao 1,0- 3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các Auxin khác có hàm lượng sử
dụng từ 0,1- 2,0 mg/l.
- Nhóm Cytokinin:
Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi
in vitro (Miller, 1962). Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh
trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh
phơi vơ tính của mẫu ni cấy. Các loại Cytokinin thường dùng trong nuôi
cấy mô là:
+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine).
+ BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).
Hàm lượng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1- 2,0 mg/l. Ở

những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành
chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại
Cytokinin nói trên, Kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả Auxin và Cytokinin ở những
tỷ lệ khác nhau.
- Nhóm Gibberellin:


14

Ngồi hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin, trong ni cấy mơ người ta cịn
sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích
thước của chồi nuôi cấy...GA3 là loại Gibberellin được sử dụng thường xuyên
nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên phải lọc qua màng lọc vô trùng
rồi mới đưa vào môi trường.
* Nguồn cacbon các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung khơng thể
quang hợp hoặc quang hợp nhưng ở cường độ rất thấp. Vì vậy phải đưa thêm
những hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy. Loại
hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường saccharose với hàm lượng từ
2- 6% (W/v). Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol
rất ít dùng. Hàm lượng đường thấp được sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần,
ngược lại hàm lượng đường cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi.
* Các thành phần khác
- Tác nhận tạo gel quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Chất
tạo gel được sử dụng phổ biến là agar. Nồng độ agar sử dụng từ 0,5 đến 10%
(W,v) tùy theo chất lượng của chúng và môi trường sử dụng. Khi môi trường
nuôi cấy là môi trường lỏng hoặc bán lỏng thì khơng hoặc bổ sung rất ít agar.
- Than hoạt tính được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các
sản phẩm trao đổi chất thứ cấp...trong trường hợp những chất đó có tác dụng
gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào mơi

trường, than hoạt tính làm thay đổi mơi trường ánh sáng do mơi trường trở
nên sẫm vì vậy có thể kích thích q trình tạo rễ, một số trường hợp cịn có
tác dụng thúc đẩy phát sinh phơi vơ tính và kích thích sinh trưởng phát sinh
cơ quan ở các loài cây gỗ [10]. Nhưng than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả
của các chất điều hồ sinh trưởng, nồng độ than hoạt tính thường sử dụng từ
0,2– 0,3(W/v) [14].
1.2.6.2. pH của môi trường
pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi
5,6- 5,9. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, cịn pH lớn hơn
5,9 agar có thể rất cứng. Nếu trong mơi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá


15

trị pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc q axit thì GA3 sẽ chuyển
sang dạng khơng có hoạt tính.
1.2.6.3. Tính thẩm thấu của mơi trường
Hấp thụ nước của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy bị chi phối bởi
thế năng của nước trong dịch bào và trong mơi trường dinh dưỡng. Các thành
phần chính có ảnh hưởng đến thế năng của nước trong mơi trường bao gồm:
Hàm lượng đường, hàm lượng agar, một số thành phần muối khoáng. Đường
vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu ni cấy đồng thời cịn tham gia vào
điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường. Hàm lượng đường cao, mơ
ni cấy khó hút được nước. Hàm lượng đường thấp là một trong những
nguyên nhân gây ra hiện tượng thuỷ tinh hóa ở mẫu ni cấy, đây là trở ngại
chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm hoặc đồng ruộng.
1.2.7. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô- tế bào thực vật
Phương pháp này có ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý
luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản
xuất và đời sống.

Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm
hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thực tế đã cho phép chúng ta tách và
nuôi cấy trước hết là mơ phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào
khơng chun hóa gọi là mơ sẹo (callus) và từ mơ sẹo thì có thể kích thích tái
sinh và tạo cây hoàn chỉnh.
Về mặt thực tiễn sản xuất: phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để
phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng q, có giá trị kinh tế cao. Hiện
nay phương pháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn
giống cây trồng. Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn
chúng ta có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn
giữ ngun được hoạt tính của mình.
1.3. Tình hình nghiên cứu
1.3.1.Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng trong nhân giống in vitro
1.3.1.1. Vai trò của auxin trong nhân giống in vitro


16

Nhóm chất này được đưa vào mơi trường ni cấy nhằm thúc đẩy sự
sinh trưởng và giãn dài tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao
đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính [5].
Các loại Auxin thường sử dụng cho nuôi cấy: IAA (Indole acetic acid);
IBA(Indolebutyricacid); NOA(Naphthoxyaceticacid); α-NAA (α-Naphthalene
acetic acid); 2,4 D (2,4 diclorophenolxy acetic acid)...Một nghiên cứu cho
thấy rằng, khi bổ sung 1mg/l NAA cho mơi trường ra rễ của lồi Hồng thảo
da cam (D. moschatum) thì thấy rằng cây con trở nên cứng cáp hơn và phát
sinh thêm 3- 4 rễ mới. Đối với lan Bạch nhạn (D. formosum), khi bổ sung
thêm 1 mg/l 2,4- D vào mơi trường ni cấy thì thu được 4,39 lá/ cây, chiều
cao cây đạt khoảng 3,58 cm, số rễ là 4,01 rễ/ cây với chiều dài rễ khoảng 0,85
cm. Hay nồng độ 0,2 mg/l NAA, đã thúc đẩy sự tạo rễ của loài D. Candidum

tới 87,2% [16].
1.3.1.2. Vai trị của Cytokinin trong nhân giống in vitro
Đây là nhóm chất kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trưởng của chồi in vitro. Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh
trưởng của mơ sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh
phơi vơ tính của mẫu ni cấy. Ngồi ra, Cytokinin cảm ứng sự hình thành
chồi nách và loại bỏ ưu thế đỉnh [7]. Các loại Cytokinin thường dùng trong
nuôi cấy mô là: Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine),
Kinetin

(6furfurylamino

purine),

BAP

(Bezylamino

purine),

TDZ

(Thidiazuzon)...
Hàm lượng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1- 2,0 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành
chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại
Cytokinin nói trên, Kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đối với loài D. dendanum, khi ni cấy trong mơi trường MS có bổ sung 2
mg/l BAP đã cho hệ số nhân chồi là 9 chồi/ mẫu cấy, cao hơn so với việc bổ
sung BAP ở nồng độ 1 mg/l. Tuy nhiên với nồng độ 1 mg/l BAP lại thích hợp

cho sự cảm ứng tạo chồi ở loài lan D. henanense [16].