Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân và rễ loài lan trầm (dendrobium nestor) giai đoạn in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN
SỰ PHÁT TRIỂN THÂN VÀ RỄ LOÀI LAN TRẦM
(Dendrobium nestor) GIAI ĐOẠN IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành : Sư phạm Sinh học

Phú Thọ, 2017


TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN
SỰ PHÁT TRIỂN THÂN VÀ RỄ LOÀI LAN TRẦM
(Dendrobium nestor) GIAI ĐOẠN IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành : Sư phạm Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. CAO PHI BẰNG

Phú Thọ, 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời
cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo hƣớng dẫn TS. Cao Phi Bằng đã hƣớng
dẫn tận tình, quan tâm và động viên em hồn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy (cô) trong Trung tâm
nghiên cứu Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Hùng Vƣơng cùng toàn thể
các thầy cô giáo trong khoa Khoa học Tự nhiên, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng
đã tạo điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hồn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện và hồn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn!

Phú Thọ, ngày 15 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Thúy


ii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2

3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ............................................ 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn.......................................................................................... 2
NỘI DUNG...........................................................................................................3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và loài lan Trầm (D. nestor) ...... 3
1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium ................................................................... 3
1.1.1.1. Về phân loại ......................................................................................... 3
1.1.1.2. Về đặc điểm hình thái........................................................................... 3
1.1.2. Giới thiệu về lồi lan Trầm (D. nestor) ..................................................... 4
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật.............................. 5
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 5
1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực
vật ...................................................................................................................... 6
1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật .................................... 8
1.2.3.1. Tính tồn năng của tế bào.................................................................... 8
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa ............................................................ 8
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro ...................................... 9
1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro................................................................ 10
1.2.5.1. Điều kiện vô trùng .............................................................................. 10
1.2.5.2. Ánh sáng và nhiệt độ. ......................................................................... 11
1.2.6. Môi trường nuôi cấy in vitro ................................................................... 11
1.2.6.1. Thành phần của môi trường ............................................................... 11
1.2.6.2. pH của mơi trường ............................................................................. 15
1.2.6.3. Tính thẩm thấu của môi trường ......................................................... 15
1.2.7. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật............ 15
1.3. Tình hình nghiên cứu ................................................................................. 16
1.3.1.Vai trị của các chất điều hòa sinh trưởng trong nhân giống in vitro ....... 16
1.3.1.1. Vai trò của auxin trong nhân giống in vitro ...................................... 16
1.3.1.2. Vai trò của cytokinin trong nhân giống in vitro ................................ 17

iii

1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hồng thảo ...................... 18
1.3.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..................................................... 18
1.3.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước....................................................... 18
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. 21
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 21
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 21
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 21
2.3.1. hương pháp ố trí thí nghiệm ............................................................... 21
2.3.1.1. hương pháp luận .............................................................................. 21
2.3.1.2. hương pháp ố trí thí nghiệm .......................................................... 21
2.3.2. hương pháp thu thập số liệu ................................................................. 24
2.3.3. hương pháp ph n tích và ử l số liệu .................................................. 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 25
3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trƣởng đến sự
phát triển thân của cây in vitro lan Trầm (D. nestor)......................................... 25
3.1.1. Ảnh hưởng của BA đến sự phát triển thân của cây in vitro lan Trầm (D.
nestor) .............................................................................................................. 25
3.1.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát triển thân của cây in vitro lan Trầm
(D. nestor) ....................................................................................................... 29
3.1.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa BA và Kinetin đến sự phát triển thân
của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) ............................................................. 32
3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trƣởng đến
khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) ...................................... 35
3.2.1. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D.
nestor).............................................................................................................. 35
3.2.2. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D.

nestor).............................................................................................................. 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 41
1. Kết luận ....................................................................................................... 41
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 42


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BAP

:

Bezylamino purine

IBA

:

Indole butyric acid

MS

:

Môi trƣờng Murashige & Skoog

MT

:

Môi trƣờng

NAA :

Axit napthalen axetic


v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và sự phát triển thân của cây in
vitro loài lan Trầm (D. nestor) ......................................................................... 25
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D.
nestor) .............................................................................................................. 28
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân và sự phát triển thân của
cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor) ............................................................. 29
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D.
nestor).............................................................................................................. 31
Bảng 3.5. Ảnh hưởng sự phối hợp của BAP và Kinetin đến hệ số nhân và sự
phát triển thân của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor) ............................. 33
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D.
nestor).............................................................................................................. 34
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro loài lan
Trầm (D. nestor).............................................................................................. 36
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro loài lan
Trầm (D. nestor).............................................................................................. 38

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân chồi...................................... 26
Hình 3.2. Chồi c y in vitro trên các mơi trường có bổ sung BAP và ............. 26
trên mơi trường đối chứng............................................................................. 26
Hình 3.3. Ảnh hưởng của BA đến sự phát triển thân .................................. 27
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BA đến số lá .................................................... 28
Hình 3.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi .............................. 30
Hình 3.6. Chồi c y in vitro trên các môi trường có bổ sung BAP và trên
mơi trường đối chứng................................................................................... 30
Hình 3.7. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát triển thân ........................... 31
Hình 3.8. Ảnh hưởng của BA đến số lá .................................................... 32
Hình 3.9. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến hệ số nhân chồi ....... 33
Hình 3.10. Chồi c y in vitro trên mơi trường có bổ sung kết hợp BAP với
Kinetin và trên môi trường đối chứng ......................................................... 33
Hình 3.11. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến sự phát triển
thân ............................................................................................................... 34
Hình 3.12. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến số lá ............... 35
Hình 3.13. Rễ c y in vitro trên các mơi trường có bổ sung IBA................. 37
Hình 3.14. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ ................................... 36
Hình 3.15. Ảnh hưởng của IBA đến khối lượng cây ................................... 38
Hình 3.16. Rễ c y in vitro trên các mơi trường có bổ sung NAA ............... 39
Hình 3.17. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ .................................. 40
Hình 3.18. Ảnh hưởng của IBA đến khối lượng cây ................................... 40


1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Phong lan đƣợc biết đến là một loài hoa đẹp mang nhiều ý nghĩa đƣợc mọi
ngƣời ƣa chuộng. Phong lan thƣờng đƣợc dùng làm cảnh, trang trí, và một số
lồi có tác dụng chữa bệnh [14].
Họ Lan có số lƣợng thành phần lồi khơng những phong phú trong tự nhiên
mà còn đa dạng bởi các lồi lan đƣợc lai tạo. Tính đến hiện nay, có đến hơn
25.000 lồi Lan khác nhau. Ở Việt Nam, theo cuốn Phong lan Việt Nam của
Trần Hợp thì Việt Nam có 137 đến 140 chi gồm trên 800 lồi lan rừng [5].
Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan
(Orchidaceae), có khoảng 1400 lồi, ở Việt Nam có 107 lồi và một thứ phân bố
ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển [17]. Trong chi này,
có nhiều lồi có hoa đẹp và đƣợc nhiều ngƣời yêu thích. Tuy nhiên do nhiều
nguyên nhân tác động khác nhau mà hiện nay nhiều loài đã bị khai thác quá mức
dẫn đến bị đe dọa hoặc biến mất [6].
Năm 1893, Veitch đã đăng kí tên cho 1 loài lan đƣợc lai tạo giữa cây D.
anosmum - Phi điệp và cây D. parishii - Song hồng, đƣợc gọi là Lan Trầm
(Dendrobium nestor). Hoa của lan Trầm có mùi thơm nhẹ nhàng, dễ chịu giống
nhƣ mùi hƣơng trầm chứ không quá hắc. Hoa gần giống hai cây cha mẹ nhƣng
có màu tím hồng hoặc màu trắng, rất đẹp nên đƣợc nhiều ngƣời yêu thích. Hiện
nay số lƣợng lồi này trong tự nhiên cịn khá ít và khó nhân giống [3].
Ngày nay cùng với sự phát triển của cơng nghệ sinh học thì vi nhân giống (in
vitro) là công cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm.
Nhân giống in vitro là một phƣơng pháp nhân giống mang lại nhiều ƣu điểm
nhƣ: hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng đều về mặt di truyền, sạch bệnh,
đồng thời có tiềm năng sinh học cao mà lại không tốn diện tích nhân giống.
Trong nhân giống in vitro, ngồi mơi trƣờng nuôi cấy cơ bản, ngƣời ta
thƣờng bổ sung thêm vào mơi trƣờng ni cấy các vitamin, các chất điều hịa
sinh trƣởng, đƣờng, than hoạt tính, nƣớc ép các loại hoa quả nhƣ: chuối, nƣớc

2

dừa, khoai tây…Trong đó, các chất điều hịa sinh trƣởng có ảnh hƣởng rất lớn
đến hệ số nhân và chất lƣợng của chồi, cũng nhƣ có ảnh hƣởng lớn tới khả năng
ra rễ của cây. Chính vì vậy chúng tơi lựa chọn thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân và
rễ loài lan Trầm (Dendrobium nestor) giai đoạn in vitro”.
Đề tài này đƣợc thực hiện sẽ góp phần hồn thiện quy trình nhân giống in
vitro cho lồi lan quý này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều
hòa sinh trƣởng đến sự phát triển thân cây in vitro Lan Trầm.
Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều
hòa sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro Lan Trầm.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả đề tài nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về ảnh hƣởng của
các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát triển thân và rễ
cây in vitro loài lan Trầm.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài đƣợc thực hiện sẽ là cơ sở cho việc hồn thiện quy trình nhân
giống in vitro cho loài lan đẹp này.
Kết quả đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lƣợng cũng nhƣ hiệu quả
kinh tế trong sản xuất giống lan Trầm trên địa bàn tỉnh Phú Thọ.


3

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và loài lan Trầm (D. nestor)
1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium
1.1.1.1. Về ph n loại
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan. Hiện nay,
chi này bao gồm hơn 1200 loài đƣợc chia thành 40 nhóm thuộc dịng
Dendrobiinae. Chi Dendrobium đƣợc phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Nam Á,
Đông Á và Đông Nam Á cho đến Philippines, Borneo, Australia, NewZealand,
riêng ở Việt Nam có trên 110 lồi [5, 10].
Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ. Có ngƣời gọi là Hồng
lan, có ngƣời gọi là Đăng lan. Dendrobium chia thành 2 dạng chính:
 Dạng đứng (D. phalaenopsis) thƣờng mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và ra nhiều
hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên…
 Dạng thịng (D. mobile) chịu khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu,
Phi điệp vàng…
1.1.1.2. Về đặc điểm hình thái
Rễ chi Dendrobium thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật đƣợc bao bọc
bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nƣớc, muối khoáng và ngăn
chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc
lạp khơng bị ngăn bởi mơ xốp nên có thể giúp cây quang hợp. Rễ của lan
Dendrobium không chịu đƣợc lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị
mục nát và cây bị chết [4].
Thân thuộc loại giả hành có đặc điểm là những đoạn phình to, bên trong có
các mơ mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nƣớc và dự trữ chất dinh dƣỡng
để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngồi ra giả
hành cịn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp đƣợc. Hình dạng và kích thƣớc


4

của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau
tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [8].
Lá có hình kim, trụ hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nƣớc, dai, có
màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải
rộng hay gấp lại theo gân vòng cung nhƣ cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa
nhƣ hình chữ V [4]. Các lồi thuộc giống Dendrobium đôi khi trút lá vào mùa
khô hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mƣa thì cho chồi mới [1].
Dendrobium có cụm hoa mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa
có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ
cuống. Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa đƣợc tạo thành
bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và một trụ hoa) [1].
Quả họ Orchidaceae có quả thuộc quả nang. Khi hạt chín, các nang bung ra
chỉ cịn dính lại với nhau ở đỉnh gốc. Ở một số loài khi chín quả khơng nứt ra
nên hạt chỉ ra khỏi quả khi bị mục nát. Quả chứa 10.000 – 100.000 hạt, đơi khi
đến 3 triệu hạt có kích thƣớc rất nhỏ nên phơi hạt chƣa phân hóa. Sau 3 – 5 tháng
hạt chín và phát tán nhờ gió [3].
1.1.2. Giới thiệu về lồi lan Trầm (D. nestor)
Lan Trầm có tên khoa học là D. nestor thuộc: chi Dendrobium, họ Lan:
Orchidacea, bộ Lan : Orchidales, lớp Một lá mầm: Monocotyledone, ngành
Ngọc Lan: Mangoliophyta [5, 23].
Lan trầm (D. nestor) là một giống lai lan lai tạo giữa cây D. anosmum (Giã
hạc, Phi điệp) và cây D. parishii (Song hồng, Hồng thảo tím) đƣợc Veitch đăng
kí vào năm 1893 với tên D. nestor. Thân cây chỉ từ 20 - 40 cm, không quá dài
cũng không quá mập, lên thẳng nhƣ cây D. parishii chứ không dài và buông
thõng nhƣ D. anosmum.
Lan trầm đa số là trồng trong chậu chứ khơng trồng bó vào thân gỗ giống
nhƣ lan Long tu hay Giả hạc. Lan Trầm ƣa sáng, thống gió, nhƣng cần tránh ánh
nắng trực tiếp, tiếp xúc nhiều sẽ gây cháy lá và lan chậm lớn. Nhiệt độ sống thích
hợp từ 18 đến 250C, độ ẩm từ 70 đến 90% là tốt nhất. Nhiệt độ để lan trầm ra hoa

5

phải từ 13 đến 150C và kéo dài liên tục từ 4 – 6 tuần lễ. Mùa nắng cần phải tƣới
nƣớc thƣờng xuyên để cây luôn giữ đƣợc ẩm độ cần thiết, để lan không bị khô và
bị rụt lại do thiếu nƣớc. Đến mùa thu khoảng từ tháng 10 trở đi, lá cây bắt đầu úa
vàng và rụng, vào thời gian này cần giảm việc tƣới nƣớc lại, tƣới một tuần một
lần. Cuối mùa đông, đầu mùa xuân, cây bắt đầu nhú nụ, chuẩn bị cho thời kỳ nở
hoa. Hoa của lan Trầm khá giống 2 cây cha mẹ, mơi hoa có nhiều lơng, mùi thơm
nhẹ nhàng dễ chịu nhƣ hƣơng trầm, khơng q hắc và có màu sắc rất đẹp.
Khi hoa đã tàn, các cây con mọc ra ở gốc cây. Một số cây con mọc ra ở các
đốt gần ngọn hay ở phía dƣới các đốt đã ra hoa đƣợc gọi là cây keiki. Những cây
con mọc ra ở gốc thƣờng mọc ra sớm hơn và chúng có thể ra hoa vào mùa tới,
cịn các cây keiki phải đợi đến mùa sau chúng mới có thể ra hoa.
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.2.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là
thuật ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn,
mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa mơi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp
nhƣ muối khống, vitamin, đƣờng và các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật
trong điều kiện vô trùng.
Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ
quan từ các mô nhƣ lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trƣởng. Trƣớc kia
ngƣời ta dùng phƣơng pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào
nhƣ sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hƣởng của các hóa chất đối với tế
bào và mơ trong q trình ni cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ
thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến
thực vật nhƣ sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và cấu trúc thực vật.
Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân

giống vơ tính đối với các lồi cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế
và thƣơng mại trong đời sống hàng ngày của con ngƣời.


6

1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào
thực vật
Năm 1902, nhà thực vật học ngƣời Đức Gottlied Haberlandt lần đầu tiên
đƣa ra ý tƣởng cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể nhƣng những thí nghiệm
của Haberlandt khi đó với các tế bào mơ mềm biểu bì đã bị thất bại do chúng
không thể phân chia đƣợc [19].
Năm 1922, Kotte là học trò của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại thí
nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ một cây hịa thảo
(cây ngơ). Hai tác giả đã nuôi đƣợc trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên mơi
trƣờng lỏng có chứa đƣờng glucozơ và muối khống thu đƣợc hệ rễ nhỏ [19].
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực
vật khi White (ngƣời Mỹ) đã duy trì đƣợc sinh trƣởng của đầu rễ cà chua
trong một thời gian khá dài, trên mơi trƣờng lỏng có chứa đƣờng, một số
muối khoáng và dịch chiết nấm men [19].
Trong thời gian 1941-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trƣởng thuộc
nhóm Auxin đƣợc nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit naphthalen axetic
(NAA), axit 2,4 D- dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…
Năm 1954, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều
khiển sự nhân chồi. Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ
kích thích sinh trƣởng rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá.
Một năm sau, chất đó đƣợc tổng hợp thành cơng và đƣợc Skoog gọi là kinetin
có tác dụng kích thích sự phân bào. Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt
hóa của rễ, chồi trong nghiên cứu ni cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào
nồng độ tƣơng đối của auxin/cytokinin và từ đó đƣa ra quan niệm điều khiển

hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật. Thành công của
Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn
thứ 3 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải
tiến môi trƣờng nuôi cấy, đánh dấu một bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô.


7

Môi trƣờng của họ đã đƣợc dùng làm cơ sở cho việc ni cấy nhiều loại cây
và vẫn cịn đƣợc sử dụng rộng rãi cho đến nay [19].
Trong khoảng thời gian từ 1954 -1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã
đƣợc phát triển và hoàn thiện dần. Melcher và Beckman đã ni cấy các tế
bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dƣỡng
định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo đƣợc cây hoàn chỉnh
từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các
chất trao đổi thứ cấp...
Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính địa lan
bằng ni cấy đỉnh sinh trƣởng và đã tạo ra đƣợc các protocom từ địa lan. Từ
kết quả đó, lan đƣợc xem là cây ni cấy mơ đầu tiên đƣợc thƣơng mại hóa.
Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo đƣợc cây đơn bội từ nuôi cấy túi
phấn cây cà độc dƣợc. Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành công với
cây thuốc lá. Việc tạo cây đơn bội thành cơng ở nhiều lồi thực vật thơng qua
ni cấy bao phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền
và lai tạo giống.
Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của
kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả ngƣời Nhật là Nagata và Takebe đã
thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo đƣợc cellulose.
Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với
protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật.
Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ

các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngồi, do đó chúng là những đối
tƣợng lý tƣởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [19].
Từ đó đến nay, cơng nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã đƣợc phát
triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong
nhân giống nhiều loài thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở
thực vật…


8

1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.2.3.1. Tính tồn năng của tế bào
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học ngƣời Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho ni cấy mơ tế bào thực vật. Ơng đã đƣa ra giả thuyết về tính toàn
năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo
ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lƣợng
thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện
thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hồn chỉnh” [19].
Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận
của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến ngày nay, các nhà
khoa học đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn
chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
1.2.3.2. Sự ph n hóa và phản ph n hóa
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mơ chun hóa,
đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân
hóa thành mơ chức năng chúng hồn tồn mất khả năng phân chia của mình.
Trong những điều kiện mơi trƣờng thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng
tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ nhƣ tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các
tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh. Q trình đó đƣợc gọi là
sự phản phân hóa tế bào.

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình điều hồ
hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển của cá thể có
một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng
mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào.
Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thƣờng bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc
của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, q
trình hoạt hóa sẽ đƣợc xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó.


9

1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro
Q trình ni cấy in vitro đƣợc chia ra 5 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trƣớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh
virus và ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện
mơi trƣờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hiệu quả
trƣớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh
trƣởng của mẫu cấy in vitro.
* Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn
này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại
và sinh trƣởng tốt.
Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.
Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa,
cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngon, chồi nách đƣợc sử dụng để nhân
nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì dung

hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là ngun liệu ni cấy thích hợp để nhân
nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể đƣợc sử dụng làm mẫu cấy.
* Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lƣợng thơng qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định,
tạo phơi vơ tính.
Phải xác định đƣợc mơi trƣờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có
hiệu quả là cao nhất. Nếu mơi trƣờng có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi.
Điều kiện ni cấy thƣờng là 25-27oC và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cƣờng độ ánh
sáng 2000-4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tƣợng ni cấy địi hỏi có
chế độ ni cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9
giờ/ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối.


10

* Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh sang
môi trƣờng tạo rễ. Môi trƣờng tạo rễ thƣờng đƣợc bổ sung một lƣợng nhỏ
Auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trƣờng nhân
nhanh giàu cytokinin sang môi trƣờng không chứa chất điều hịa sinh trƣởng.
* Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờm ƣơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
Cây trong ống nghiệm đã đạt đƣợc nhƣng tiêu chuẩn hình thái nhất định
(số lá, số rễ, chiều cao cây). Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển
sang cấy vào bầu đất mùn vơ trùng có bổ sung các chất dinh dƣỡng.
Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát
nƣớc. Phải chủ động điều chỉnh đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng của vƣờm ƣơm,
cũng nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp [13].

1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro
1.2.5.1. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành cơng của q trình ni cấy in
vitro. Nếu trong q trình ni cấy khơng đảm bảo điều kiện vơ trùng thì mẫu
sẽ bị nhiễm nấm, khuẩn.
* Vô trùng dụng cụ và môi trường: Để vô trùng dụng cụ và mơi trƣờng
ni cấy, có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp sau:
- Khử trùng khô: Phƣơng pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim
loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Các dụng cụ trƣớc khi đem sấy
phải đƣợc gói kín bằng giấy nhôm và chỉ đƣợc mở trong tủ cấy vơ trùng.
Thiết bị dùng khử trùng khơ là lị sấy, tủ sấy, nhiệt độ thƣờng dùng là 1210C –
1800C, trong 90-120 phút.
- Khử trùng ƣớt: Là phƣơng pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô
trùng môi trƣờng và các dụng cụ nuôi cấy. Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô
trùng, nhiệt độ thƣờng dùng ở 1210C.


11

- Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thƣớc
0,025-10µm khỏi mơi trƣờng ni cấy, nƣớc cất... Đây là phƣơng pháp phù
hợp với các môi trƣờng mà thành phần của chúng bị phân huỷ ở nhiệt độ cao.
* Vô trùng mẫu cấy: Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu
cấy nhƣng ở các vị trí khác nhau... thì phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy là
khác nhau. Phƣơng pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng
hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật nhƣ cồn 70o, các chất làm giảm sức
căng bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol, thủy ngân hoặc các
chất kháng sinh,… Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian
xử lý hóa chất khử trùng. Một hóa chất đƣợc lựa chọn để vô trùng phải đảm
bảo 2 thuộc tính: Có khả năng diệt vi sinh vật tốt và khơng hoặc ít ảnh hƣởng

mẫu thực vật [19].
1.2.5.2. Ánh sáng và nhiệt độ.
Các mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc đặt trong những phịng ni ổn định về
ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các trƣờng hợp ni cấy đều cần có ánh sáng trừ
một số trƣờng hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhƣng q trình nhân giống của
chúng cũng cần có ánh sáng. Nhiệt độ của các phịng ni cây thƣờng đƣợc
duy trì từ 25-28oC nhờ các máy điều hồ nhiệt độ.
1.2.6. Môi trường nuôi cấy in vitro
1.2.6.1. Thành phần của môi trường
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô - tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực
vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mơ, cơ quan
nhƣng mục đích ni cấy khác nhau thì mơi trƣờng ni cấy khác nhau cũng
khá cơ bản. Mơi trƣờng ni cấy cịn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và
phát triển của mẫu cấy.
Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhƣng môi trƣờng nuôi cấy
đều gồm các thành phần sau:
* Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lƣợng và vi lƣợng)
đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy.


12

- Trong muối khoáng đa lƣợng, các nguyên tố cần phải cung cấp là:
Nitơ, phospho, kali và sắt.
+ Nitơ vô cơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở hai dạng nitrat (NO3-) với hàm
lƣợng ≈ 25mM và amon (NH4+) với hàm lƣợng từ 2-20mM.
+ Phospho thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng muối phosphat, hai
loại hợp chất hay đƣợc dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lƣợng
phospho trong môi trong môi trƣờng nuôi cấy từ 0,15-0,40 mM.
+ Kali đƣợc cung cấp cho môi trƣờng nuôi cấy dƣới dạng KNO3, KCl và

KH2PO4. Nồng độ kali sử dụng từ 2-25 mM [Vũ Văn Vụ].
- Yêu cầu về muối khoáng vi lƣợng của mơ thực vật trong ni cấy khá
phức tạp và ít đƣợc nghiên cứu. Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trƣởng và
phát triển của mẫu nuôi cấy. Đây là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ
nhỏ hơn 30ppm, chúng đóng vai trị quan trọng trong các hoạt động của enzyme.
+ Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhƣng lại làm tăng ADN và các
axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia.
+ Bo: thiếu Bo trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng gây lên biểu hiện thừa
Auxin. Mơ ni cấy có biểu hiện tạo mơ sẹo hóa mạnh nhƣng thƣờng là mơ
xốp, mọng nƣớc, kém tái sinh...
* Thành phần hữu cơ
- Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol:
+ Vitamin: Các vitamin hay đƣợc sử dụng là các vitamin nhóm B (B1, B3,
B6), ngồi ra mơi trƣờng ni cấy còn sử dụng một số vitamin khác nhƣ vitamin
H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E... với các nồng độ khác nhau.
+ Myo-inositol là một loại đƣờng – rƣợu liên quan đến quá trình tổng
hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng trong tế bào,
tham gia vào dinh dƣỡng khoáng, vận chuyển đƣờng và trao đổi
hydratcacbon. Hàm lƣợng sử dụng là 100 mg/l môi trƣờng [12].
+ Các aminoaxit và amit: Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trƣờng
phải đƣợc bổ sung các aminoaxit, amit... vì chúng có vai trị quan trọng trong
phát sinh hình thái. Theo Skoog & Milles (1957) tất cả các dạng tự nhiên của


13

aminoaxit (dạng L) dễ dàng đƣợc mô nuôi cấy hấp thụ, L-arginin dùng cho
nuôi cấy rễ, L- tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi, L- serin dùng cho nuôi cấy hạt
phấn. Nồng độ sử dụng mỗi loại 10-100 mg/l [12].
- Thành phần hữu cơ phức hợp: Đƣợc dùng trong môi trƣờng nuôi cấy để

cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khống chất...Chúng
đƣợc sử dụng khi mơi trƣờng khống xác định không đạt kết quả mong muốn
về sinh trƣởng và phát triển của mẫu nghiên cứu. Một số chất đƣợc sử dụng
phổ biến là: Cazein thuỷ phân, dịch chiết nấm men, dịch chiết hoa, củ, quả,...
* Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trƣởng là thành phần khơng thể thiếu đƣợc trong
mơi trƣờng ni cấy, có vai trị quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật
in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trƣởng phụ thuộc vào loại
và nồng độ chất điều hồ sinh trƣởng sử dụng trong ni cấy.
- Nhóm Auxin: Đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh
trƣởng và giãn nở tế bào, tăng cƣờng các q trình sinh tổng hợp và trao đổi
chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính...
(Epstein&cs, 1989). Các loại auxin thƣờng sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α- NAA (α- Naphthalene acetic acid)
+ 2.4 D (2.4 diclorophenoxy acetic acid)...
IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm
lƣợng cao 1,0 - 3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các auxin khác có hàm
lƣợng sử dụng từ 0,1 – 2,0 mg/l.
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trƣởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự
tạo rễ và sinh trƣởng của mô sẹo nhƣng có ảnh hƣởng dƣơng tính rõ rệt đến
sự phát sinh phơi vơ tính của mẫu ni cấy. Các loại cytokinin thƣờng dùng
trong nuôi cấy mô là:


14

+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine).
+ BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).
Hàm lƣợng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành
chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi ni cấy. Trong các loại
cytokinin nói trên, kinetin và BAP là hai loại đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đa số các trƣờng hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở
những tỷ lệ khác nhau.
- Nhóm Gibberellin: Ngồi hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong
ni cấy mơ ngƣời ta cịn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế
bào, qua đó làm tăng kích thƣớc của chồi nuôi cấy... GA3 là loại Gibberellin
đƣợc sử dụng thƣờng xuyên nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên
phải lọc qua màng lọc vô trùng rồi mới đƣa vào môi trƣờng.
* Nguồn cacbon
Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung khơng thể quang hợp hoặc quang
hợp nhƣng ở cƣờng độ rất thấp. Vì vậy phải đƣa thêm những hợp chất
hydratcacbon vào thành phần môi trƣờng nuôi cấy. Loại hydratcacbon đƣợc
sử dụng phổ biến là đƣờng saccharose với hàm lƣợng từ 2-6% (W/v). Những
loại đƣờng khác nhƣ fructose, glucose, maltose, sorbitol rất ít dùng. Hàm
lƣợng đƣờng thấp đƣợc sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần, ngƣợc lại hàm
lƣợng đƣờng cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi.
* Các thành phần khác
- Tác nhân tạo gel quyết định trạnh thái vật lý của môi trƣờng nuôi cấy.
Chất tạo gel đƣợc sử dụng phổ biến là agar. Nồng độ agar sử dụng từ 0,5-10 %
(W/v) tuỳ theo chất lƣợng của chúng và môi trƣờng sử dụng. Khi môi trƣờng
nuôi cấy là môi trƣờng lỏng hoặc bán lỏng thì khơng hoặc bổ sung rất ít agar.
- Than hoạt tính đƣợc dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất
phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp... trong trƣờng hợp những chất đó

15

có tác dụng gây ức chế sinh trƣởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ
sung vào môi trƣờng, than hoạt tính làm thay đổi mơi trƣờng ánh sáng do mơi
trƣờng trở nên sẫm vì vậy có thể kích thích q trình tạo rễ, một số trƣờng
hợp cịn có tác dụng thúc đẩy phát sinh phơi vơ tính và kích thích sinh trƣởng
phát sinh cơ quan ở các lồi cây gỗ [12 ]. Nhƣng than hoạt tính lại làm giảm
hiệu quả của các chất điều hoà sinh trƣởng, nồng độ than hoạt tính thƣờng sử
dụng từ 0,2 – 0,3(W/v) [19].
1.2.6.2. pH của môi trường
pH của đa số các môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh trong phạm vi
5,5-6,0. pH dƣới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, cịn pH lớn hơn
6,0 agar có thể rất cứng.
Nếu trong mơi trƣờng có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH trong phạm
vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc q axit thì GA3 sẽ chuyển sang dạng khơng có
hoạt tính.
1.2.6.3. Tính thẩm thấu của mơi trường
Hấp thụ nƣớc của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy bị chi phối bởi
thế năng của nƣớc trong dịch bào và trong mơi trƣờng dinh dƣỡng. Các thành
phần chính có ảnh hƣởng đến thế năng của nƣớc trong môi trƣờng bao gồm:
Hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng agar, một số thành phần muối khống.
Đƣờng vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu ni cấy đồng thời còn
tham gia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trƣờng. Hàm lƣợng đƣờng
cao, mô nuôi cấy khó hút đƣợc nƣớc. Hàm lƣợng đƣờng thấp là một trong những
nguyên nhân gây ra hiện tƣợng thuỷ tinh hóa ở mẫu ni cấy, đây là trở ngại
chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm hoặc đồng ruộng.
1.2.7. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mơ - tế bào thực vật
Phƣơng pháp này có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu

lý luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực
tiễn sản xuất và đời sống.


16

Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm
hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thực tế đã cho phép chúng ta tách và
nuôi cấy trƣớc hết là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào
khơng chun hóa gọi là mơ sẹo (callus) và từ mơ sẹo thì có thể kích thích tái
sinh và tạo cây hoàn chỉnh.
Về mặt thực tiễn sản xuất: phƣơng pháp nuôi cấy mô đƣợc sử dụng để
phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng q, có giá trị kinh tế cao. Hiện
nay phƣơng pháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn
giống cây trồng. Ngoài ra, bằng phƣơng pháp này chỉ sau thời gian ngắn
chúng ta có thể tạo đƣợc sinh khối lớn có hoạt chất sinh học đƣợc tạo ra vẫn
giữ nguyên đƣợc hoạt tính của mình.
1.3. Tình hình nghiên cứu
1.3.1.Vai trị của các chất điều hòa sinh trưởng trong nhân giống in vitro
1.3.1.1. Vai trò của au in trong nh n giống in vitro
Nhóm chất này đƣợc đƣa vào mơi trƣờng ni cấy nhằm thúc đẩy sự sinh
trƣởng và giãn dài tế bào, tăng cƣờng các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi
chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính
[7]. Các loại auxin thƣờng sử dụng cho nuôi cấy: IAA (Indole acetic acid), IBA
(Indole butyric acid), NOA (Naphthoxy acetic acid), α- NAA (αNaphthaleneacetic acid), 2.4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid)...
Một nghiên cứu cho thấy rằng, khi bổ sung 1mg/l NAA cho môi trƣờng
ra rễ của loài Hoàng thảo da cam (D. moschatum) thì thấy rằng cây con trở nên
cứng cáp hơn và phát sinh thêm 3 – 4 rễ mới. Đối với lan Bạch nhạn (D.
formosum), khi bổ sung 1 mg/l 2,4-D vào mơi trƣờng ni cấy thì thu đƣợc
4,39 lá/cây, chiều cao cây đạt khoảng 3,58 cm, số rễ là 4.01 rễ / cây với chiều

dài rễ khoảng 0,85 cm. Hay nồng độ 0,2mg/l NAA, đã thúc đẩy sự tạo rễ của
loài D. candidum tới 87,2% [21].


17

1.3.1.2. Vai trò của cytokinin trong nh n giống in vitro
Đây là nhóm chất kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trƣởng của chồi in vitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh
trƣởng của mơ sẹo nhƣng có ảnh hƣởng dƣơng tính rõ rệt đến sự phát sinh phơi
vơ tính của mẫu ni cấy. Ngồi ra, cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi nách
và loại bỏ ƣu thế đỉnh [7]. Các loại cytokinin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô
là: Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine), kinetin (6furfurylamino purine), BAP (Bezylamino purine), TDZ (Thidiazuzon)...
Hàm lƣợng sử dụng của các cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành
chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại
cytokinin nói trên, kinetin và BAP là hai loại đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đối với loài D. denndanum, khi ni cấy trong mơi trƣờng MS có bổ
sung 2mg/l BAP đã cho hệ số nhân chồi là 9 chồi/mẫu cấy, cao hơn so với
việc bổ sung BAP ở nồng độ 1mg/l. Tuy nhiên với nồng độ 1mg/l BAP lại
thích hợp cho sự cảm ứng tạo chồi ở loài D. henanense [21].
Đa số các trƣờng hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở
những tỷ lệ khác nhau. Cụ thể nhƣ:
Năm 2011, tác giả Nguyễn Văn Song và cộng sự đã thực hiện nhân nhanh
in vitro lan Kim Điệp (D. chrysotoxum) – Một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt
chủng và chỉ ra mơi trƣờng thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocom của
hạt là MS cơ bản có 20 g/l saccarozơ, 8 g/l agar, 15% nƣớc dừa và 2 mg/l BAP.
Môi trƣờng nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS cơ bản có 20 g/l saccarozơ, 8
g/l agar, 15% nƣớc dừa và 2 mg/l BAP. Mơi trƣờng MS cơ bản có 30 g/l
saccarozơ, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nƣớc dừa, 2 mg/l BAP và 1 mg/l

NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh trƣởng của chồi in
vitro. Môi trƣờng MS cơ bản có 20 g/l saccarozơ, 8 g/l agar, 15% nƣớc dừa và
1 mg/l NAA là thích hợp cho tạo rễ của chồi in vitro [12].
Năm 2015, tác giả Nguyễn Thị Tình và cộng sự ở trƣờng Đại học Nông lâm
Thái Nguyên đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống Lan Thạch Hộc (D.