Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân, lá và rễ của loài lan sơn thủy tiên(dendrobium chrysotoxum) giai đoạn invitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------

HOÀNG THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ
PHÁT TRIỂN THÂN, LÁ VÀ RỄ CỦA LỒI LAN
SƠN THỦY TIÊN (Dendrobium chrysotoxum)
GIAI ĐOẠN IN VITRO

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành Sư phạm Sinh học

Phú Thọ, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------

HOÀNG THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ
PHÁT TRIỂN THÂN, LÁ VÀ RỄ CỦA LỒI LAN
SƠN THỦY TIÊN (Dendrobium chrysotoxum)
GIAI ĐOẠN IN VITRO

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành Sư phạm Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. TRẦN TRUNG KIÊN

Phú Thọ, 2018


i
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận được sự
giúp đỡ của ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, cùng toàn thể các thầy
cô giáo trong khoa Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ để em nghiên
cứu và thực hiện khóa luận này. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
nhất tới thầy giáo hướng dẫn TS.Trần Trung Kiên đã tận tình hướng dẫn,
quan tâm và động viên em hồn thành khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Trung tâm nghiên cứu
công nghệ sinh học, trường Đại học Hùng Vương đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo
giúp em hồn thành tốt khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, tháng 5 năm 2018
Sinh Viên

Hoàng Thị Thùy Linh


ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là

của riêng tơi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong khóa luận là trung
thực.Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các
thơng tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc và được phép
công bố.
Phú Thọ, ngày … tháng 5 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Hoàng Thị Thùy Linh


iii
MỤC LỤC
Trang phụ bìa………………………………………………………………….i
Lời cảm ơn……………………………………………………………………ii
Lời cam đoan………………………………………………………………....iii
Mục lục………………………………………………………………………iv
Danh mục bảng………………………………………………………………vi
Danh mục hình………………………………………………………………vii
Danh mục chữ viết tắt……..……………………………………..………….iv
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài: ........................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài:.............................................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn: ............................................................... 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................................... 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................................... 2
CHƯƠNG II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU..................................................................... 2
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3
1.1. Tình hình nghiên cứu .................................................................................................. 3
1.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước: ..................................................................... 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới: .................................................................. 3

1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của loài lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chysotoxum): .................................................................................................... 5
1.2.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại: ................................................................................. 5
1.2.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học:................................................................. 5
1.3. Môi trường nuôi cấy.................................................................................................... 6
1.3.1. Thành phần môi trường:........................................................................................ 6
1.3.2. pH của mơi trường: ................................................................................................. 8
1.4. Các chất điều hịa sinh trưởng:................................................................................. 8
1.4.1. Nhóm Auxin:.............................................................................................................. 8


iv
1.4.2.Nhóm Cytokinin: ........................................................................................................ 8
PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 10
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:...................................................................... 10
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 10
2.3. Phương pháp nghiên cứu: ....................................................................................... 11
2.3.1 Phương pháp luận ................................................................................................... 11
2.3.2. Phương pháp bố thí nghiệm ............................................................................... 11
2.3.3. Phương pháp thu thập sớ liê ̣u

......................................................................... 13

2.3.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liê ̣u ........................................................ 14
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................... 15
3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi Lan Sơn thủy
tiên (Dendrobium chrysotoxum) ........................................................................................ 15
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của cytokinin/auxin đến sự phát
triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum ). ......................... 17
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan

Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) ..................................................................... 17
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ Cytokinin đến sự phát triển của thân, lá cây
lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) .............................................................. 20
3.2.3. Ảnh hưởng sự phối hợp của Auxin/auxin đến sự phát triển của thân,
lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum )............................................... 22
3.2.4. Ảnh hưởng sự phối hợp của cytokinin/auxin đến sự phát triển của
thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum ). .................................. 25
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến khả năng ra rễ cây lan Sơn thủy
tiên (Dendrobium chrysotoxum). ....................................................................................... 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 33
1. Kết luận .............................................................................................................................. 33
2. Kiến nghị ........................................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 34


v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ về sự phối hợp của
Cytokinin/Auxin đến sự phát triển thân, lá của cây lan Sơn thủy tiên

11

Bảng 2.3. Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của Auxin đến
khả năng ra rễ của loài lan Sơn thủy tiên………………………

13

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng
chồi Lan Sơn thủy tiên (Dendrobiumchrysotoxum)…………

15

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến sự phát triển của
thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobiumchrysotoxum)………

17

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Cytokinin đến sự phát triển
của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobiumchrysotoxum)…

19

Bảng 3.4. Ảnh hưởng sự phối hợp của Auxin/auxin đến sự phát
triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên

22

(Dendrobiumchrysotoxum)
Bảng 3.5. Ảnh hưởng sự phối hợp của cytokinin/auxin đến sự
phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium

24

chrysotoxum)……………………………………………………………..
Bảng 3.6.Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến khả năng ra rễ cây
Lan Sơn thủy tiên (Dendrobium

26

chrysotoxum)…………………….
Bảng 3.7.Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến khả năng ra rễ cây
Lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)…………………..

27

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng
BAP/NAA đến sự phát triển chiều dài rễ loài lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chrysotoxum).......................................................

29


vi
DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Hình thái lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)…

5

Hình 2.1. Các cụm protocom lan Sơn thủy tiên.....................................

10

Hình 2.2. Cây lan Sơn thủy tiên chiều cao 2 – 3 cm.............................

10

Hình 3.1. Ảnh hưởng của mơi trường nền đến sự sinh trưởng chồi lan
Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)……………………….

16

Hình 3.2. Ảnh hưởng của 3 loại môi trường đến sự sinh trưởng chồi
lan Sơn thủy tiên………………………………………………………

17

Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát
triển thân và chiều dài lá lồi lan Sơn thủy tiên (Dendrobium
chrysotoxum).........................................................................................

18

Hình 3.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát
triển số lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)...............

18

Hình 3.5. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng TDZ đến sự phát
triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chrysotoxum)...................................................................

20

Hình 3.6. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng TDZ đến sự phát
triển số lá lồi lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)...............

21

Hình 3.7. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng
BAP/NAA đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chrysotoxum)............................................................
Hình 3.8. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng

23

TDZ/NAA đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chrysotoxum)............................................................
Hình 3.9. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hịa sinh trưởng

23

TDZ/NAA đến sự phát triển số lá lồi lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chrysotoxum)...................................................................
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA

27


vii
đến sự phát triển chiều dài rễ loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium
chrysotoxum)...........................................................................................

27

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP
đến sự phát triển chiều dài rễ lồi lan Sơn thủy tiên

(Dendrobium chrysotoxum).....................................................................

28

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP
đến sự phát triển số rễ lồi lan Sơn thủy tiên (Dendrobium
chrysotoxum)............................................................................................

29

Hình 3.13. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng
BAP/NAA đến sự phát triển chiều dài rễ loài lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chrysotoxum).....................................................................

30

Hình 3.14. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng
BAP/NAA đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chrysotoxum).....................................................................

30

Hình 3.15. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng
BAP/NAA đến sự phát triển chiều dài rễ lồi lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chrysotoxum).................................................................

31

Hình 3.16. Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng
BAP/NAA đến sự phát triển thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy

tiên( Dendrobium chrysotoxum)...................................................

32


viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BAP

:

Benzylamino purine

ĐC

:

Đối chứng

IAA

:

Indole acetic acid

KC

:

Knudson C

MS

:

Murashige & Skoog

NAA

:

Naphthaleneacetic acid

TDZ

:

Thidiazuz n


1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài:
Hoa lan là lồi hoa vương giả, với vẻ đẹp kiêu kì huyền bí, có vai trị
quan trọng trong đời sống tinh thần và kinh tế. Ngồi ra chúng có hình dáng,
màu sắc, kích thước phong phú và đa dạng, rất phù hợp với điều kiện khí hậu
Việt Nam.
Tính đến hiện nay có hơn 25.000 lồi lan khác nhau, ở Việt Nam có
137 đến 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng. Trong số đó, lan Hồng thảo

(Dendrobium) có khoảng 1400 lồi, ở Việt Nam có 107 lồi, phân bố ở các
vùng núi từ Bắc vào Nam và cả trên một số đảo ven biển [3]. Lan Sơn thuỷ
tiên (Dendrobium chrysotoxum) là loài lan rừng của Việt Nam thuộc chi
Hồng thảo, hoa có hình thái đẹp, hương thơm nhẹ nhàng, dễ chăm sóc.
Ở Việt Nam, hầu hết các giống lan được đem từ rừng về chăm sóc hoặc
nhân giống bằng cách ươm hạt, tách nhánh….nhưng hiệu quả không cao,
không đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng. Đứng trước những vấn đề
trên cùng với nhu cầu thường thức hoa lan ngày càng cao, ngày nay với sự tiến
bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ khoa học thực vật đã làm thay
đổi hoàn toàn kỹ thuật nhân giống lan. Với kỹ thuật nhân giống in vitro không
những tạo được số lượng cây giống lớn đồng nhất trong một thời gian ngắn mà
cịn ngăn cản sự thối hóa giống.
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự
phát sinh cơ quan của lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) hiện tại
vẫn cịn rất ít các cơng trình nghiên cứu [9], [10]. Trong quá triǹ h nhân giố ng
in vitro, các chấ t điề u hoà sinh trưởng được bổ sung vào mơi trường ni cấy
có ảnh hưởng không nhỏ đế n sự phát sinh cơ quan của lồi lan Sơn thủy tiên.
Vì vậy, tơi đã lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều
hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân, lá và rễ của loài lan Sơn thủy
tiên(Dendrobium chrysotoxum) giai đoạn invitro”


2
1.2. Mục tiêu đề tài:
- Đánh giá được ảnh hưởng của môi trường nền đối với sự sinh trưởng
chồi của cây in vitro lan Sơn thủy tiên.
- Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều
hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân, lá của cây in vitro lan Sơn thủy tiên.
- Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều
hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Sơn thủy tiên.

1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn:
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả đề tài nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về ảnh hưởng
của các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển
thân va rễ cây in vitro loài lan Sơn thủy tiên.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Đềtài được thực hiện sẽ là cơ sởcho việc hồn thiện quy trình nhân
giống invitro cho lồi lan đẹp này.
- Kết quả đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng cũng nhờ hiệu
quảkinh tế trong sản xuất giống lan Sơn thủy tiên trên địa bàn tỉnh Phú Thọ.


3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu về cây lan Hồng thảo
1.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước:
Ở Việt Nam, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực
vật ngày càng được áp dụng rộng rãi đối với nhiều lồi cây trồng nói chung và
cây hoa lan nói riêng. Nhiều lồi lan trong chi Hồng thảo (Dendrobium) đã
được nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
[8], như nghiên cứu của Nguyễn Văn Minh và Nguyễn Hữu Lễ (2009) về ảnh
hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh chồi và rễ cây
phong lan giã hạt (Dendrobiumanosmum) [4]; nghiên cứu của Vũ Thanh Sắc
và cộng sự (2012) về nhân giống invitro lan Hoàng thảo trầm trắng
(Dendrobium anosmum var.alba) [7]; nghiên cứu của Vũ Ngọc Lan, Nguyễn
Thị Lý Anh (2013) về nhân giống in vitro loài Lan bản địa Dendrobium
nobile Lindl (Thạch hộc) [2].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới:
Với cây hoa lan, việc sử dụng các hình thức sing sinh sản vơ tính như ươn,

giâm cây keiki rất ít được áp dụng. Phương pháp nhân giống vơ tính bằng ni cấy
mơ tế bào thực vật ra đời đã nhận được nhiều sự quan tâm và được áp dụng vào
nhân giống cây hoa lan để tạo số lượng lớn. Môi trường dinh dưỡng sử dụng cho
việc nuôi cấy mô hoa lan được sử dụng chủ yếu là môi trường MS (Murashige –
Shoog, 1962), 1/2 MS, V.W (Vacine – Went, 1949), KC (Knudson’s C medium,
1921), N6 (Chu’s medium, 1975) …[2], [5].
Trong thời gian qua đã có một số tác giả nghiên cứu nhân giống bằng
hạt ở các loài lan khác nhau trong chi Hoàng thảo (Dendrobium) như: lan Đơn
cam (Dendrobium unicum) được cho nảy mầm từ hạt 180 ngày tuổi; cho nảy
mầm Hoàng thảo đùi gà (Dendrobium nobile), lan Trúc phật bà (Dendrobium
pendulum) từ hạt trưởng thành; lan Tam bảo sắc (Dendrobium devonianum)
được cho nảy mầm từ hạt giống ở các lứa tuổi khác nhau, lan Vảy rồng


4
(Dendrobium aggregatum) được cho nảy mầm từ hạt 3-4 tháng tuổi sau thụ
tinh nhân tạo,...[8].
Gần đây nhất (năm 2015) một bài báo tổng quan về nuôi cấy in vitro từ
hạt quả của chi hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) đã chỉ ra một số môi
trường để khử trùng quả lan được sử dụng nhiều nhất là: EtOH (cồn) và
HgCl2 (28,3%), EtOH và NaOCl (15,1%), EtOH và đốt nhanh trên ngọn lửa
đèn cồn (15,1%) [10]. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra một số môi trường
nuôi cấy hạt lan được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu là: MS
(30,2%), ½ MS (13,2%),KC(11,3%), N6 (11,3%) [8].
Sơn thủy tiên là một loài lan đẹp, tuy nhiên trên thế giới cũng chưa có
nhiều cơng trình nghiên cứu. Roy và cộng sự (2007) nghiên cứu sự hình thành
mơ sẹo từ đỉnh chồi sử dụng mơi trường Knudson’s C (KC) sửa đổi, có bổ
sung các chất điều hòa sinh trưởng như Thidiazuron (TDZ), N6benzylaminopurine (BAP) and α-Naphthaleneacetic acid (NAA) ở các nồng
độ khác nhau [9]. Nhóm tác giả người Ấn Độ (2014) nghiên cứu sự nảy mần
của hạt lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) trong môi trường Mitra

(M) có bổ sung với nồng độ khác nhau của auxins và cytokinins. Nghiên cứu
chỉ ra rằng, sự nảy mầm hạt lan tốt nhất khi mơi trường M có bổ sung 0.4%
than hoạt tính (AC), 2 mg/l 6-benzyl amino purine (BAP), và 2 mg/l indole-3acetic acid (IAA) [10].


5
1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của lồi lan Sơn thủy tiên
(Dendrobium chysotoxum):
1.2.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại:

Hình 1.1. Hình thái lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum)
Cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) thuộc họ
Orchidaceae- bộ Orchidales - phân lớp Ngọc lan Magnoliidae - lớp Ngọc lan
Magnoliopsida - Ngành hạt kín Magnoliophyta [1].
1.2.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học:
Lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) là lồi lan rừng Việt
Nam. Chúng có giả hành hình dùi bắp, hẹp ở đáy, lớn mập ở giữa rồi thon lại,
có nhiều sóng dọc thấp, màu vàng khi già, cao đến 30cm, mập ú to 3–5cm
đường kính; mang 6-7 lá ở đỉnh, dài 8–15cm, rộng 2.5-3cm. Chùm hoa mọc
mạnh, nghiêng xéo ra rồi cong xuống, dài đến 20cm với nhiều hoa thưa. Hoa
to cỡ 5cm, thơm, màu vàng đậm, ánh như sáp, trung tâm mơi vàng cam, có
lơng và rìa mép. Lồi này có hoa khoảng tháng 2 (âm lịch), tái sinh bằng chồi
và hạt, mọc bám trên các cây gỗ lớn trong rừng, ở độ cao 600-1200m. Do có
hoa đẹp nên được dùng làm cảnh, ngồi ra cịn có giá trị về dược phẩm.


6
Trên thế giới, lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) có ở Ấn
Độ, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào. Còn ở Việt Nam chúng phân bố
chủ yếu ở Nghệ An (Vinh), Kontum (Đắklei, Đắk Uy), Gia Lai (Chư Pah),

Đắk Lắk (Buôn Ma Thuột), Lâm Đồng (Đà Lạt).
Lồi có khu phân bố và nơi cư trú chia cắt. Hiện đã bị suy giảm nghiêm
trọng do khai thác để trồng, bán chủ yếu làm cây cảnh, đôi khi làm thuốc và
chặt phá rừng hủy hoại nơi cư trú.
1.3. Môi trường nuôi cấy
1.3.1. Thành phần môi trường:
Thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài
thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về
thành phần và nồng độ các chất, nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy
đều gồm các thành phần sau:

 Thành phần hữu cơ
- Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzym và cofactor
của các phản ứng sinh hóa. Quan trọng nhất là các vitamin nhóm B.
+ Thiamin cần cho trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp một số
aminoaxit, hàm lượng sử dụng 0,1 – 5mg/l.
+ Axit nicotinic tham gia tạo coenzym của chuỗi hô hấp, sử dụng 0,1 - 5mg/l.
+ Pyridoxin là một coenzym quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi
chất, sử dụng 0,1 – 1mg/l.
- Myo-inositol: là một loại đường - rượu liên quan đến quá trình tổng hợp
phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống trong màng tế bào, tham
gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường và trao đổi hydratcacbon. Ngồi
ra cịn tham gia vào tích trữ vận chuyển và giải phóng auxin.
- Các aminoaxit amit: có vai trị quan trọng trong việc phát sinh hình thái.
- Các thành phần hữu cơ phức tạp: Cazein thủy phân, dịch chiết nấm
men, nước ép hoa quả… cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và
các khoáng chất.


7

Thành phần vơ cơ
Gồm các muối khống, các ngun tố cần phải cung cấp là nitơ,
phospho, kali và sắt.
- Nitơ được đưa vào môi trường ở 2 dạng: nitrat (NO3-) và amon (NH4+) với
hàm lượng nitrat là 25 mM.
- Phospho được đưa vào môi trường ở dạng muối phosphate và 2 loại
muối được sử dụng nhiều nhất là NaH2PO4 và KH2PO4.
- Kali được cung cấp dưới dạng KNO3, KCl và KH2PO4. Hàm lượng
kali trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 2 – 25 mM.
- Sắt là nguyên tố vi lượng được đưa vào môi trường ở dạng muối
FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3..nhưng cây rất khó hấp thụ, phải cho vào mơi trường
Na2EDTA để tạo ra muối phức NaFeEDTA để cây dễ dàng hấp thụ.


Nguồn cacbon
Loại hydratcacbon được sử dụng để đưa vào môi trường nuôi cấy

phổ biến là đường saccarozơ với hàm lượng 6% (W/v). Những loại đường
khác như: fructozơ, glucozơ, maltozơ, lactozơ,..chỉ dùng trong những
trường hợp cá biệt. Hàm lượng đường thấp được sử dụng trong nuôi cấy tế
bào trần, ngược lại các hàm lượng đường cao hơn có thể dùng cho nuôi cấy
hạt phấn, phôi [9].

 Các thành phần khác
-Tác nhân tạo gel: quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy.
Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là agar; Hàm lượng sử dụng của agar 0,5
– 10% (W/v).
- Than hoạt tính: được dụng để hấp thụ các chất màu các hợp chất
phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Than hoạt tính cũng hút các chất
hữu cơ như phytohoocmon, vitamin, sắt chelat, kẽm... Hàm lượng sử dụng

của than hoạt tính là 0,2-0,3 % (W/v).


8
1.3.2. pH của môi trường:
pH của đa số các môi trường nuôi cấy đều được điều chỉnh trong phạm
vi 5,5 – 6. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, cịn pH lớn
hơn 6,0 agar có thể rất cứng. Trong q trình ni cấy, pH của mơi trường có
thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ[11]
1.4. Các chất điều hịa sinh trưởng:
1.4.1. Nhóm Auxin:
Nhóm Auxinđược đưa vào mơi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh
trưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi
chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính
... (Epstein&cs, 1989). Các loại Auxin thường sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α - NAA (α- Naphthaleneacetic acid)
+ 2,4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid)...
IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm
lượng cao 1,0 -3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các Auxin khác có hàm
lượng sử dụng từ 0,1-2,0 mg/l.
1.4.2.Nhóm Cytokinin:
Nhóm Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trưởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự
tạo rễ và sinh trưởng của mơ sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến
sự phát sinh phơi vơ tính của mẫu ni cấy. Các loại Cytokinin thường dùng
trong nuôi cấy mô là:
+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).

+ Kinetin (6-furfurylamino purine).
+ BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).


9
+ 2 - ip (isopentenyi adenine)
Hàm lượng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành
chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại
Cytokinin nói trên, Kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả Auxin và Cytokinin ở
những tỷ lệ khác nhau [9].


10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng: Các cụm protocom lan Sơn thủy tiên (Dendrobium
chrysotoxum) và cây lan Sơn thủy tiên vó chiều cao 2 – 3 cm.

Hình 2.1. Các cụm protocom lan

Hình 2.2. Cây lan Sơn thủy tiên

Sơn thủy tiên

chiều cao 2 – 3 cm

-Phạm vi nghiên cứu: Cây lan Sơn thủy tiên được thực hiện ở giai đoạn

in vitro.
-Địa điểm: Các thí nghiê ̣m đươ ̣c thực hiêṇ ta ̣i Trung tâm nghiên cứu
Công nghệ Sinh ho ̣c, Trường Đa ̣i Ho ̣c Hùng Vương – Tp.Việt Trì – Tỉnh Phú
Tho ̣.
2.2. Nội dung nghiên cứu
-Đánh giá được ảnh hưởng của môi trường nền đối với sự sinh trưởng
chồi của cây in vitro lan Sơn thủy tiên
- Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều
hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân, lá của cây in vitro lan Sơn thủy tiên.
- Đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều
hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Sơn thủy tiên


11
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1 Phương pháp luận
- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu phải chia thành các công thức khác
nhau
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu phải đảm bảo tính đồng
nhất giữa các cơng thức thí nghiệm.
- Số mẫu của mỗi cơng thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥15).
- Phải tuân thủ nguyên tắc lặp lại (số lần lặp lại ≥3)
2.3.2. Phương pháp bố thí nghiệm


Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến sự

sinh trưởng của chồi loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)
+ Vật liệu ban đầu: Các cụm protocom của cây lan Sơn thủy tiên
Môi trường MS

Môi trường KC
Môi trường ½ MS
Mơi trường được bổ sung thêm 30g/l đường; 6,5g agar; 150ml nước dừa;
60g/l khoai tây ở mỗi môi trường....
+ Chỉ tiêu đánh giá: chiề u cao chồ i/chồ i, sớ lá/chờ i, hình thái.
+ Thời gian thu thập: sau 4 tuần nuôi cấy.


Thí nghiêm
̣ 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ về sự phối hợp

của Cytokinin/Auxin đến sự phát triển thân, lá của cây lan Sơn thủy tiên
Cơng thức: Mơi trường phù hợp ở thí nghiệm 1 + Chất điều hòa sinh
trưởng ở các nồng độ khác nhau:


12
Bảng 2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ về sự phối hợp của
Cytokinin/Auxin đến sự phát triển thân, lá của cây lan Sơn thủy tiên
Chất điều hịa sinh trưởng
Cơng thức

BAP

TDZ

NAA

0

0

0

0

1

1

0

0

2

1,5

0

0

3

2

0

0

4

2,5

0

0

5

0

1

0

6

0

1,5

0

7

0

2

0

8

0

2,5

0

9

1

0

0,5

10

1,5

0

0,5

11

2

0

0,5

12

2,5

0

0,5

13

0

1

0,5

14

0

1,5

0,5

15

0

2

0,5

16

0

2,5

0,5

+ Chỉ tiêu đánh giá:
- Chiều dài thân sau 4 tuần
- Chiều dài lá sau 4 tuần
- Số lá/ chồi
+ Thời gian thu thập: sau 4 tuần ni cấy.


Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của Auxin

đến khả năng ra rễ của loài lan Sơn thủy tiên.


13
Cơng thức: Mơi trường phù hợp ở thí nghiệm 1 + Chất điều hòa sinh
trưởng ở các nồng độ khác nhau:
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của Auxin đến khả

năng ra rễ của loài lan Sơn thủy tiên.

Cơng thức

Chất điều hịa sinh trưởng (mg/l)
NAA

BAP

0

0

0

1

0,5

0

2

1

0

3

1,5

0

4

2

0

5

0

0,5

6

0

1

7

0

1,5

8

0

2

9

0,5

0,5

10

1

1

+Chỉ tiêu đánh giá: số rễ, chiều dài rễ
+ Thời gian thu thập: sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.3. Phương pháp thu thập số liê ̣u
- Chỉ tiêu thu thâ ̣p:
+ Số lá/chồ i (lá) = tổng số lá/ chồi
+ Số rễ = tổng số rễ / chồi
+ Chiề u cao thân (mm) = Số chiều dài thân sau 4 tuần
+ Chiều dài lá (mm) = Chiều dài lá sau 4 tuần
+ Chiều dài rễ (mm) = Chiều dài rễ sau 4 tuần
- Thời gian thu thâ ̣p: cứ 4 tuầ n thố ng kê các chỉ tiêu 1 lầ n.


14
2.3.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liê ̣u
Các số liệu được tính tốn theo phương pháp phân tích thống kê tốn

học. Q trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính của chương trình
Excel.


15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi Lan Sơn
thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum)
Để tìm ra mơi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng
chồi tương đối là tốt nhất, trong quá trình nghiên cứu tơi tiến hành thí nghiệm
cấy cụm chồi vào các mơi trường ni cấy khác nhau: MS, KC, 1/2MS. Sau đó
tiến hành đánh giá để xác định được môi trường nền thích hợp nhất cho giai
đoạn nhân nhanh chồi và phát triển thân.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi Lan
Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum)

Công

Chiều cao cây

Chiều dài lá

Tỉ lệ ra

thức

(mm)

(mm)

chồi

Đặc điểm

(%)
Chồi xanh,
MS

31.46 ± 0,12

20.25± 0,34

100

thânmập,
cân đối
Chối xanh

KC

20.08± 0,16

10.28± 0,36

84,55

vàng, nhỏ,
khơngcân
đối
Chồi xanh,

½ MS

23.96± 0,19

14.12 ±0,27

91.53

nhỏ, cân
đối