Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulose từ nấm mốc và ứng dụng trong sản xuất ethanol từ vỏ quả cà phê vối (coffea robusta)

BỘ CƠNG THƯƠNG
ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME
CELLULASE TỪ NẤM MỐC VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
ETHANOL TỪ VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta)
Mã số đề tài: IUH.VSH16/16
Chủ nhiệm đề tài: ĐỖ VIẾT PHƯƠNG
Đơn vị thực hiện: VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2017


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU CÀ PHÊ
1.1.1 Giới thiệu về vỏ cà phê vối
Vỏ cà phê là phế phẩm đầu tiên thu được trong quá trình chế biến cà phê nhân. Vỏ
quả chiếm khoảng 29% trọng lượng chất khơ của tồn bộ quả cà phê.
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của vỏ quả cà phê (% theo chất khơ)
Thành phần hóa học
Nước
Chất khơ
Các chất trích ly trong ether
Xơ thơ
Protein thơ
Tro
Nitrogen-free extract

Caffeine
Tannin
Tổng pectic
Đường khử
Đường khơng khử
Chlorogenic acid
Tổng caffeic acid

(a)
12,6
87,4
2,5
21,0
11,2
8,3
44,4
1,3
1,8 – 8,56
6,5
12,4
2,0
2,6
1,6

(b)

2,3 - 2,5
13,2 - 27
9,2 - 11,2
57,8 – 66,1

0,51 – 1,3
1,44 – 4,5

0,31 – 2,71

(a Braham and Bressani, 1979;
b

Jaffé and Ortiz, 1952; Aguirre, 1966; Bressani et al., 1975)

Bảng 1.2: Thành phần khống có trong vỏ quả cà phê (% theo chất khơ)
Thành phần hóa học

% chất khơ

Tổng khống (g)

8,3

Ca (mg)

554

P (mg)

116

Fe (mg)

15

Na (mg)

100

K (mg)

1765

Mg (mg)

vết

Zn (ppm)

4

Cu (ppm)

5

Mn (ppm)

6,25

B (ppm)

26

(Bressani and Jarquin, 1972)

1


Bảng 1.3: Thành phần carbohydrate có trong vỏ quả cà phê (% theo chất khơ)
Thành phần hóa học

g%

Tổng xơ

63,2

Các chất hịa tan trong NDF

36,8

Các chất hịa tan trong ADF

34,5

Hemicellulose

2,3

Cellulose

17,7

Lignin

17,5

Protein thơ

10,1

Tro không tan

0,4

(Murillo et al., 1977)

1.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê
1.1.2.1 Làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Trong vỏ quả cà phê có một lượng đường tương đối phong phú và nó khá thích
hợp cho sự phát triển của vi sinh vật. Một số cơng trình nghiên cứu về vấn đề này đã
thực hiện ở Colombia để sản xuất nấm men. Cứ 100 kg quả cà phê thì sản xuất được
750 g men khơ (Calle, 1951).
1.1.2.2 Sản xuất dịch đạm
Trong vỏ quả cà phê có hầu như đầy đủ các acid amin thiết yếu. Với phương pháp
trích ly, cơ đặc thơng thường thì lượng đạm nitơ trong dịch chiết chỉ khoảng 42%. Nhưng
nếu có xử lý thêm với cellulase và maceroenzymes thì hiệu quả đạt 71% nitơ. Lý do là
vì trong vỏ cà phê có chứa một lượng cao tannin gây cản trở q trình trích ly các protein,
đồng thời các phenolic có trong vỏ quả cà phê dễ bị oxy hóa tạo thành các quinon và
chính các quinon này dễ dàng tạo liên kết cộng hóa trị với protein. Để nâng cao hiệu quả
trích ly người ta sẽ bổ sung thêm sulfit hoặc polyvinyl pyrrolidone để kết tủa tannin (Dc
La Fuente, 1974).
1.1.2.3 Chiết xuất caffeine
Caffeine có mặt trong vỏ quả cà phê có tác dụng khơng tốt đến hệ thống tiêu hóa
của động vật khi chúng ăn vào cơ thể. Vì thế để tăng giá trị kinh tế người ta đã tiến hành

nghiên cứu chiết xuất caffeine từ vỏ cà phê (Molina and Bressani, 1974; Bressani et al.,
1975).

2


Ủ chua

Ủ thành đống

Thức ăn động vật

Sấy khô

Xay, nghiền

Thức ăn động vật

Ép

Xác vỏ
Vi sinh vật

Sản phẩm
Giàu protein

Nước ép

Thức ăn động vật

Sấy khơ

Vỏ quả
cà phê
Trích ly

Vỏ quả cà phê

Caffeine

Vỏ quả cà phê

Trích ly

Protein

Phân bón + năng lượng (gas)

Lên men
Tự nhiên

Enzyme pectinase
Giấm
Dịch chiết

Khác

Hình 1.1: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ vỏ quả cà phê
(Bressni, 1974; Ruiz, 1974)

Bảng 1.4: Hiệu quả trích ly caffeine từ vỏ quả cà phê
Thành phần hóa học
Alcohol
Water (25 °C)
Water (25 °C) + alcohol
Percolation

% caffeine trích ly
69,53
78,11
84,65
99,06

Tổng chất rắn trích ly
19,10
28,33
35,50
29,01

(Molina and Bressani, 1974; Bressani et al., 1975)

1.1.2.4 Sản xuất phân bón hữu cơ
Vỏ cà phê được đổ đống, rồi được ủ kín sau một thời gian sẽ bị phân hủy tạo ra
phân hữu cơ. Cứ khoảng 45 kg vỏ cà phê đã được ủ thành phân sẽ tương đương với 4,5
kg phân vô cơ 14-3-37 hoặc 9 kg phân vô cơ 7-1,5-18,5. Điều này cho thấy trong phân

3


hữu cơ từ vỏ cà phê có hàm lượng nitơ và kali cao hơn các phân bón thơng thường

(Bressani et al., 1972).
1.1.2.5 Sản xuất một số sản phẩm khác
Sản xuất mật đường: Theo Molina (1974) khi thủy phân vỏ cà phê trong 4 - 6 giờ
bằng HCl 6% ở 1210C (15 psi) thì sản phẩm tạo thành là mật đường. Mật đường này
trộn nếu với thức ăn và cho heo ăn thì nhận thấy rằng khả năng sử dụng mật đường từ
vỏ cà phê là tương đương với mật đường mía (Buitrago et al., 1968; Molina and
Bressani, 1974).
Ngồi ra vỏ cà phê cịn được sử dụng để sản xuất khí sinh học. Cứ 30 kg vỏ cà phê
trộn với phân bị sẽ sản xuất được 670 lít metan trong 72 ngày ủ (Calle, 1955).
1.1.3 Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và phenolic có trong vỏ quả cà
phê
1.1.3.1 Khả năng kháng khuẩn của caffeine
Caffeine gây độc cho hạt giống nảy mầm, vi sinh vật và các sinh vật biển, là chất
độc đối với vi khuẩn. Caffeine ở nồng độ trên 0,0025 g/mL ức chế sự phát triển của
nhiều loài vi khuẩn trong môi trường phát triển. Một vài nghiên cứu đã cho thấy tác
dụng gây đột biến của caffeine qua sự ức chế sửa chữa ADN ở vi khuẩn. Caffeine ở
nồng độ 0,1% có khả năng làm ức chế tổng hợp protein ở vi khuẩn và nấm men và hoàn
toàn bị ức chế bởi 1% caffeine (Ramanavičienė et al., 2003).
Ở nồng độ thấp khoảng 10-2 M caffeine ức chế phosphodiesterase gây sự ức chế
hoặc trì hỗn trong phân chia tế bào. Đối với nấm men, lượng caffeine > 10 mM gây
đột biến. Ở nồng độ thấp, có khả năng kháng khuẩn nên nó vẫn có thể sinh trưởng và
phát triển như E. coli và các chủng vi khuẩn khác. Caffeine cũng ảnh hưởng đến quá
trình lên men lactose và sự tổng hợp của indol do E.coli (Ibrahim et al., 2014).
Trong nghiên cứu về tác động của caffeine trên nấm sợi, cả loài Trichoderma và
các mầm bệnh, cho thấy rằng caffeine thể hiện chức năng kép: ức chế quá trình nấm
mọc và phát triển (Sugiyama et al., 2016).
Trong cà phê caffeine là thành phần có khả năng kháng khuẩn. Một báo cáo cho
thấy rằng caffeine tinh khiết có tác dụng kháng khuẩn trực tiếp. Hơn nữa, caffeine là
chất chống dính và có khả năng phịng chống sâu răng vì nó có thể làm giảm độ bám
dính của vi khuẩn Streptococcus đột biến vào bề mặt răng (Rahman et al., 2014).

Aspergillus niger và Aspergillus carbonarius bị ức chế bởi caffeine với nồng độ
<1% caffeine. Đối với các chủng Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus ochraceus và
Aspergillus steynii, mặc dù bị ức chế tăng trưởng nhưng một số vẫn có thể phát triển ở
4% caffeine (Akbar et al., 2016).

4


1.1.3.2 Khả năng kháng khuẩn của phenolic
Một số phenolic như furanocoumarins không gây ngộ độc nhưng khi tiếp xúc với
nhiệt độ cao, dưới ánh sáng có bước sóng gần với tia tử ngoại thì nó trở nên rất độc hại.
Ngồi ra, nó có thể gắn với DNA ở vị trí gốc kiềm pirimidine làm ức chế khả năng tự
sao chép và cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào hoặc biến đổi gen.
Phenolic cịn có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật thông qua tác dụng
bịt kín các trung tâm hoạt động của enzyme.
(Dương Thanh Liêm, 2012. Những chất độc hại trong cây thực phẩm và cây thức ăn gia súc.
truy cập ngày:
15/6/2016).

Khả năng kháng khuẩn của các hợp chất phenolic tinh khiết đại diện là flavonoid
và các acid phenolic được đo để chống lại các loại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn
Gram âm, bao gồm cả vi khuẩn probiotic và các tác nhân gây bệnh đường ruột
Salmonela. Các hợp chất phenolic có thể được sử dụng như tác nhân kháng khuẩn, cụ
thể là chống lại một số vi khuẩn đề kháng với kháng sinh. Chúng có khả năng ức chế sự
phát triển của nấm sợi có thể có mặt trong các loại rau trái không bị hư hỏng hoặc các
mô quả bị nhiễm mầm bệnh (Latté and Kolodziej, 2000).
Các phenolic là chất thứ sinh được nghiên cứu sâu rộng và phổ biến nhất vì chúng
có tiềm năng kháng khuẩn rất lớn. Đại diện điển hình là quinon. Khả năng kháng vi sinh
vật của hợp chất tự nhiên này đã được nghiên cứu và chứng minh. Nó tác động lên vi
sinh vật dựa cơ chế tác động lên bề mặt tế bào, phá hủy lớp vỏ peptidoglycol hoặc phá

hủy hệ thống enzyme màng và làm vi sinh vật chết. Các hydrophenolic và các phenolic
loại hydroxylcianic như caffeic acid, ferulic acid, coumaric acid,…có khả năng ức chế
sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonela typhi, Bacillus
subtilis, E.coli,… Các phenolic như tannin có thể ức chế một số liên cầu khuẩn như
Streptococcus, Listeria monocytogenens,… Các hydroxylatephenol không ức chế mà
gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn.
Phenolic có khả năng ức chế các loại nấm như Aspergillus parasiticus. Trong thí
nghiệm nuôi cấy Aspergillus parasiticus cho thấy khi nồng độ tannin được tăng lên đến
7,5%, ức chế sự phát triển của nấm đến 88%, và khi tăng nồng độ tannin lên 20% ức chế
96% sự phát triển của Aspergillus parasiticus (Sanders and Mixon, 1979).
Tannin là một hợp chất của phenolic và tannin có khả năng kháng nấm sợi như:
Epidermophyton floccosum; Microsporum canis; Microsporum gypseum; Trichophyton
mentagrophytes, Trichophyton rubrum; tonsurans Trichophyton; Trichophyton Terrestre;
Penicillium italicum; Aspergillus fumigatus; Mucor racemosus; Rhizopus nigricans và
kháng nấm men như: Candida albicans, Candida glabrata; Candidata krusei;
Cryptococcus neoformans.

5


Tannin có thể gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn. Tannin có thể tạo ra
chất nền khơng thể sử dụng được cho các vi sinh vật. Có khả năng kìm hãm vi khuẩn
Bacillus anthracis, corynebacterium pseudomalliae.
1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME CELLULASE
Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng xúc tác cho quá trình thủy phân cơ chất
cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose. Enzyme
cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới. Đây là enzyme có ứng dụng rất
rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase. Enzyme cellulase có thể được thu nhận từ
vi khuẩn, nấm mốc, protozoan và một số động, thực vật. Enzyme cellulase thu nhận từ
các nguồn khác nhau sẽ có thành phần khác nhau (Gincy et al., 2008; Zhang et al.,

2006).
Để thủy phân hoàn toàn cellulose thành glucose phải nhờ sự phối hợp xúc tác của
một phức hệ cellulase từ vi sinh vật. Cần có 3 kiểu enzyme tham gia vào phức hệ này:
endo-β-1,4-glucanases, exo-β-1,4-glucanases và β-glucosidases (hình 1.2), trong đó:
- Endo-β-1,4-glucanases (EC.3.2.1.4): Enzyme này cịn có tên gọi khác:
Endoglucanase, β-1,4-endoglucane hydrolase (EG), Cx, CMCase, β-1,4-glucanase,
pancellase SS, elludextrinase, cellulase A alkali cellulase. Enzyme này xúc tác phân cắt
nội mạch vùng vơ định hình của cellulose, tạo các mạch nhỏ, có khả năng cho phép gắn
nhiều đơn vị đường trên một trung tâm xúc tác (Kirk and Cullen, 1998).
- Exo-β-1,4-glucanases (EC.3.2.1.91): Enzyme này cịn có tên gọi khác: β-1,4exoglucane hydrolase, cellobiohydrolase (CBH), exo-cellobiohydrolase, exo-βlucancellobiohydrolase, cellulase C1, CBH I, β -1,4-glucan cellobiosidase, … Enzyme
này xúc tác phân cắt liên tiêp các đơn vị đường từ đầu không khử, hoặc đầu khử. Người
ta phân biệt các cellulase của T. reesei gồm có các CBH I có khả năng phân cắt glucose
từ đầu khử, trong khi CBH II có khả năng phân cắt liên kết từ đầu không khử của
cellulose (Barr et al., 1996). Các CBH có khả năng phân cắt đồng thời cả cellulose ở
dạng vơ định hình và dạng kết tinh. Khác với endoglucanase, các exoglucanase có dạng
hình ống, cho phép chúng thủy phân chuỗi cellulose một cách liên tục (Kirk and Cullen,
1998).
- β-glucosidase (EC.3.2.1.21): Enzyme này cịn có các tên gọi khác như: β-1,4cellobiase, cellobiase, β-D-glucosidase, β-1,6-glucosidase, p-nitrophenyl, βglucosidase, salicilinase, … Enzyme này thủy phân cellobiose và các cellooligosaccharide mạch ngắn tạo thành glucose nhưng chúng không tấn công cellulose
hoặc các cellodextrin khác (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004).
Ba enzyme này xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn nhau
của quá trình thủy phân cellulose đến glucose (Kinghorn, 1992).

6


Hình 1.2: Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulase
1.2.1 Cấu trúc và tính chất enzyme cellulase
Cellulase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau.
Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử, thành phần và
trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Chủng A. oryzae KBN616

sinh tổng hợp hai loại endoglucanase là CelA và CelB. Phân tử protein CelA gồm 239
amino acid, khối lượng phân tử 31 kDa, được xếp vào họ cellulase H. Trong khi đó,
CelB được xếp vào họ cellulase C gồm 416 amino acid và khối lượng phân tử 53 kDa
(Kitamoto et al., 1996). Endoglucanase từ A. aculeatus bao gồm 410 amino acid với
khối lượng phân tử 43,7 kDa (Takada et al., 2002). Các endoglucanase từ A. niger Z10
có khối lượng phân tử 83 kDa và 50 kDa (Coral et al., 2002), từ A. terreus là 25 kDa
(Gao et al., 2008), từ T. reesei là 48 kDa và 55 kDa (Karisson et al., 2001; Macarrón et
al., 1993), từ Bacillus sp. D04 có khối lượng 35 kDa (Sang et al., 1995). Endoglucanase
từ A. niger là EglC có kích thước 50,9 kDa gồm 858 amino acid (Alinda et al., 2002),
từ A. aculeatus là 45 kDa (Naika et al., 2007).

7


A: endoglucanase của A.
niger (Khademi et al., 2002)

B: β-glucosidase của
Trichoderma reesei (Jenga
et al., 2001)

C: Exoglucanase của
Cellulomonas fimi (White et
al., 1994)

Hình 1.3: Hình ảnh cấu trúc phân tử của một số cellulase
Sandgren và cộng sự (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A
thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm sợi chịu nhiệt Humicola grisea. Cel12A của
H. grisea là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên các chuỗi α, β và
các vùng nối. Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong

không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất.
Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc khơng gian của các enzyme dẫn tới sự khác nhau
về các tính chất hóa lý của chúng. Phân tử Cel12A của H. grisea cấu tạo bởi 1 chuỗi α,
2 chuỗi β (A và B). Chuỗi β-A được cấu tạo bởi 6 dải xoắn β (A1-A6), chuỗi β-B được
cấu tạo bởi 9 dải xoắn β (B1-B9). Các dải xoắn β được nối với nhau bởi các vùng nối,
có 4 vùng nối lớn 29-32, 40-47, 92-96, và 165-169 nối tương ứng các dải xoắn β: B2A2, A2-A3, A5-B5 và A6-B7 (Sandgren et al., 2003).
* Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất
Trung tâm xúc tác của Cel12A từ H. grisea gồm 2 amino acid glutamic E-120 và
E-205, còn ở Cel12A từ T. reesei là E-116 và E-200 (Sandgren et al., 2003).

Hình 1.4: Hình ảnh mơ hình cấu trúc không gian (A) và trung tâm xúc tác (B) của
Cel12A từ H. grisea
(Sandgren et al., 2003)

8


Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân cellulose của các cellulase
được thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu cellulose binding domain (CBD). Các
CBD có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc không. Tùy thuộc vào
từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo hóa học và cấu trúc khơng gian khác
nhau. Cel12A từ H. grisea có 3 vùng liên kết với sự tham gia của các amino acid, trong
đó cysteine (C175, C206, C216) đóng vai trị trung tâm. CBD1 với C175 làm trung tâm
nằm trên dải xoắn β-A6 liên kết yếu với các amino acid T85, I123, A144, F173, I177 và
F180 bằng tương tác Van Der Walls. Liên kết giữa các amino acid trong CBD1 có kích
thước 3,5 đến 4,1 Å. CBD2 với C206 làm trung tâm nằm trên dải xoắn β-B4 liên kết với
các amino acid Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204. Liên kết giữa các amino
acid trong CBD2 có kích thước 3,3 đến 4,9 Å và CBD2 chứa trung tâm hoạt động (Glu
205). CBD3 với C216 làm trung tâm nằm trên dải xoắn β-A4 liên kết với các amino acid
W48, V87, W89, F214 và F219. Liên kết giữa các amino acid trong CBD3 có kích thước

3,3 đến 4,8 Å (Sandgren et al., 2003).

Hình 1.5: Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea
A: CBD 1; B: CBD 2; C: CBD 3
(Sandgren et al., 2003)

1.2.2 Cơ chế xúc tác của cellulase
Khi nghiên cứu cơ chế thủy phân cellulose, nhiều tác giả đã trình bày cơ chế tác
động của cellulase theo các cách khác nhau. Reese (1950) là người đầu tiên đề xuất cơ
chế thủy phân cellulose hòa tan bởi enzyme C1 và Cx. Theo Reese thì C1 là yếu tố tiền
thủy phân, nó chỉ có tác dụng làm trương nở cellulose tự nhiên tạo thành cellulose hoạt
động có mạch ngắn hơn. Sau đó, Cx sẽ tiếp tục phân cắt các chuỗi này tạo thành các
đường tan và cuối cùng tạo thành glucose (Reese et al., 1950). Eriksen và Goksoyr
(1977) đã đưa ra cơ chế tác dụng phối hợp của endoglucanase; exoglucanase và βglucosidase. Đầu tiên, những vùng có mức độ kết tinh thấp trong sợi cellulose bị các
endoglucanase tấn công tạo các đầu tự do. Tiếp đó, exoglucanase sẽ bắt đầu phân cắt từ
9


các đầu tự do để tạo thành các cellobiose; cellooligosaccharide và glucose. βGlucosidase sẽ thủy phân tiếp và cuối cùng tạo thành glucose (Eriksen and Goksoyr,
1977).
Theo nghiên cứu của Martin (2000), cellulase là phức hệ gồm hai nhóm enzyme là
endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) thủy phân liên kết β1,4-O-glycoside trong phân tử cellulose theo hai cơ chế đảo ngược và giữ lại (Martin,
2000).

Hình 1.6: Hai cơ chế xúc tác của phức hệ cellulase
(Martin, 2000)

Năm 2002, Lee và cộng sự đã đưa ra cơ chế phản ứng của phức hệ cellulase. Mỗi
dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chất theo một cơ
chế riêng. Tuy nhiên, những enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn

toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose. Endoglucanase tham gia
thủy phân các liên kết β-1,4-glycoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số loại
polysaccharide tương tự khác. Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase
thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các
10


oligosaccharide, cellobiose và glucose. β-Glucosidase thủy phân các phân tử
cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose (Lee et al., 2002).

Hình 1.7: Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B)
(Lee et al., 2002)

1.2.3 Tính chất của cellulase
Giá trị Km và Vmax đặc trưng cho tính đặc hiệu của một enzyme với một cơ chất,
Km bé thì ái lực của enzyme với cơ chất lớn và ngược lại. Km của β-glucanase từ S.
sclerotorium (8,7 mg/ml) [169], Km của β-glucanase từ A. niger (52-80 mg/ml) (Hurst
et al., 1977), Km của β-glucanase từ M. verrucaria (0,5 mg/ml) (Halliwell, 1965) và từ
A. awamori VTCC-F099 (5,83 mg/ml) (Nguyen and Quyen, 2010). Vmax của βglucanase tinh sạch từ A. terreus AN1 là 200 U/mg protein (Nazir et al., 2009) và từ A.
awamori VTCC-F099 (333,33 U/mg) (Nguyen and Quyen, 2010), từ A. terreus DSM
826 là 4,35 U/mg protein khi sử dụng cơ chất CMC (Elshafei et al., 2009). Nhiệt độ và
pH phản ứng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác của enzyme, mỗi enzyme có
một nhiệt độ và pH phản ứng thích hợp. Trong giới hạn nhiệt độ chưa làm biến tính
enzyme, hoạt tính enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá giới
hạn thì hoạt tính của enzyme lại giảm. Ngun nhân có thể do khi nhiệt độ tăng cao đã
làm đứt gãy một số liên kết yếu trong phân tử protein enzyme, làm thay đổi cấu trúc của
phân tử này, đặc biệt là cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme, từ đó ảnh hưởng tới
hoạt tính xúc tác của enzyme (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006).
Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của β-glucanase từ A. niger VTCC-F021 là
55 C và pH = 5. Hầu hết các β-glucanase từ các chủng Aspergillus từ nhiều nghiên cứu

trước cũng có nhiệt độ tối ưu (50-700C) và pH tối ưu (3,5-5). Nhiệt độ và pH tối ưu của
β-glucanase từ A. terreus DSM 826 (Elshafei et al., 2009) và A. awamori VTCC-F099
(Nguyen and Quyen, 2010) là 500C và pH = 4,8-5, từ A. oryzae VTCC-F045 là 550C
0

11


và pH = 5,5 (Nguyen and Quyen, 2010), cellulase từ A. niger NRRL-363 là 500C và pH
= 5,5 (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003).
Các β-glucanase từ A. niger IFO31125 là 700C và pH = 6-7 (Akiba et al., 1995),
từ A. terreus M11 là 600C và pH = 2 (Gao et al., 2008), từ A. terreus AN1 là 600C và
pH = 4 (Nazir et al., 2009), từ A. niger Z10 lại hoạt động tốt ở nhiệt độ 400C và pH =
4,5-7,5 (Coral et al., 2002). Endoglucanase từ A. niger VTCC-F021 bền ở dưới 500C và
pH từ 5-6. Độ bền nhiệt và pH của endoglucanase từ A. niger VTCC-F021 cũng giống
với endoglucanase từ A. awamori VTCC-F099 và A. oryzae VTCC-F045. Theo Nguyen
và Quyen, endoglucanase từ A. awamori VTCC-F099 bền ở dưới 400C và dải pH từ 4,55,5, hoạt tính cịn hơn 80% sau 36 giờ ủ ở 30-400C và pH = 4,5-5,5 (Nguyen and Quyen,
2010), endoglucanase từ A. oryzae VTCC-F045 bền ở dưới 550C và pH = 5-6, hoạt tính
tăng từ 21-27% sau 4 giờ ủ ở 30-550C và còn 72% sau 1 giờ ủ ở pH = 5-6 (Nguyen and
Quyen, 2010). Theo Elshafei và cộng sự (2009) endoglucanase tinh sạch từ A. terreus
DSM 826 vẫn giữ nguyên hoạt tính khi ủ ở 500C trong 1 giờ, nhưng chỉ còn 56% hoạt
tính khi ủ ở 800C trong 5 phút (Elshafei et al., 2009), endoglucanase (celA) từ chủng A.
oryzae KBN616 bền ở dưới 550C sau 20 giờ ủ và mất hoạt tính ở trên 600C và CelB thì
bền ở dưới 500C và mất hoạt tính ở trên 550C và cả CelA và CelB đều bền ở pH = 3-7
(Kitamoto et al., 1996). Các endoglucanase từ A. terreus M11 bền ở pH = 2-5 và cịn
hơn 60% hoạt tính khi ủ 1 giờ ở 700C (Gao et al., 2008), từ A. terreus AN1 bền ở 500C
và pH = 3-5 (Nazir et al., 2009). Theo Akiba và cộng sự (1995) endoglucanase từ A.
niger IFO31125 lại bền ở dải pH cao hơn (5-10) và không làm mất hoạt tính enzyme
sau 2 giờ ủ ở 600C (Akiba et al., 1995). Các ion kim loại đóng vai trị quan trọng trong
việc định hình cấu trúc khơng gian của phân tử enzyme hoặc trong một vài trường hợp

nó là nhân tố cần thiết trong trung tâm hoạt động của enzyme. Do đó ion kim loại có
ảnh hưởng lớn tới khả năng hoạt động của enzyme.
Các ion kim loại Cu2+, Fe2+ và EDTA làm tăng hoạt tính β-glucanase A từ A.
niger VTCC-F021 lên 12-52%, trong khi các ion Mn2+, Zn2+ và Ni2+ lại làm giảm
mạnh hoạt tính endoglucanase ở ngay nồng độ thấp, còn các ion K+, Ca2+, Co2+ và
Ag+ làm giảm 18-54% hoạt tính ở nồng độ 15 mM (Pham et al., 2012). Nghiên cứu của
Nguyen và cộng sự (2010) cho thấy, các ion Fe2+, Cu2+ và EDTA làm tăng hoạt tính
endoglucanase từ A. awamori VTCC-F099 lên tới 55%, còn các ion Ag+, Ca2+, Co2+,
Mn2+, Ni2+, Zn2+ lại làm giảm hoạt tính enzyme (Nguyen and Quyen, 2010). Trong
khi đó, các ion kim loại và EDTA đều làm ức chế mạnh hoạt tính của endoglucanase từ
A. oryzae VTCC-F045 (Nguyen and Quyen, 2010). Chen và cộng sự (2001) cho thấy
Fe2+ kích thích hoạt tính của cả 5 loại CMCase (EG II-1, EG II-2, EG III-1, EG III-2
và EG IV) từ A. aculeatus SM-L22 (Chen et al., 2001). Hoạt tính endoglucanase từ A.
terreus DSM 826 tăng 83% và 25% khi ủ với Co2+ 25 mM và Zn2+ 50 mM, nhưng
Hg2+ lại làm giảm 50-71% hoạt tính khi ủ với Hg2+ 25 và 50 mM (Elshafei et al.,
2009). Cu2+ và Hg2+ ở nồng độ 2 mM ức chế hoạt tính endoglucanase từ A. terreus
M11 từ 59-77% (Gao et al., 2008). Hoạt tính của β-glucanase từ A. niger IFO31125 bị
12


ức chế bởi Hg2+ và Cu2+, nhưng lại không bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế khác như
p-chloromercuribenzoate và N-ethylmaleimide (Akiba et al., 1995). Như vậy, Fe2+ hoạt
hóa các β-glucanase từ A. niger VTCC-F021, A. awamori VTCC-F099, A. aculeatus
SM-L22. Cịn Cu2+ có ảnh hưởng hỗn hợp lên endoglucanase, hoạt hóa endoglucanase
từ A. niger VTCC-F021, A. awamori VTCC-F099 (Nguyen and Quyen, 2010), nhưng
lại ức chế endoglucanase từ A. terreus M11 (Gao et al., 2008), A. niger IFO31125
(Akiba et al., 1995), A. oryzae VTCC-F045 (Nguyen and Quyen, 2010). Các dung môi
hữu cơ và chất tẩy rửa thường sử dụng để biến tính protein và hịa tan các cơ chất kị
nước trong phản ứng của enzyme. Endoglucanase có khả năng kháng cao với methanol
và ethanol ở 10-20% (v/v) và giữ lại được hơn 86% (7,15-7,81 U/mg) hoạt tính so với

đối chứng. Các nghiên cứu của Nguyen và Quyen (2010) cũng cho thấy các
endoglucanase từ A. awamori VTCC-F099 và A. oryzae VTCC-F045 đều kháng cao với
các dung môi hữu cơ isopropanol, acetone, methanol và butanol và giữ được hơn 80%
so với đối chứng (Nguyen and Quyen, 2010).
Endo-β-1,4-glucanase từ A. niger VTCC-F021 có sức kháng cao với Tween 20 và
Tween 80 ở 0,5-2% (v/v) và giữ được hơn 80% hoạt tính so với đối chứng. Kết quả này
cũng giống với nghiên cứu của các tác giả trước. Các endoglucanase từ A. awamori
VTCC-F099 có sức kháng cao với Tween 20, Tween 80 và Triton X-100 ở nồng độ 1020% (v/v) và từ A. oryzae VTCC-F045 kháng cao với Tween 20 ở 0,4-0,8% (v/v)
(Nguyen and Quyen, 2010).
1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP
CELLULASE
1.3.1 Aspergillus niger
Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi trên
các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng địa lý khác
nhau trên thế giới. Hiện nay, A. niger được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp sản xuất
enzyme (điển hình như α - amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), trong
công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid
citric, acid gluconic,…(Panesar et al., 2010). Nấm mốc là vi sinh vật có thay đổi đáng
kể trong lịch sử phân loại. Các nghiên cứu khởi đầu đã phân chia nấm thuộc ngành
Thallophyta thuộc giới phụ Cryptogamae, giới Plantae (thực vật). Các khảo sát về đặc
tính cấu trúc dưới kính hiển vi tiếp theo đã chứng minh nấm không thuộc thực vật lẫn
động vật. Samson và Van Reenen-Hoekstra (1988) đã phân chia nấm thật thành 4 lớp:
Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes. Hệ thống phân loại
này đã tồn tại một thời gian dài và A. niger được phân loại thuộc giới nấm (Fungi),
ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina, lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ
Moniliaceae, chi Aspergillus và loài Aspergillus niger (Samson and van ReenenHoekstra, 1988).
13


Tuy nhiên, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu ở thập niên 70 của

thế kỷ XX, bắt đầu từ nghiên cứu phân chia nhóm của Whittaker (1969, trích dẫn bởi
Sumbali, 2005), đến giới (Alexopolous và Mims, 1979; trích dẫn bởi Sumbali, 2005) đã
đề nghị khóa phân loại mới cho giới nấm nói chung và A. niger nói riêng thuộc:
Ngành: Amastigomycota
Ngành phụ: Ascomycotina
Lớp: Ascomycetes
Lớp phụ: Plectomycetidae
Bộ: Eurotiales
Họ: Eurotiaceae
Giống: Aspergillus
Lồi: Aspergillus niger
Với đặc điểm chính trong họ Eurotiaceae là bào tử đính ở dạng thể bình (Cao Ngọc
Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010).
Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger
Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại:
- Khuẩn ty dinh dưỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thước nhỏ, màu
trắng. Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trường nuôi cấy để
hút dưỡng chất. Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng.
- Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong khơng khí, có kích thước lớn hơn
khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt. Khuẩn ty sinh sản hướng vào khơng khí để
lấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già.
Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dưỡng tạo thành
các hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng. Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản hình thành
các bào tử đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen (Klich, 2002).
Cấu tạo ơ quan sinh sản
Aspergillus niger là loại nấm khơng có giai đoạn sinh sản hữu tính, A. niger sinh
sản vơ tính chủ yếu bằng bào tử đính (Gams, 1985).

14

Hình 1.8: Hình thái Aspergillus sp.
(a) khối bào tử đính, (b) bào tử đính, ( c) tế bào gốc , (d) cuống thể bình và thể bình
(Onion et al., 1981)

Cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc, gồm các phần: bào tử đính phát triển từ
một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi
là tế bào gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo dài với phần đỉnh
phồng to tạo thành túi hình cầu, không màu cho đến vàng nhạt. Xung quanh bề mặt túi
là các cuống thể bình màu nâu, dài 10 ÷ 15 µm, là nơi sinh ra các thể bình. Thể bình có
một tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể
bình thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử
non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già). Bào tử ớnh hỡnh cu, thng dt,
ng kớnh 4 ữ 5 àm, nhưng thường nhỏ hơn (Onions et al., 1981). Loài A. niger được
phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử đính màu đen.
1.3.2 Trichoderma
Trichoderma phân bố rộng rãi trong đất, bã xác thực vật. Theo Nguyễn Lân Dũng
(1979) T. viride được phân loại như sau:
Lớp: Deuteromycetes
Bộ: Moniliales
Họ:Moniliaceae
Giống: Trichoderma
Theo Persoon and Gray (1801), thì Trichoderma:
Ngành: Ascomycota
Lớp: Euascomycetes
15


Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae

Giống: Trichoderma

Hình 1.9 Nấm Trichoderma viride
(Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Đặc điểm hình thái
Sợi nấm có màu trắng, sau đó có màu xanh do bào tử được hình thành. Cuống
sinh bào tử phân nhiều nhánh, sinh ra các thể bình hình tam giác. Mỗi nhánh kết thúc
bởi một thể bình. Bào tử đính có hình cầu, đường kính 3,6 – 4,5 µm , có vách xù xì.
(Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2003).
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
T. reesei sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 00C, tối ưu ở 20-280C, tối đa 30-370C. Sự
tăng trưởng của nấm sợi sinh sắc tố vàng cam trên mơi trường PDA.
Tính ưu việt của phức hệ cellulase từ T. reesei là hoạt động rất mạnh và có khả
năng phân giải hồn tồn cellulose tự nhiên. Tuy nhiên, cellulase thu được từ T. reesei
có hoạt tính β – glucosidase thấp, do đó cellobiose sinh ra không được thủy phân tiếp
thành glucose sẽ quay trở lại ức chế endoglucanase vốn có hoạt tính cao ở T. reesei.
Nhiệt độ thích hợp cho hệ phức hệ cellulase của T. reesei là 400C và pH thích hợp từ 37 (Samuels et al., 2004).

16


1.4 GIỚI THIỆU VỀ ETHANOL SINH HỌC
Ethanol sinh học được sản xuất từ nhiều nguồn vật liệu khác nhau như: rỉ đường,
tinh bột, sinh khối lignocellulose (rơm rạ, gỗ, giấy) và mới đây nhất người ta có thể sản
xuất ethanol sinh học từ tảo biển hoặc sinh khối vi sinh vật (Kumar et al., 2009; Zhu
and Pan, 2010).
Bảng 1.5: Khả năng sản xuất ethanol từ một vài loại lignocellulose
Chất thải lignocellulose

Sản xuất 1 năm

Chất thải nông nghiệp thế giới

Khả năng sản xuất
ethanol (triệu kL/năm)
Triệu tấn/năm

Corn stover

203,62

58,6

Rơm rạ lúa mạch

58,45

18,1

Rơm rạ yến mạch

10,62

2,78

Rơm rạ lúa gạo

731,34

204,6

Rơm rạ lúa mì

354,35

103,8

10,32

2,79

180,73

51,3

1549,42

442

Rơm rạ sorghum
Bã mía
Tổng
Chất thải rắn đơ thị

triệu tấn/năm

Mỹ (2001)

208

13,7

Trung Quốc (1998)

127

8,3

Canada (2002)

30,5

2

(Corn stover bao gồm lá, thân, lõi bắp)
(Dashtban et al., 2009)

Ethanol sinh học có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn nhiên liệu hiện tại và
được đánh giá là một nguồn nhiên liệu sạch đầy tiềm năng của tương lai. Ethanol sinh
học là nguồn nhiên liệu có khả năng tái sinh vì ethanol sinh học được tạo ra từ nguồn
gốc thực vật nên CO2 sinh ra khi đốt được cây cối hấp thụ lại tạo nên sự cân bằng về
lượng CO2, do đó khơng gây hiệu ứng nhà kính. Nhiên liệu ethanol pha trộn cho thấy
giảm 35 – 46% khí nhà kính (Wyman and Charles, 1996).
Ethanol sinh học là nhiên liệu sinh học được sử dụng rộng rãi nhất. Các nhà sản
xuất lớn trên thế giới là Hoa Kỳ, Brazil và Trung Quốc. Sản xuất ethanol từ mía ở Brazil
(2004) ước tính đạt 18% nhu cầu nhiên liệu ơ tơ cho nước này (Petrova and Ivanova,
2010). Ở Brazil, các phương tiện được thiết kế để có thể sử dụng được ethanol. Với kết
quả này Brazil có thể tự chủ về nguồn năng lượng dầu.
Sản xuất ethanol trên toàn thế giới đạt 32x109 lít (2007), với Hoa Kỳ và Brazil là

những nhà sản xuất chủ lực (gần 70%). Gần đây Hoa Kỳ đã qua mặt Brazil để trở thành
nhà sản xuất ethanol lớn nhất thế giới. Năm 2009, Hoa Kỳ đã sản xuất 39,5x109 lít
17


ethanol sử dụng bắp làm nguyên liệu (ethanol thế hệ thứ nhất) trong khi nhà sản xuất
thứ 2, Brazil chỉ sản xuất 30x109 lít ethanol từ mía (Petrova and Ivanova, 2010).
Châu Âu là nhà sản xuất diesel sinh học quan trọng nhất trên thế giới (58% diesel
sinh học thế giới). Đức, Pháp, Hoa Kỳ, Ý đi đầu trong sản xuất diesel sinh học. Hiện
nay, xu thế các nước đang dần thay thế nhiên liệu truyền thống sang sử dụng nhiên liệu
sinh học do nguồn nhiên liệu truyền thống đang cạn kiệt dần, ngày một đắt đỏ và vì cam
kết cắt giảm khí thải nhà kính theo nghị định Kyoto.
Bảng 1.6: Các dạng ethanol sinh học được sử dụng phổ biến
Nồng độ ethanol (v/v)

Nhiên liệu
Hydrous ethanol (Álcool ở Brazil)

95,5%

E85 (Bắc Mỹ, Thụy Điển)

85

Gasoline (Brazil)

24

E10 (gasohol, Bắc Mỹ, Canada, Thụy Điển)

10

ETBE (Pháp, Tây Ban Nha)

7,6

Oxygenated fuel (USA, Canada)

5,7

Biodiesel

15

(Varga, 2003)

1.4.1 Ethanol sinh học thế hệ thứ nhất
Thệ thứ nhất đã được sử dụng từ rất lâu. tạo ra từ các nguồn nguyên liệu
carbohydrate như: gạo, ngô, lúa mạch, lúa mỳ, củ cải đường...; các loại hạt có dầu như
dầu cọ, đậu tương, dầu hạt cải... hoặc từ mỡ động vật.
Nguồn nguyên liệu sản
xuất ethanol

Nguyên liệu giàu đường

Củ cải đường

Nguyên liệu giàu tinh bột

Cỏ ngọt

Cây mía
Cây bo bo

Bắp
Lúa mì
Lúa mạch

Củ sắn
Củ mì
Khoai tây

Hình 1.10: Một số nguyên liệu sản xuất ethanol thế hệ thứ nhất
(Pasha and Rao, 2009)

18


1.4.2 Ethanol sinh học thế hệ thứ hai
Nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học từ thế hệ thứ hai là nguồn lignocellulose.
Có 2 nguồn lignocellulose được sử dụng đó là:
Từ phế thải nông nghiệp: rơm rạ; phế thải từ cây ngơ; phê thải ngành cơng nghiệp
giấy, gỗ; bã mía, …
Từ lâm nghiệp: các loại gỗ, vỏ cây, các loại cỏ.
Bảng 1.7: Trữ lượng ethanol được sản xuất từ nguồn sinh khối lignocellulose
Nguồn
lignocellulose
Thân cây ngơ
Rơm lúa mì
Bã mía
Chất thải rắn

Khu vực sản xuất
Asia, Europe, America
Asia, Australia, America,
Europe
Asia, America
Worldwide (173 quốc gia)

Sản lượng
(triệu tấn/năm)
409,5
702,9

Trữ lượng
ethanol (lít/tấn)
274,4
257,4

564,4
500-1500

314,2
170-486

(Shi et al., 2009)

1.4.3 Ethanol sinh học thế hệ thứ ba
Có thể nói nguyên liệu từ tảo - chính là ethanol sinh học thế hệ thứ ba.
Việc dùng tảo để sản xuất nhiên liệu sinh học thay thế dầu mỏ giống như một mũi
tên bắn trúng hai đích: vừa tạo ra năng lượng vừa góp phần làm sạch môi trường. Mỗi

tế bào tảo là một nhà máy sinh học nhỏ, sử dụng quá trình quang hợp để chuyển hóa
CO2 và ánh sáng mặt trời thành năng lượng dự trữ trong tế bào và tạo ra các sản phẩm
thứ cấp có giá trị cao. Hoạt động chuyển đổi của chúng hiệu quả đến mức sinh khối có
thể tăng gấp nhiều lần trong một ngày. Ngoài ra, trong quá trình quang hợp, tảo cịn sản
xuất ra dầu ngay trong tế bào của chúng. Trên cùng một đơn vị diện tích, lượng dầu mà
tảo tạo ra nhiều gấp 30 lần lượng dầu từ đậu nành. Đồng thời tảo có thể tăng khả năng
sản xuất dầu bằng cách bổ sung khí CO2 trong q trình ni trồng chúng hoặc sử dụng
các môi trường giàu chất hữu cơ (như nước thải) để nuôi trồng. Điều này vừa tạo ra
NLSH, vừa làm giảm lượng CO2 cũng như làm sạch mơi trường
(Bùi Đình Lãm, 2014. Nhiên liệu sinh học, hiện trạng và xu thế phát triển.
truy cập 08/12/2015).

1.4.4 Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới
Ethanol nhiên liệu là cồn tuyệt đối (hay cịn gọi là cồn khan, có độ cồn 99,7 – 100
%), được sản xuất từ cồn cơng nghiệp (có hàm lượng ethanol 92 – 96 %). Trên thế giới,
việc nghiên cứu sử dụng ethanol để thay thế chất phụ gia MTBE trong xăng dầu đã được
tiến hành trong nhiều năm qua. Ở Mỹ, Chính phủ nước này cơng bố cấm sử dụng MTBE
vào đầu năm 2003, do nhiều cơng trình nghiên cứu về sự ô nhiễm nguồn nước, môi
19


trường khơng khí, sức khỏe con người của việc sử dụng MTBE. Ethanol nhiên liệu được
đặc biệt chú ý ở các nước có nền nơng nghiệp phát triển và là mục tiêu hướng tới của đa
số quốc gia có nhu cầu tiêu thụ năng lượng lớn. Chương trình ethanol nhiên liệu được
nhiều nước quan tâm, đầu tư xây dựng chiến lược để phát triển các nhà máy sản xuất
ethanol từ các loại ngũ cốc như: ngơ, sắn, mía đường.... để đáp ứng nhu cầu cung cấp
nhiên liệu tái tạo trong tương lai. Đây là chương trình phát triển nơng nghiệp nơng thơn,
nhằm khai thác tiềm năng sẵn có về lao động, đất đai, nguồn nông sản ở mỗi quốc gia.
Theo Petrovietnam, hiện nay, 47 % ethanol nhiên liệu trên thế giới được sản xuất
từ mía đường và 53 % được sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột. Năm 2003, tồn thế

giới đã sản xuất được 38,5 tỷ lít Etanol nhiên liệu (trong đó châu Mỹ chiếm khoảng 70
%, châu Á 17 %, châu Âu 10 %), trong đó 70 % được dùng làm nhiên liệu, 30 % được
sử dụng trong cơng nghiệp thực phẩm, y tế, hố chất. Đến năm 2007, lượng ethanol
nhiên liệu sản xuất đã tăng lên 56 tỷ lít, trong đó tỷ lệ sử dụng làm nhiên liệu tăng lên
75 %. Dự báo đến năm 2012 (khi Nghị định thư Kyoto có hiệu lực), lượng ethanol nhiên
liệu thế giới sẽ tăng lên 81,9 tỷ lít và tỷ lệ sử dụng làm nhiên liệu tăng lên tới 85 %.
Trên thế giới, Brazil, Mỹ và Trung Quốc là 3 quốc gia đứng đầu về sản xuất và sử
dụng Etanol nhiên liệu. Trong khu vực Đông Nam Á, Thái Lan là quốc gia phát triển rất
nhanh về sản xuất và sử dụng xăng pha cồn sản xuất từ phế phẩm của sắn, hạt ngơ, cây
ngơ, đường, bã mía.
Brazil: Là quốc gia sản xuất và sử dụng cồn nhiên liệu lớn nhất thế giới. Hiện có
trên 60.000 đồn điền trồng mía với 6,5 triệu hecta và trên 500 nhà máy sản xuất đường,
cồn chủ yếu dùng trong nước và xuất khẩu (tương đương với 220.000 thùng dầu/ngày)
hàng năm tiết kiệm được trên 2 tỷ USD chi cho việc nhập dầu. Cả nước có trên 3 triệu
ơtơ sử dụng hồn tồn cồn khan làm nhiên liệu và 17 triệu ôtô sử dụng xăng pha 24 %
cồn. Ngành cơng nghiệp mía - đường - cồn và các ngành liên quan của Braxin hàng năm
có doanh thu khoảng 8,3 tỷ USD, giải quyết việc làm cho trên 1 triệu lao động. Từ năm
1975, Chính phủ Braxin đã thực thi chương trình mang tên Proalcool mà sau này trở
thành mẫu hình được nhiều quốc gia học tập để phát triển nhiên liệu sinh học (Đỗ Huy
Định, 2003; Pessoa et al., 2005). Năm 2004, Braxin sản xuất cồn ở mức kỷ lục với 15,2
tỷ lít, tăng 3,4 % so với năm 2003, năm 2009, sản lượng này lên tới 19,8 tỷ lít (Bảng
1.8).
Bảng 1.8 Dự tính sản lượng ethanol tồn cầu từ năm 2011 đến năm 2016
Dự tính sản lượng ethanol tồn cầu 2011 – 2016 (Triệu Gallons)
Năm
2011
2012
2013
2014
2015

Mỹ
14.401
13.768
13.293
14.313
14.807
Brazil
5.573
5.577
6.267
6.190
7.093
Liên minh Châu Âu
1.167
1.139
1.371
1.445
1.387
Trung Quốc
554
555
696
635
813
Canada
462
449
523
510
436

20

2016
15.329
7.295
1.377
845
436


Thái Lan

Argentina
Ấn Độ
Các nước khác
Thế giới

22.404

545
727
23.429

21.812

310
160
155
865
24.570

334
211
211
391
25.682

322
264
225
490
26.583

(Renewable Fuels Association.
Truy cập ngày 4/4/2017).

Mỹ: Là quốc gia tiêu thụ hàng năm 25 % năng lượng trên thế giới (trong khi chỉ
có 6 % trữ lượng dầu mỏ), hơn 60 % dầu mỏ phải nhập từ bên ngoài. Sự thâm hụt cán
cân thương mại năng lượng lên đến trên 80 tỷ USD. Năm 1998, Tổng thống Mỹ B.
Clinton đã ký sắc lệnh 13101 về sử dụng sản phẩm sinh học thay thế một phần dầu mỏ.
Năm 2004, Mỹ đã sản xuất trên 13 triệu m3 cồn. Tương lai, Mỹ có thể vượt Braxin,
nước sản xuất ethanol lớn nhất trên thế giới hiện nay (vào năm 2004), do lệnh cấm sử
dụng MTBE (vào năm 2003) sẽ làm tăng mạnh nhu cầu đối với ethanol nhiên liệu ở Mỹ.
Trung Quốc: Là quốc gia sản xuất và sử dụng cồn nhiên liệu lớn thứ 3 sau Braxin
và Mỹ. Năm 2004, nước này đã đưa vào hoạt động nhà máy sản xuất cồn lớn nhất thế
giới với công suất 600.000 tấn/năm tại Cát Lâm (mỗi năm tiêu thụ 1,9 triệu tấn ngô làm
nguyên liệu), tăng sản lượng cồn ethanol cả nước trên 3,5 triệu m3. Từ tháng 6/2002,
nước này đã quyết định sử dụng xăng pha 10 % cồn khan (E - 10) ở 5 thành phố và đến
cuối năm 2006 sẽ tăng thêm 27 thành phố đông dân khác.
Thái Lan: Cũng là một trong những quốc gia tích cực đầu tư vào nhiên liệu sinh

học. Đến năm 2004, nước này đã sản xuất trên 280.000 m3 cồn, đầu tư thêm 20 nhà máy
để năm 2015 có trên 2,5 tỉ lit cồn dùng làm nhiên liệu. Chính phủ nước này có kế hoạch
tăng sản lượng ethanol nhiên liệu lên tới 650 triệu lít vào năm 2003 từ ngun liệu chính
là sắn, ngơ, mía đường.
Tây Ban Nha: Trở thành nhà sản xuất ethanol sinh học lớn nhất ở châu Âu vào
năm 2004, khi nhà máy thứ 3 và là nhà máy lớn nhất của nước này đi vào hoạt động vào
năm 2004.
Ấn Độ: Là nước thứ 3 trong khu vực châu Á bắt đầu sản xuất ethanol nhiên liệu.
Ấn Độ đã sử dụng xăng pha 5 % cồn ở 9 bang và 4 tiểu vùng từ ngày 1/1/2003, các bang
còn lại sử dụng ở giai đoạn 2, giai đoạn 3 sẽ tăng 10 % cồn pha trong xăng. Hiện nay,
công nghiệp ethanol của nước này mới đạt 1,8 tỷ lít. Ấn Độ phụ thuộc chủ yếu vào lượng
dầu nhập khẩu, năm 2001, lượng dầu nhập khẩu là 75 triệu tấn, trị giá 17,5 tỷ USD, cho
thấy nhu cầu về ethanol nhiên liệu là rất lớn. Số liệu của tiến sĩ Christoph Beng trong
báo cáo "Công nghiệp sản xuất ethanol thế giới năm 2001" cho biết: Tổng nhu cầu
ethanol nhiên liệu của ấn Độ ước tính khoảng 3,2 tỷ lít/ năm. Nhu cầu ethanol tăng cao
dẫn đến hình thành thị trường xuất nhập khẩu ethanol nhiên liệu giữa các nước. Một số
nước công nghiệp như Nhật bản, Hàn quốc… phải nhập khẩu lượng lớn ethanol từ một
21


số quốc gia sản xuất cồn nhiên liệu. Theo dự tính, từ năm 2008 đến năm 2012 sản lượng
ethanol trên tồn cầu tăng từ 61 đến 82 tỉ lít.
1.4.5 Sản xuất và nghiên cứu ethanol ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cồn được sản xuất chủ yếu từ nguồn nguyên liệu rỉ mía đường. Mỗi
năm tổng cơng suất sản xuất cồn trên cả nước đều tăng tập trung ở 3 nhà máy lớn có
cơng suất từ 15.000 – 30.000 lít/ngày là nhà máy đường Hiệp Hoà, Lam Sơn, nhà máy
bia rượu Bình Tây… và hàng trăm cơ sở sản xuất có quy mô nhỏ lẻ với công suất từ
3.000 đến 5.000 lít/ngày. Sản lượng cồn Việt Nam hiện nay cịn rất nhỏ, công suất sản
xuất của mỗi nhà máy cũng nhỏ, các đơn vị sản xuất cồn đang gặp nhiều khó khăn do
nguồn nguyên liệu không ổn định, công nghệ sản xuất lạc hậu, tốn nhiều chi phí sản

xuất nên sản phẩm khơng có sức cạnh tranh.
Do nhu cầu thị trường tiêu thụ cồn trong nước ngày càng tăng, các đơn vị sản xuất
cồn trong nước đẩy mạnh sản xuất, đồng thời mở rộng thêm nhiều nhà máy mới (Công
ty cổ phần mía đường Biên Hồ đầu tư xây dựng nhà máy công suất 50.000 tấn/năm,
Công ty Đồng Xanh đầu tư xây dựng nhà máy cơng suất 60.000 lít/ngày, Cơng ty CP
Cồn sinh học Việt Nam đầu tư nhà máy 66.000 m3/năm tại Đắc Lắc, BIDV đầu tư nhà
máy công suất 100.000 tấn/năm tại Quảng Nam… Dự án đầu tư xây dựng Nhà máy sản
xuất Bioethanol khu vực phía Bắc do PVB làm Chủ đầu tư là dự án nằm trong Đề án
phát triển nhiên liệu sinh học của Việt Nam đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 được
Thủ tướng Chính phủ phê duyệt tại Quyết định số 177/2007/QĐ-TTg ngày 20/11/2007.
Đây là nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học đầu tiên được xây dựng ở miền Bắc Việt
Nam có quy mô đầu tư lớn, công nghệ tiên tiến, thiết bị hiện đại với tổng mức đầu tư
khoảng 80 triệu USD, công suất 100.000 m3 ethanol/năm, tại huyện Tam Nông, tỉnh Phú
Thọ, sử dụng nguyên liệu sắn, mía để sản xuất ethanol.
Ở nước ta, giới khoa học đã quan tâm nghiên cứu nhiên liệu sinh học hơn một thập
kỷ qua như các cơ quan thuộc ngành GTVT, công nghiệp, năng lượng, Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, các trường đại học… Tháng 6.2004, Công ty Phát triển Phụ
gia và Sản phẩm Dầu mỏ (APP) đã dự thảo "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học ở Việt
Nam" (xăng/diesel pha cồn ethanol và diesel sinh học) gửi Chính phủ và một số
bộ/ngành. Dự án đề nghị thực hiện trong 2 giai đoạn: giai đoạn I (2006 - 2010) hồn
thiện cơng nghệ pha chế thử nghiệm và xây dựng mơ hình đầu tư thấp kết hợp sản xuất
cồn khan với pha chế sử dụng sản phẩm quy mô 100.000 m3 xăng pha cồn/năm thay thế
một phần xăng khoáng (thực hiện ở các đô thị đông dân cư như thành phố Hồ Chí Minh,
Hà Nội...), xây dựng chính sách để phát triển vùng nguyên liệu sản xuất cồn sử dụng
làm nhiên liệu; giai đoạn II (2010-2020) với mục tiêu pha chế khoảng 2 triệu m3 nhiên
liệu thay thế đáp ứng khoảng 15 % lượng xăng dầu thiếu hụt, xây dựng quy hoạch để
phát triển lớn hơn cho các năm tiếp theo. Bộ Cơng nghiệp cũng đang hồn tất "Đề án
quốc gia về nhiên liệu sinh học" giai đoạn 2006 - 2020 để trình Chính phủ (Nguyễn
Ninh, 1992; Võ Hồng Nhân và Trần Tuấn Đức, 1993).
22

Ngày 6/4/2005, Sở Khoa học và Công nghệ (KH-CN) TP.HCM đã đồng ý hỗ trợ
30.000 USD như là kinh phí ban đầu cho nhóm nghiên cứu đề tài nghiên cứu khoa học
trong lĩnh vực Biomass giai đoạn 2005 – 2007. Nhóm nghiên cứu đề tài Biomass, xử lý
phế phẩm nơng nghiệp, do TS. Phan Đình Tuấn, trường ĐH Bách khoa TP.HCM phụ
trách. Biomass là đề tài của nghiên cứu công nghệ xử lý các phế phẩm trong sản xuất
nông nghiệp như rơm, rạ, trấu… nhằm sản xuất Bio-ethanol (cồn nguyên liệu), tiến tới
xây dựng mơ hình “Thị trấn Biomass” tại Việt Nam. Theo kế họach, nhóm nghiên cứu
chương trình Biomass sẽ phải xây dựng cơ sở dữ liệu về việc sản xuất và sử dụng
biomass tại xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, TP.HCM nhằm phục vụ cho việc thiết kế mơ
hình “Thị trấn Biomass”. Ngồi ra, nhóm nghiên cứu phải nghiên cứu hai công nghệ:
công nghệ thuỷ nhiệt xử lý phế liệu rơm rạ - trấu phục vụ cho việc lên men sản xuất
ethanol - cồn nhiên liệu, và công nghệ xử lý khí độc H2S trong biogas trước khi đưa vào
sử dụng.
Đã có khá nhiều thành tựu trong cơng nghệ sản xuất cồn tuyệt đối. Trong số những
thành quả đạt được phải ghi nhận những đóng góp của nhóm nghiên cứu do ThS. Vũ Bá
Minh, Ðại Học Bách Khoa TP HCM. Hồ Chí Minh thực hiện từ những năm 1983 với
cơng nghệ “Chưng cất trích ly để sản xuất cồn tuyệt đối” hoặc nhóm nghiên cứu do TS.
Vũ Đào Thắng, Khoa Cơng nghệ Hố học, Đại học Bách khoa Hà Nội chủ trì trong cơng
nghệ sản xuất cồn tuyệt đối và cồn làm khô nhiên liệu. Bằng phương pháp sử dụng chất
hấp phụ chọn lọc, tại Bộ mơn Hóa - Khoa Cơng nghệ Hóa học - Trường đại học Bách
khoa Hà Nội đã thiết lập được công nghệ và dây chuyền sản xuất cồn tuyệt đối đạt nồng
độ 99,5 %, cơng suất 50 lít/ ngày. Đây là một cơng nghệ đơn giản, thiết bị được chế tạo
trong nước, nguyên liệu tự nhiên sẵn có, giá thành thấp. Sản phẩm của cơng nghệ này
sử dụng tốt trong các phịng thí nghiệm, làm dung môi pha sơn, vecni và đặc biệt sử
dụng làm nhiên liệu rất tốt cho sản xuất xăng sạch và điêzen sạch. Ngồi ra Bộ mơn
Hóa, Trường đại học Bách khoa Hà Nội đã hồn thiện cơng nghệ sản xuất cồn khô từ
năm 2002 ở quy mô công nghiệp, năng suất 300 kg/ca. Như vậy để có được cồn tuyệt
đối từ cồn 96% là việc hoàn toàn khả thi tại Việt Nam.

Trong những năm 2001-2004 PGS. TS. Ngô Tiến Hiển và ThS. Nguyễn Thúy
Hường đã phụ trách đề tài nhánh cấp nhà nước về sản xuất cồn nhiên liệu từ nguyên liệu
rỉ đường trong khuôn khổ đề tài KC.07.14 “Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ và thiết
bị chế biến một số nông sản với quy mô vừa và nhỏ” do TS. Vũ Thị Đào (Viện công
nghiệp thực phẩm) làm chủ nhiệm. Thành quả là nhóm đề tài đã tìm được phương pháp
khử độc hiệu quả dịch rỉ đường, lựa chọn được chủng giống nấm men và điều kiện lên
men thích hợp, chế tạo và đưa vào vận hành hệ thống lên men liên tục dịch rỉ đường cho
sản xuất cồn với nồng độ cồn trong dấm sau lên men là 11,5%. Mơ hình này đã được
triển khai vào sản xuất tại Cơng ty Đường Hịa Bình với hệ thống lên men quy mô 50
m3.

23


Tương tự như vậy, đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme tái tổ hợp thủy phân
lignocellulose phục vụ sản xuất cồn nhiên liệu” KC.04.22/06-10 do PGS. TS. Tô Kim
Anh, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội làm chủ nhiệm. Kết quả nghiên cứu của đề
tài hứa hẹn tạo ra những enzyme có khả năng ứng dụng cao trong thủy phân cơ chất
lignocellulose.
1.5 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT LÊN MEN TẠOETHANOL
Trong tự nhiên, rất nhiều vi sinh vật có thể sử dụng đường 5 và đường 6 carbon
làm nguồn dinh dưỡng, do đó nó có thể lên men chuyển hóa các đường này thành
ethanol. Một số vi sinh vật lên men ethanol phổ biến như nấm men Saccharomyces
cerevisiae; Zymmomonas mobilis; E. coli… Để sàng lọc và lựa chọn chủng vi sinh vật
có thể sử dụng trong sản xuất cơng nghiệp, các vi sinh vật phải đáp ứng một số tiêu chí
nhất định: Có thể sử dụng dải cơ chất rộng; Có khả năng phát triển và lên men với hiệu
suất cao; Sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men tối thiểu; Có khả năng chịu
độ cồn cao, pH thấp và nhiệt độ cao, khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường
rẻ tiền (Đỗ Huy Định, 2003).
1.5.1 Nấm men

Nấm men là đối tượng được quan tâm trước hết trong lên men ethanol, đặc biệt là
nấm men S. cerevisiae. Chúng là dạng nấm men đơn bào mang nhiều đặc điểm phong
phú về sinh trưởng và phát triển, tế bào dạng hình cầu, bầu dục, elip, hoặc hơi dài, với
kích thước 3 - 7 x 4 – 12 cm, khuẩn lạc nhẵn bóng, trịn, màu kem. Nấm men S.
cerevisiae có đặc điểm sinh trưởng kị khí khơng bắt buộc, chúng vừa có khả năng hơ
hấp và lên men ethanol. Sinh trưởng kị khí nghiêm ngặt ở S. cerevisiae chỉ xảy ra qua
một vài thế hệ, vì sự tổng hợp sterol cần cho cấu trúc màng tế bào đòi hỏi phải có khí
O2.
Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh sản, phát triển nấm men, tốc độ lên
men và chất lượng ethanol. Nấm men có thể chịu được nhiệt độ từ 4 – 450C, nhưng nhiệt
độ phù hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm men là 24 – 300C. Ngoài ra, nhiệt độ
quá thấp hoặc quá cao đều làm cho quá trình lên men bị dừng trong khi hàm lượng
đường trong dung dịch lên men cịn cao, làm ảnh hưởng khơng tốt tới chất lượng ethanol.
Nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men rượu truyền thống từ gạo là 24 – 280C và việc
duy trì nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình lên men là rất cần thiết (Nguyễn Thành Đạt,
1999).
Nấm men có thể sinh sản và phát triển trong mơi trường có pH từ 2,5 – 7,5, nhưng
pH phù hợp nhất với sinh sản và phát triển của nấm men là 4,0 – 6,0. Vì vậy, để hạn chế
quá trình lây nhiễm và phát triển của nhiều loại vi khuẩn, phù hợp với sinh trưởng của
nấm men và pH tự nhiên của dịch lên men, trong nhân giống và sản xuất pH ln được
duy trì ở mức 5,0 – 6,0.

24