Sản xuất nước ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thương gan

BỘ CÔNG THƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG
Tên đề tài: Sản xuất nƣớc ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống
oxy hóa ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan
Mã số đề tài: 184.TP 08
Chủ nhiệm đề tài: TS. Trần Gia Bửu
Đơn vị thực hiện: Viện Cơng nghệ Sinh học và Thực phẩm

Tp. Hồ Chí Minh - 2019


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Tổng quan về tỏi đen
Tỏi (Allium sativum) là một loài thực vật thuộc họ Hành, tỏi đƣợc trồng bắt nguồn

từ vùng Trung Á và đƣợc con ngƣời sử dụng rộng rãi nhƣ một loại gia vị cũng nhƣ do
tác dụng dƣợc học của chúng. Tỏi đƣợc cho là có tính chất kháng sinh và tăng khả năng
phòng ngừa ung thƣ, chống huyết áp cao, mỡ máu ở con ngƣời. Thành phần trong củ tỏi
có khoảng 84,09% là nƣớc, 13,38% là các chất hữu cơ, 1,53% là các thành phần vơ cơ.
Cịn ở phần lá, thì lá tỏi có 87,14% là nƣớc, 11,27% là chất hữuu cơ, và 1,59% là các
chất vơ cơ. Tỏi có chứa các hợp chất lƣu huỳnh nhƣ allicin, alliin và agoene; các
enzyme nhƣ allinase, peroxidase và miracynase; thành phần carbohydrates bao gồm
sucrose và glucose; lƣợng lớn khoáng chất, đặc biệt là selenium; các axit amin nhƣ
cysteine, glutamine, isoleucine và methionine; các bioflavonoids nhƣ quercetin và

cyanidin, allistatin I và II allistatin; vitamin C, E, A và các vitamin khác nhƣ niacin, B1
và B2 hay beta carotene.
Tỏi đen là sản phẩm chế biến từ tỏi tƣơi qua một quá trình lên men chậm (khoảng
35- 55 ngày), dƣới sự kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ và độ ẩm. Sản phẩm tạo thành có
màu đen, vị ngọt, khơng cịn mùi cay hăng của tỏi thƣờng và có tác dụng chống oxy hố
hơn nhiều lần so với loại tỏi thơng thƣờng (Hình 1.1). Thành phần hóa học của tỏi đen
chứa chủ yếu các axit amin, peptide, protein, enzyme, glicozit, vitamin, … Trong quá
trình lên men, các phản ứng hóa học xảy ra và chuyển hóa các hợp chất chứa lƣu huỳnh
nhƣ methionin, cystein, methanethiol thành những hợp chất chứa lƣu huỳnh mới nhƣ :
S-Allyl-L-cysteine, alliin, isoalliin, methionin, cycloalliin, các dẫn xuất của cysteine,
các dẫn chất của tetrahydro-β-carboline. Bên cạnh đó, hàm lƣợng các chất chống oxy
hố cũng nhƣ hoạt tính chống oxy hố của tỏi khơng bị mất đi mà ngƣợc lại cịn tăng
lên rất nhiều lần (Bảng 1.1). Theo nghiên cứu của Nguyễn T.N. và cộng sự, sau 30
ngày lên men ở 60oC, hàm lƣợng hợp chất polyphenol tổng số và hàm lƣợng flavonoid
tổng số trong tỏi đen tăng 15.5 lần và 6.5 lần so với tỏi tƣơi. Nghiên cứu của Sato E. và
cộng sự cho thấy hiệu lực chống oxy hóa của tỏi đen cao gấp 25 lần tỏi tƣơi sau quá
trình lên men. Khả năng chống oxy hóa cao của tỏi đen giúp bảo vệ cơ thể khỏi các tổn
hại do các gốc tự do sản sinh thơng qua các q trình trao đổi chất bình thƣờng trong cơ
thể hoặc từ các tác nhân độc hại bên ngồi nhƣ khói bụi, rƣợu bia, thuốc lá, cafein,...
4


A

B

Hình 1.1. Tỏi đen là một sản phẩm chế biến từ tỏi bằng cách lên men tỏi tƣơi ở
nhiệt độ và độ ẩm xác định trong một khoảng thời gian dài. Hình ảnh tỏi tƣơi (A) và
sản phẩm tỏi đen sau khi lên men (B)

Thành phẩn tỏi đen có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học nên tỏi đen trở
thành loại thực phẩm lý tƣởng để hỗ trợ điều trị cho các bệnh mãn tính nhƣ tiểu đƣờng,
cao huyết áp, xơ vữa động mạch, rối loạn mỡ máu, bệnh Alzheimer, ung thƣ… Các
nghiên cứu trƣớc đó đã chỉ ra rằng tỏi đen có tác dụng ức chế sự tăng trƣởng của tế bào
ung thƣ bao tử và ruột già, cải thiện tình trạng rối loạn mỡ máu, chống béo phì, kháng
viêm, chống dị ứng (Kimura S. và cộng sự, 2017). Thêm vào đó, Jeong J.H. và cộng sự
(2013) đã chứng minh dịch chiết tỏi có khả năng làm giảm độc tính lên tế bào thần kinh
của Aβ và cải thiện sự suy giảm nhận thức. Gần đây, khả năng bảo vệ chống lại tác
động có hại thứ phát của q trình oxy hóa do xạ trị gây ra của tỏi đen cũng đƣợc ghi
nhận (Hồ A.S. và Vũ B.D, 2014).
1.2.

Tổng quan các nghiên cứu về khả năng bảo vệ gan của tỏi đen
Gan là cơ quan chính của cơ thể chịu trách nhiệm trong việc giải độc và chuyển

hóa và tổng hợp các chất trong cơ thể. Tuy nhiên việc tiếp xúc với thuốc lá, hóa chất
độc hại, virus, rƣợu dẫn đến tổn thƣơng gan nghiêm trọng và làm suy yếu chức năng của
gan dẫn đến các bệnh về gan. Những năm gần đây, các bệnh về gan nhƣ viêm gan, xơ
gan, ung thƣ gan... vẫn là mối đe dọa đối với sức khỏe toàn cầu. Số liệu thống kê về số
ca tử vong toàn cầu năm 2010 cho thấy khoảng 752,100 ca tử vong do ung thƣ gan và
307,661 do viêm gan cấp, hơn 1,000,000 ca liên quan đến xơ gan trên toàn thế giới
(Lozano R. và cộng sự, 2010; Mokdad A.A. và cộng sự, 2014). Việt Nam cũng là một

5


nƣớc có tỉ lệ ngƣời dân tử vong do mắc xơ gan (18,5 ca tử vong trên 100,000 ngƣời) và
số ca tử vong vì xơ gan ở Việt Nam khá cao (chiếm 14,098 ca tử vong trong năm 2010).
Một trong những xu hƣớng nghiên cứu hiện đại đó là tìm ra các hợp chất oxy hố
có nguồn gốc từ động, thực vật để ứng dụng sản xuất ra các thực phẩm, dƣợc phẩm,

thực phẩm chức năng phục vụ cho đời sống. Các chất chống oxy hoá là các hợp chất có
khả năng làm chậm lại, ngăn cản, hoặc đảo ngƣợc q trình oxy hố các hợp chất có
trong tế bào của cơ thể nên có nhiều ứng dụng trong việc phòng và chữa trị nhằm hỗ trợ
ngăn ngừa và điều trị tổn thƣơng gan do độc tố hoặc các gốc oxy hóa. Một số loải dƣợc
thảo nhƣ hoa cúc la mã, cây kế sữa, cây xƣơng rồng nopal, cây xƣơng rồng lê gai, tảo
spirulina đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh khả năng bảo vệ gan chống lại tác hại của
các gốc oxy hóa và độc tố (Madrigal-Santillán E. và cộng sự, 2014)
Khả năng bảo vệ gan của tỏi đen cũng đƣợc ghi nhận trong các báo cáo gần đây.
Shin J.H. và cộng sự (2014) đã chứng minh khả năng bảo vệ gan của dịch chiết tỏi đen
trên mơ hình gây độc tính gan cấp bởi CCl4 và D-gaclactosamine và mơ hình tổn thƣơng
gan bằng chế độ ăn giàu chất béo. Ở cả ba mơ hình, dịch chiết tỏi đen đều giảm hoạt độ
men gan (ALT, AST), chỉ số đánh giá tổn thƣơng gan, cũng nhƣ giảm sự tích lũy lipid ở
mơ gan (mơ hình chế độ ăn giàu chất béo) hoặc giảm sự xâm nhiễm của các tế bào đơn
nhân vào gan (mơ hình CCl4 và D-gaclactosamine). Tác động hỗ trợ điều trị của tỏi đen
cũng đã đƣợc khẳng định trên mơ hình tổn thƣơng gan do sử dụng cồn lâu ngày (Kim
MH và cộng sự, 2011). Kim M.H. và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng sử dụng tỏi đen sẽ
làm giảm khối lƣợng gan, khối lƣợng mỡ tổng số và mỡ trên mào tỉnh. Tỏi đen làm
giảm sự thay đổi của chất béo xung quanh không gian khoảng cửa và giảm tích tụ mỡ
trong gan. Hoạt độ của các enzyme gan (ALT, AST, ALP, LDH) cũng giảm đáng kể ở
nhóm chuột sử dụng tỏi đen và ethanol thƣờng xuyên, khi so sánh với nhóm sử dụng
ethanol thƣờng xuyên. Những nghiên cứu này đã góp phần làm rõ tác động trị liệu của
tỏi đen lên một số bệnh lý, đặc biệt là bệnh liên quan đến tổn thƣơng trên gan. Gần đây,
dịch chiết của tỏi đen bằng phƣơng pháp vi sóng cũng đƣợc chứng minh có hoạt tính
bảo vệ gan chống lại tác hại của carbon tetracholride lên mỡ máu, men gan và hình thái
mơ học của gan trên mơ hình động vật (Tran G.B và cộng sự, 2018). Tuy nhiên, hoạt
tính bảo vệ gan của sản phẩm nƣớc ép tỏi đen trích ly bằng enzyme lại chƣa đƣợc
nghiên cứu.

6

Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên, nhóm nghiên cứu đã tiến hành hành thực
hiện đề tài "Sản xuất nƣớc ép tỏi đen (Allium sativum L.) giàu hoạt tính chống oxy hóa
ứng dụng vào hỗ trợ điều trị tổn thƣơng gan". Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu
đã đánh giá tác động của các thông số của quy trình trích ly nhƣ loại enzyme, nồng độ
enzyme, thời gian trích ly, nhiệt độ thủy phân lên hoạt tính chống oxy hóa của nƣớc ép
tỏi đen. Thành phần dinh dƣỡng và chỉ tiêu vi sinh của nƣớc ép tỏi đen cũng đƣợc kiểm
tra để đảm bảo các yêu cầu của đồ uống khơng cồn. Ngồi ra, nhóm nghiên cứu cũng
tiến hành đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của nƣớc ép tỏi đen trên mơ hình động vật.

A

B

C

D

Hình 1.2. Dịch chiết tỏi đen trích ly bằng phƣơng pháp có tác dụng bảo vệ gan ở mơ hình
chuột bị tổn thƣơng gan do carbon tetrachloride. Nhóm đối chứng (A) và nhóm sử dụng tỏi
đen (B) cho thấy đặc điểm mô học và hình thái bình thƣờng. Gan của nhóm gây tổn thƣơng gan
bằng carbon tetrachloride có dấu hiệu bất thƣờng về hình thái nhƣ sƣng to, màu nâu nhạt và bề
mặt có các nốt sần (C). Nhóm cho uống tỏi đen kết hợp với carbon tetrachloride (D) có sụ cải
thiện về hình thái gan nhƣ màu đỏ, khơng cịn sung bề mặt ít các nốt sần hơn (Tran G.B. và
cộng sự, 2018) .

7


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
Tỏi tƣơi nhiều nhánh (Allium sativum) đƣợc thu mua tại huyện đảo Lý Sơn, Tỉnh
Quảng Ngãi vào tháng 6/2017 (Hình 2.1). Sau khi thu mua tỏi, tỏi đƣợc phân loại và lựa
chọn các củ tỏi không bị hƣ hỏng vật lý, không sâu mọt để tiến hành các nghiên cứu tiếp
theo. Tỏi đƣợc bóc vỏ và lên men trong tủ lão hóa (Shellab, Hoa Kỳ) với nhiệt độ 75oC
độ ẩm tƣơng đối 90% sau 15 ngày (Nguyễn T.H.Y. và Trần G. B., 2018). Tỏi đen sau
khi lên men đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi đƣợc sử dụng ở các thí nghiệm tiếp
theo.

A

B

Hình 2.1. Tỏi tƣơi và tỏi đen sử dụng trong nghiên cứu. Tỏi tƣơi đƣợc bóc vỏ (A) và sử
dụng làm nguyên liệu để sản xuất tỏi đen (B) qua quá trình lên men ở nhiệt độ 75oC độ ẩm
tƣơng đối 90% sau 15 ngày

2.2. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của các thông số trích ly dịch chiết tỏi đen
bằng pectinase lên khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol, hàm lƣợng
flavonoid
Nhằm khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme bổ sung lên khả năng chống oxy hóa,
hàm lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền
với nƣớc theo tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng là 1:10. Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ sung
pectinase (Pectinex Ultra SP, Novozymes, Đan Mạch) với các tỷ lệ (0, 2, 2,5, 3, 3,5,
4%) (v/v). Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ trong tủ ấm với nhiệt độ 45oC với thời
gian 5 giờ. Sau đó, hỗn hợp trên đƣợc đồng hóa bằng máy xay sinh tố và gia nhiệt đến
90oC trong 5 phút nhằm bất hoạt enzyme pectinase. Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc
lọc bằng giấy lọc Whatman. Dịch lọc sẽ đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng chống oxy
hóa và hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số.
8

Nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân lên khả năng chống oxy hóa,
hàm lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền
nhuyễn với nƣớc theo tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng là 1:10. Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ
sung pectinase với các tỷ lệ 3,5% (v/v). Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ trong tủ ấm
với nhiệt độ (40, 45, 50, 55, 60oC) với thời gian 5 giờ. Sau đó, hỗn hợp trên đƣợc đồng
hóa bằng máy xay sinh tố và gia nhiệt đến 90oC trong 5 phút nhằm bất hoạt enzyme
pectinase. Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman. Dịch lọc sẽ
đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng chống oxy hóa và hàm lƣợng polyphenol tổng số,
hàm lƣợng flavonoid tổng số.
Nhằm khảo sát ảnh hƣởng của thời gian thủy phân lên khả năng chống oxy hóa,
hàm lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền
nhuyễn với nƣớc theo tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng là 1:10. Dịch huyền phù tỏi đen đƣợc bổ
sung pectinase với các tỷ lệ 3,5% (v/v). Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ trong tủ ấm
với nhiệt độ với thời gian (4, 5, 6 7, 8 giờ) để pectinase thủy phân tỏi đen. Sau đó, hỗn
hợp trên đƣợc đồng hóa bằng máy xay sinh tố và gia nhiệt đến 90oC trong 5 phút nhằm
bất hoạt enzyme pectinase. Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc bằng giấy lọc
Whatman. Dịch lọc sẽ đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng chống oxy hóa và hàm lƣợng
polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số.
2.3. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của các thông số trích ly dịch chiết tỏi đen
bằng cellulase lên khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol, hàm lƣợng
flavonoid
Nhằm khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme bổ sung lên khả năng chống oxy hóa,
hàm lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền
trong nƣớc với tỷ lệ 1:10 bằng máy xay sinh tố. Sau đó hỗn hợp đƣợc ủ với các tỷ lệ
enzyme cellulase (Novozymes, Đan Mạch) nhƣ sau: 0%, 0,02%, 0,04%, 0,06%, 0,08%,
0,10% ở nhiệt độ 45oC trong 3 giờ. Sau khi thủy phân bằng cellulase, hỗn hợp nƣớc tỏi
đen sẽ đƣợc đun lên nhằm bất hoạt enzyme và lọc qua máy lọc chân không. Dịch lọc sẽ
đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng chống oxy hóa và hàm lƣợng polyphenol tổng số,

hàm lƣợng flavonoid tổng số.
Nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân lên khả năng chống oxy hóa,
hàm lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen, tỏi đen đƣợc nghiền
9


trong nƣớc với tỷ lệ 1:10 bằng máy xay sinh tố. Sau đó hỗn hợp đƣợc ủ với tỷ lệ
enzyme cellulase 0,06% ở nhiệt độ 40, 45, 50, 55, 60oC trong 3 giờ. Sau khi thủy phân
bằng cellulase, hỗn hợp nƣớc tỏi đen sẽ đƣợc đun lên nhằm bất hoạt enzyme và lọc qua
máy lọc chân không. Dịch lọc sẽ đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng chống oxy hóa và
hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng flavonoid tổng số.
Nhằm khảo sát ảnh hƣởng của thời gian thủy phân bổ sung lên khả năng chống
oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen, tỏi đen
đƣợc nghiền trong nƣớc với tỷ lệ 1:10 (nguyên liệu: nƣớc) bằng máy xay sinh tố. Sau đó
hỗn hợp đƣợc ủ với các tỷ lệ enzyme cellulase nhƣ sau 0,06% ở nhiệt độ 45oC trong 1,
2, 3, 4, 5 giờ. Sau khi thủy phân bằng cellulase, hỗn hợp nƣớc tỏi đen sẽ đƣợc đun lên
nhằm bất hoạt enzyme và lọc qua máy lọc chân không. Dịch lọc sẽ đƣợc sử dụng để
khảo sát khả năng chống oxy hóa và hàm lƣợng polyphenol tổng số, hàm lƣợng
flavonoid tổng số.
2.4. Phƣơng pháp khảo sát khả năng chống oxy hoá của dịch chiết tỏi đen
Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen đƣợc đánh giá thông qua khả
năng bắt gốc tự do DPPH. Phƣơng pháp xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH tiến
hành theo phƣơng pháp của Choi I.S. và cộng sự (2014) với một vài hiệu chỉnh nhỏ.
Khả năng bắt gốc tự do DPPH đƣợc thể hiện thông qua sự giảm độ hấp thu ở bƣớc
sóng 517nm, do gốc DPPH bị khử bởi các thành phần kháng oxy hóa trong mẫu khảo
sát.
Khả năng bắt gốc tự do DPPH đƣợc xác định theo cơng thức:

Trong đó, Abs control là độ hấp thu của mẫu trắng gồm DPPH và ethanol, đƣợc
đo ở 0 phút, Abs test là độ hấp thu của mẫu thử gồm DPPH và dịch trích, đƣợc đo sau

30 phút giữ trong tối.
2.5. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết tỏi đen
Hàm lƣợng polyphenol tổng số đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu với
thuốc thử Folin- Ciocalteu. Dịch trích ly đƣợc đo mật độ quang ở bƣớc sóng 750 nm.
Acid gallic đƣợc sử dụng nhƣ là chất chuẩn tham khảo và kết quả đƣợc quy tƣơng
10


đƣơng theo số miligram acid gallic/1 gram chất khô của nguyên liệu (mg GAE/g chất
khô).
2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen
Hàm lƣợng flavonoid tổng số đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu với dung
dịch AlCl3. Dịch trích ly đƣợc đo mật độ quang ở bƣớc sóng 415 nm. Quercetin đƣợc sử
dụng nhƣ là chất chuẩn tham khảo và kết quả đƣợc quy tƣơng đƣơng theo số miligram
quercetin/1 gram chất khô của nguyên liệu (mg QE/g chất khô).
2.7. Phƣơng pháp xác định thành phần dinh dƣỡng và chỉ tiêu vi sinh của sản
phẩm
Tỏi đen sau khi đƣợc lựa chọn đƣợc nghiền nhuyễn bằng máy xay và tiến hành
dịch hoá tỏi đen với nƣớc với tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng là 1:10. Dịch huyền phù tỏi đen
đƣợc bổ sung cellulase với tỷ lệ 0,06%. Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ trong tủ ấm
với nhiệt độ 45oC trong 3 giờ để cellulase thủy phân tỏi đen. Sau đó, hỗn hợp trên đƣợc
đồng hóa bằng máy xay sinh tố và gia nhiệt đến 90oC trong 5 phút nhằm bất hoạt
enzyme cellulase. Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman. Dịch
trích ly của tỏi đen đƣợc đóng chai 200ml và thanh trùng ở nhiệt độ 90oC trong 2 phút.
Sau đó, mẫu dịch chiết tỏi đen đƣợc chọn ngẫu nhiên và gửi đến phân tích tại Trung
Tâm Phân Tích Kỹ Thuật Cao Sài Gòn nhằm xác định thành phần dinh dƣỡng và các
chỉ tiêu vi sinh của dịch chiết tỏi đen.
Chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm đƣợc đánh giá tổng số sinh vật hiếu khí (TCVN
4884-1:2015), tổng số bào tử nấm men, nấm mốc (TCVN 8275-1:2010), sự hiện diện
của Coliforms (TCVN 6848:2007), E. coli (TCVN 7924-2:2008), S. aureus (TCVN

4830-1:2005), C. perfringens (TCVN 4991:2005), S. feacal (TCVN 6189-2:2009),
P.aeruginosa (ISO 16266:2006).
Thành phần dinh dƣỡng của sản phẩm đƣợc xác định qua hàm lƣợng protein tổng
số (AOAC 991.20), chất béo (AOAC 996.06), carbonhydrate (EC 152-2009), hàm
lƣợng khoáng: Mg, K, Fe, Mn, Zn, Na, Se (AOAC 986.15), P ( AOAC 995.11), hàm
lƣợng acid amin (AOAC 994.12), các kim loại nặng: chì, asen, cadimi (AOAC 986.15),
thủy ngân (AOAC 974.14), vitamin A (AOAC 2001.13) và vitamin C (phƣơng pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao của Albalá-Hurtado S. et al (1997)).

11


Khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng polyphenol tổng số và hàm lƣợng flavonoid
tổng số đƣợc xác định tƣơng tự với phƣơng pháp xác định trong dịch trích ly tỏi đen ở
các mục 2.4, 2.5, 2.6.
2.8. Phƣơng pháp khảo sát khả năng phục hồi tổn thƣơng gan bằng nƣớc ép tỏi đen
trên mơ hình chuột
Chuột, giới tính đực, 10 tuần tuổi, có trọng lƣợng từ 30-32g đƣợc cung cấp bởi
Viện Pasteur TP. HCM. Sau đó, chuột đƣợc ni từ 3-5 con trong chuồng có lót trấu
trong điều kiện của phịng thí nghiệm đƣợc cho đồ ăn và nƣớc uống bình thƣờng trong 2
tuần để thích nghi. Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành các lô sau, với 5 con/lô:
-

Lô 1 (Nƣớc): Lơ chuột bình thƣờng. Cho chuột uống nƣớc trong vịng 18 tuần.

-

Lô 2 (TĐ): Lô chuột uống tỏi đen. Cho chuột uống nƣớc trong 10 tuần đầu, sau
đó cho chuột uống tỏi đen với liều lƣợng 200 mg/kg mỗi ngày trong vịng 8 tuần

-

Lơ 3 (TAA): Lơ chuột uống TAA. Cho chuột uống TAA với liều lƣợng 300 mg/l
mỗi ngày trong 10 tuần. Sau đó, chuột tiếp tục đƣợc cho uống nƣớc trong 8 tuần
tiếp theo.

-

Lô 4 (TAA+TĐ): Lô chuột uống TAA và dịch chiết tỏi đen. Cho chuột uống
TAA với liều lƣợng là 300 mg/l mỗi ngày trong 10 tuần. Sau đó, cho chuột uống
dịch chiết tỏi đen với liều lƣợng 200 mg/kg mỗi ngày trong 8 tuần.

-

Lô 5 (TAA+Sily): Lô chuột uống TAA với Silymarin. Cho chuột uống TAA với
liều lƣợng 300 mg/l mỗi ngày trong 10 tuần. Sau đó, cho chuột uống silymarin
với liều lƣợng 50 mg/kg mỗi ngày trong 8 tuần.
Sau khi kết thúc thời gian gây bệnh và điều trị, chuột đƣợc cho nhịn đói qua đêm

để hạn chế sự tác động của thức ăn lên các chỉ tiêu sinh hóa máu. Chuột đƣợc gây mê
bằng diethyl ether trong hộp kín với thời gian 2 phút, sau đó chúng tơi tiến hành lấy
máu từ tim chuột vào ống thu máu có chứa chất chống đơng (heparin). Các chỉ tiêu sinh
hóa của mẫu máu: alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST),
triglyceride (TG) và cholesterol tổng số (TC), đƣợc phân tích bằng máy xét nghiệm sinh
hóa bán tự động tại Khoa sinh hóa, Bệnh viện quân y 175. Sau đó, chúng tơi tiến hành
giải phẫu thu nhận gan chuột và giữ trong dung dịch formaline 4%. Mẫu gan đƣợc phân
tích mơ học bằng phƣơng pháp nhuộm Hemotoxyline và Eosin tại bộ mơn Giải phẩu
bệnh, Trung tâm chẩn đốn và điều trị ung bƣớu, Bệnh viện quân y 175.

12

2.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại 3 lần, kết quả đƣợc trình bày dƣới dạng
số trung bình (của 3 lần lặp lại) ± độ lệch chuẩn. Số liệu đƣợc phân tích ANOVA bằng
phần mềm xử lý số liệu chuyên dụng Statgraphics Centurion XVI (Statpoint
Technologies, Hoa Kỳ). Kiểm định Multiple range test đƣợc thực hiện để đánh giá mức
độ khác biệt giữa các giá trị với mức độ ý nghĩa là p<0.05.

13


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ pectinase lên khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng
polyphenol tổng số và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
pectinase
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ pectinase bổ sung lên khả năng chống oxy
hóa, hàm lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen đƣợc trình bày ở
Hình 3.1. Khi chúng ta xử lý tỏi đen bằng pectinase thì khả năng chống oxy hóa của
dịch chiết tỏi đen tăng từ 20,76 ± 0,91% (mẫu không xử lý) lên 38,69 ± 0,55% (mẫu xử
lý 2%) (p<0,05). Sau đó, khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen tăng cùng với
sự gia tăng tỷ lệ enzyme và đạt giá trị cực đại khi xử lý với 3,5% pectinase (47,19 ±
0,80%). Khi tiếp tục tăng tỷ lệ enzyme lên 4% thì khả năng chống oxy hóa của dịch
chiết cũng khơng thay đổi (47,30 ± 0,97%).
Tƣơng tự, ở mẫu tỏi đen xử lý bằng pectinase (2%), hàm lƣợng các hợp chất
polyphenol (8,64 ± 0,15 mgGAE/g chất khô) và flavonoid (0,53 ± 0,00 mgQE/g chất
khô) của dịch chiết tỏi đen đều tăng so với đối chứng (6,52 ± 0,27 mgGAE/g chất khô
và 0,34 ± 0,02 mgQE/g chất khơ, p<0,05). Sau đó, khi chúng ta tăng dần tỷ lệ pectinase
thì hàm lƣợng polyphenol và flavonoid cũng tăng tƣơng ứng và đạt giá trị cực đại tại tỷ

lệ 3,5% (10,43 ± 0,18 mgGAE/g chất khô và 0,58 ± 0,02 mgQE/g chất khô, tƣơng ứng).
Từ kết quả trên ta chọn tỷ lệ enzyme pectinase là 3,5% để xử lý mẫu tỏi đen nhằm thu
dịch chiết có khả năng chống oxy hóa cao nhất.

14


Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ pectinase bổ sung lên khả năng chống oxy hóa (A), hàm
lƣợng polyphenol (B) và flavonoid tổng số (C) của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
pectinase

3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân lên khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng
polyphenol tổng số và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
pectinase
Kết quả cho thấy khi chúng ta gia tăng nhiệt độ thủy phân trong giới hạn nhất
định thì khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen cũng tăng dần (Hình 3.2). Cụ thể
là, khả năng chống oyx hóa của dịch chiết tỏi đen xử lý ở nhiệt độ 45oC (43,92 ±
0,73%) cao hơn so với mẫu xử lý ở nhiệt độ 40oC (39,11 ± 1,01%, p<0,05). Sau đó, khả
năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen tăng dần và đạt giá trị cực đại khi chúng ta
tăng nhiệt độ đến 55oC (50,12 ± 0,76%). Khi chúng ta tiếp tục tăng nhiệt độ thì khả
năng chống oxy hóa của dịch chiết lại giảm (45,55 ± 1,10%, p<0,05).
15


Mặt khác, hàm lƣợng polyphenol và flavonoid của dịch chiết tỏi đen cũng tăng
dần khi gia tăng nhiệt độ thủy phân. Cụ thể, hàm lƣợng polyphenol (10,76 ± 0,20
mgGAE/g chất khô) và flavonoid (0,62 ± 0,01 mg QE/g chất khô) cùa dịch chiết tỏi đen
thủy phân ở nhiệt độ 55oC cao hơn so mẫu xử lý ở nhiệt độ 40oC (9,72 ± 0,14 mgGAE/g
chất khô và 0,49 ± 0,02 mgQE/g chất khô, tƣơng ứng). Tuy nhiên nếu nhiệt độ vƣợt quá
giá trị tối ƣu thì hàm lƣợng polyphenol và flavonoid lại giảm nhẹ, điều đó đƣợc minh

chứng qua hàm lƣợng polyphenol và flavonoid của dịch chiết tỏi đen xử lý ở nhiệt độ
60oC (10,39 ± 0,15 mgGAE/g chất khô và 0,57 ± 0,02 mgQE/g chất khô, tƣơng ứng
thấp hơn mẫu xử lý ở nhiệt độ 55oC (9,72 ± 0,14 mgGAE/g chất khô và 0,49 ± 0,02
mgQE/g chất khô, p<0,05) . Từ đó, ta chọn nhiệt độ thủy phân là 55oC để tạo dịch chiết
tỏi đen giàu hoạt tính chống oxy hóa và các chất hoạt tính sinh học nhƣ polyphenol và
flavonoid.

16


Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân lên khả năng chống oxy hóa (A), hàm lƣợng
polyphenol (B) và flavonoid tổng số (C) của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng pectinase

3.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân lên khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng
polyphenol tổng số và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
pectinase
Từ kết quả khảo sát, ta nhận thấy thời gian thủy phân tăng dần thì khả năng
chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen cũng tăng dần tƣơng ứng (Hình 3.3). Cụ thể là, khả
năng chống oyx hóa của dịch chiết tỏi đen xử lý trong 5 giờ (49,32 ± 0,90%) cao hơn so
với mẫu xử lý trong 4 giờ (45,44 ± 1,02%, p<0,05). Sau đó, khả năng chống oxy hóa
của dịch chiết tỏi đen tăng dần và đạt giá trị cực đại khi chúng ta tăng thời gian lên 6 giờ
(52,40 ± 0,69%). Khi chúng ta tiếp tục tăng thời gian xử lý mẫu lên 7 và 8 giờ thì khả
năng chống oxy hóa của dịch chiết vẫn không đổi (51,71 ± 1,22% và 51,43 ± 0,94%,
p>0,05).
Thêm vào đó, hàm lƣợng polyphenol dịch chiết tỏi đen cũng tăng dần khi gia
tăng thời gian thủy phân và đạt giá trị cực đại khi thời gian xử lý tăng lên 6 giờ. Cụ thể,
hàm lƣợng polyphenol ở 6 giờ (10,70 ± 0,16 mgGAE/g chất khô) cao hơn so mẫu xử lý
trong 4 giờ (9,88 ± 0,15 mgGAE/g chất khô, p<0,05). Hàm lƣợng polyphenol của dịch
chiết tỏi đen không đổi khi chúng ta tiếp tục kéo dài thời gian xử lý lên 7 và 8 giờ
(p>0,05). Tƣơng tự, hàm lƣợng flavonoid của dịch chiết tỏi đen cũng tăng khi ta tăng

thời gian xử lý từ 4 giờ (0,58 ± 0,00 mgQE/g chất khô) lên 5 giờ (0,62 ± 0,01 mgQE/g
chất khô, p<0,05). Tuy nhiên giá trị cực đại của hàm lƣợng flavonoid lại ở thời gian xử
lý 5 giờ, nên khi chúng ta tiếp tục tăng thời gian xử lý thì hàm lƣợng flavonoid không
17


đổi (p>0,05). Từ đó, ta chọn thời gian thủy phân là 6 giờ để tạo dịch chiết tỏi đen giàu
hoạt tính chống oxy hóa và các chất hoạt tính sinh học nhƣ polyphenol và flavonoid.
Tóm lại, trong quy trình xử lý bằng pectinase, ta thiết lập đƣợc các thông số tối
ƣu là tỷ lệ pectinase (3,5%), nhiệt độ (55oC) và thời gian thủy phân (6 giờ) nhằm thu
đƣợc dịch chiết tỏi đen có khả năng chống oxy hóa (52,40 ± 0,69%) và các chất hoạt
tính sinh học nhƣ polyphenol và flavonoid cao nhất (10,70 ± 0,16 mgGAE/g chất khô
và 0,63 ± 0,01 mgQE/g chất khô).

18


Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân lên khả năng chống oxy hóa (A), hàm lƣợng
polyphenol (B) và flavonoid tổng số (C) của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng pectinase

3.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cellulase lên khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng
polyphenol tổng số và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
cellulase
Khi chúng ta xử lý tỏi đen bằng cellulase thì khả năng chống oxy hóa của dịch
chiết tỏi đen tăng từ 22,75 ± 3,74% (mẫu không xử lý) lên 38,92 ± 2,74% (mẫu xử lý
với 0,02% cellulase, p<0,05). Sau đó, khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen
tăng cùng với sự gia tăng tỷ lệ enzyme và đạt giá trị cực đại khi xử lý với 0,06%
cellulose (59,28 ± 4,75%). Khi tiếp tục tăng tỷ lệ enzyme lên 0,8% và 0,1% thì khả năng
chống oxy hóa của dịch chiết cũng không thay đổi (59,88 ± 2,74% và 61,08 ± 3,59%,
p>0,05).

Tƣơng tự, ở mẫu tỏi đen xử lý bằng cellulase (0,02%), hàm lƣợng các hợp chất
polyphenol (9,53 ± 0,27 mgGAE/g chất khô) và flavonoid (0,53 ± 0,02 mgQE/g chất
khô) của dịch chiết tỏi đen ]đều tăng so với mẫu không xử lý (6,52 ± 0,27 mgGAE/g
chất khô và 0,34 ± 0,02 mgQE/g chất khơ, p<0,05). Sau đó, khi chúng ta tăng dần tỷ lệ
cellualse thì hàm lƣợng polyphenol và flavonoid đạt giá trị cực đại ở tỷ lệ 0,06% (11,05
± 0,20 mgGAE/g chất khô và 0,69 ± 0,02 mgQE/g chất khô, tƣơng ứng). Tuy nhiên, khi
nồng độ cellulase tiếp tục tăng đến 0.1% thì hàm lƣợng các hợp chất polyphenol và
flavoinoid thu đƣợc lại không đổi (11,11 ± 0,13 mg GAE/g chất khô và 0.71 ± 0,02
mgQE/g chất khô, tƣơng ứng). Kết quả này tƣơng đồng với kết quả của nhóm nghiên
19


cứu Sun Z.và cộng sự. Khi khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng q trình trích ly hợp chất
polyphenol từ trái cây Xoan Nhừ bằng enzyme, Sun Z. và cộng sự nhận thấy khi tăng
dần tỷ lệ enzyme từ 0-1.5% thì hàm lƣợng polyphenol sẽ tăng dần, rồi đạt giá trị cực đại
sau đó khi tỷ lệ enzyme tiếp tục tăng (2%) thì hàm lƣợng polyphenol lại khơng tăng
thêm mà giữ ổn định. Theo Nguyễn N.M.P. và cộng sự (2009), khi thừa cơ chất, vận tốc
phản ứng tăng khi nồng độ enzyme tăng nhƣng khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng
độ cơ chất thì vận tốc phản ứng khơng thay đổi hoặc không tăng thêm khi tăng nồng độ
enzyme. Ngồi ra, chúng tơi nhận thấy khả năng bắt gốc tự do DPPH tăng lên cùng với
sự tăng nồng độ enzyme từ 0% đến 0,1%, tƣơng ứng khả năng bắt gốc tự do DPPH thu
đƣợc tăng từ 22,75 ± 3,74% lên 61,08 ± 3,59%. Nồng độ enzyme càng cao thì hiệu suất
trích ly các hợp chất chống oxy hóa càng cao, điều này đƣợc giải thích dựa trên cơ chế
tác dụng của enzyme xúc tác. Khi nồng độ enzyme càng cao, dẫn đến sự tăng khả năng
phá vỡ cấu trúc thành tế bào, đây vốn là cơ quan che chở bên ngồi của tế bào làm giải
phóng các hợp chất chống oxy hóa bên trong. Từ kết quả trên ta chọn tỷ lệ enzyme
pectinase là 0,06% để xử lý mẫu tỏi đen nhằm thu dịch chiết có khả năng chống oxy
hóa, hàm lƣợng polyphenol và flavonoid cao nhất.

20

Hình 3.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cellulase bổ sung lên khả năng chống oxy hóa (A), hàm
lƣợng polyphenol (B) và flavonoid tổng số (C) của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
cellulase.

3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân lên khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng
polyphenol tổng số và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
cellulase
Kết quả cho thấy khi chúng ta gia tăng nhiệt độ thủy phân trong giới hạn nhất
định thì khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen cũng tăng dần. Cụ thể là, khả
năng chống oyx hóa của dịch chiết tỏi đen xử lý ở nhiệt độ 35oC (33,33 ± 1,99%) cao
hơn so với mẫu xử lý ở nhiệt độ 30oC (27,97,11 ± 1,33%, p<0,05). Sau đó, khả năng
chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen tăng dần và đạt giá trị cực đại khi chúng ta tăng
21


nhiệt độ đến 45oC (59,00 ± 3,51%). Khi chúng ta tiếp tục tăng nhiệt độ đến 55oC thì khả
năng chống oxy hóa của dịch chiết vẫn khơng đổi (58,62 ± 1,10%, p>0,05).
Tƣơng tự, hàm lƣợng polyphenol và flavonoid của dịch chiết tỏi đen cũng tăng
dần khi gia tăng nhiệt độ thủy phân. Cụ thể, hàm lƣợng polyphenol (10,10 ± 0,20
mgGAE/g chất khô) và flavonoid (0,57 ± 0,02 mg QE/g chất khô) cùa dịch chiết tỏi đen
thủy phân ở nhiệt độ 35oC cao hơn so mẫu xử lý ở nhiệt độ 30oC (9,13 ± 0,11 mgGAE/g
chất khô và 0,41 ± 0,03 mgQE/g chất khơ, tƣơng ứng). Sau đó, hàm lƣợng polyphenol
và flavonoid đạt giá trị cực đại khi tỏi đen đƣợc xử lý ở nhiệt độ 45oC (11,02 ± 0,23
mgGAE/g chất khô và 0,69 ± 0,03 mgQE/g chất khô, tƣơng ứng). Khi nhiệt độ tiếp tục
tăng đến 55oC thì flavonoid của dịch chiết tỏi đen không khác biệt về thống kê với mẫu
xử lý ở 45oC, trong khi hàm lƣợng polyphenol giảm so với mẫu xử lý ở 45oC. Từ kết
quả trên, ta chọn nhiệt độ thủy phân là 45oC để tạo dịch chiết tỏi đen giàu hoạt tính
chống oxy hóa và các chất hoạt tính sinh học nhƣ polyphenol và flavonoid.

Sở dĩ nhiệt độ tăng thì hiệu suất thu đƣợc hàm lƣợng các hợp chất polyphenol tăng
là vì khi tăng nhiệt độ, tăng khuếch tán phân tử từ bên trong ra bên ngoài, cấu trúc của
nguyên liệu cũng bị suy yếu do nhiệt độ, tạo điều kiện cho việc giải phóng các chất từ
trong tế bào nguyên liệu ra bên ngồi. Mỗi enzyme lại có một khoảng nhiệt độ hoạt
động tối ƣu, khi nhiệt độ dịch hóa ở trên hoặc dƣới khoảng tối ƣu thì hoạt tính enzyme
sẽ giảm, do đó, khả năng trích ly các hợp chất polyphenol và khả năng chống oxy hóa
của dịch chiết ở ngồi nhiệt độ tối ƣu của enzyme cũng giảm. Một số nghiên cứu đã
công bố cho thấy mối liên hệ chặt chẽ giữa nhiệt độ dịch hoá với hàm lƣợng
polyphenol, flavonoid tổng và khả năng chống oxy hố của các dịch trích từ
thực vật (Vuong Q.S. và cộng sự, 2013; Samuagam L. và cộng sự, 2013). Theo
Pan S. và Wu S. (2014), thì nhiệt độ tối thích cho q trình trích ly
polysaccharides và hợp chất chống oxy hóa từ tỏi bằng cellulase là 45 o C. Kết
quả trên cũng khá tƣơng đồng với kết quả của chúng tơi, khi chúng tơi trích ly
tỏi đen với nhiệt độ 45 o C thì hàm lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số cũng
nhƣ khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen đạt giá trị cực đại (11,02 ±
0,23 mg GAE/g, 0,69 ± 0,03 mgQE/g chất khô và 59,00 ± 3,51%).

22


23


Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân sung lên khả năng chống oxy hóa (A), hàm
lƣợng polyphenol (B) và flavonoid tổng số (C) của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
cellulase.

3.6. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân lên khả năng chống oxy hóa, hàm lƣợng
polyphenol tổng số và flavonoid tổng số của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
cellulase

Cũng tƣơng tự nhƣ yếu tố nhiệt độ thì thời gian trích ly càng dài thì hiệu suất trích
ly các hợp chất phenolic càng cao, các polymer và các hợp chất phenolic sẽ hịa tan vào
dung mơi trích ly càng nhiều (Spigno G. và cộng sự, 2007). Tuy nhiên, khi quá trình
khuếch tán đã đạt đƣợc trạng thái cân bằng hay nói cách khác, nồng độ chất khuếch tán
bên trong nguyên liệu và bên ngoài đặt trạng thái cân bằng, khi đó khơng tồn tại sự
chênh lệch về gradient nồng độ. Điều này dẫn đến quá trình khuếch tán chậm lại hoặc
khơng diễn ra nữa. Thời gian trích ly q dài cũng khơng có tác động tích cực cho việc
trích ly các hợp chất phenolic (Silva E.M. và cộng sự, 2007). Theo Kankara S.S. và
cộng sự (2014), thời gian trích ly càng dài thì dịch chiết càng tiếp xúc nhiều với nhiệt
độ, ánh sáng, oxy, những yếu tố gây phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol và phân hủy
enzyme.
Chúng ta nhận thấy khi thời gian thủy phân tăng dần thì khả năng chống oxy hóa
của dịch chiết tỏi đen cũng tăng dần tƣơng ứng. Cụ thể là, khả năng chống oyx hóa của
dịch chiết tỏi đen xử lý trong 2 giờ (41,62 ± 2,66%) cao hơn so với mẫu khơng xử lý
(22,93 ± 1,62%, p<0,05). Sau đó, khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen tăng và
đạt giá trị cực đại khi chúng ta tăng thời gian lên 3 giờ (59,26 ± 3,82%). Khi chúng ta
tiếp tục tăng thời gian xử lý mẫu lên 4 và 5 giờ thì khả năng chống oxy hóa của dịch
chiết vẫn không đổi (59,96 ± 3,40% và 60,32 ± 2,80%, p>0,05).
Thêm vào đó, hàm lƣợng polyphenol dịch chiết tỏi đen cũng tăng dần khi gia
tăng thời gian thủy phân và đạt giá trị cực đại khi thời gian xử lý tăng lên 3 giờ. Cụ thể,
hàm lƣợng polyphenol ở 3 giờ (11,00 ± 0,16 mgGAE/g chất khô) cao hơn so mẫu xử lý
trong 1 giờ (9,41 ± 0,08 mgGAE/g chất khô, p<0,05). Hàm lƣợng polyphenol của dịch
chiết tỏi đen không đổi khi chúng ta tiếp tục kéo dài thời gian xử lý lên 4 và 5 giờ.
Tƣơng tự, hàm lƣợng flavonoid của dịch chiết tỏi đen cũng tăng khi ta tăng thời gian xử
24


lý từ 1 giờ (0,50 ± 0,02 mgQE/g chất khô) lên 3 giờ (0,69 ± 0,02 mgQE/g chất khô,
p<0,05). Hàm lƣợng flavonoid đạt giá trị cực đại ở thời gian xử lý 3 giờ, nên khi chúng
ta tiếp tục tăng thời gian xử lý thì hàm lƣợng flavonoid khơng đổi (p>0,05). Từ đó, ta

chọn thời gian thủy phân là 3 giờ để tạo dịch chiết tỏi đen giàu hoạt tính chống oxy hóa
và các chất hoạt tính sinh học nhƣ polyphenol và flavonoid.
Tóm lại, trong quy trình xử lý bằng cellulase, ta thiết lập đƣợc các thông số tối
ƣu là tỷ lệ cellulase (0,06%), nhiệt độ (45oC) và thời gian thủy phân (3 giờ) nhằm thu
đƣợc dịch chiết tỏi đen có khả năng chống oxy hóa (59,26 ± 3,82%) và các chất hoạt
tính sinh học nhƣ polyphenol và flavonoid cao nhất (11,00 ± 0,16 mgGAE/g chất khô
và 0,69 ± 0,02 mgQE/g chất khô).

25


Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân sung lên khả năng chống oxy hóa (A), hàm
lƣợng polyphenol (B) và flavonoid tổng số (C) của dịch chiết tỏi đen trích ly bằng
cellulase.

3.7. Đề xuất quy trình trích ly dịch chiết tỏi đen bằng cellulase nhằm tạo nƣớc ép
tỏi đen có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất
Khi so sánh giữa hai quy trình xử lý bằng cellualse và pectinase ở điều kiện tốt
nhất, ta nhận thấy dịch chiết tỏi đen xử lý bằng cellulose có khả năng chống oxy hóa
cao hơn dịch chiết tỏi đen xử lý bằng pectinase (59,26 ± 3,82% và 52,40 ± 0,69%,
tƣơng ứng, p<0,05). Bên cạnh đó, tỏi đen khi xử lý bằng cellulase thì dịch chiết có hàm
lƣợng polyphenol và flavonoid tổng số (11,00 ± 0,16 mgGAE/g chất khô và 0,69 ± 0,02
mgQE/g chất khơ, tƣơng ứng) cao hơn dịch chiết tỏi đen trích ly bằng pectinase (10,70
± 0,16 mgGAE/g chất khô và 0,63 ± 0,01 mgQE/g chất khơ). Do đó, ta chọn quy trình
xử lý cellulase tỷ lệ cellulase (0,06%), nhiệt độ (55oC) và thời gian thủy phân (3 giờ)
nhằm tạo sản phẩm nƣớc tỏi đen có hàm lƣợng polyphenol, flavonoid và khả năng
chống oxy hóa cao nhất.
Dựa vào kết quả trên, chúng tơi đề xuất quy trình sản xuất nƣớc ép tỏi đen bằng
cellulase nhƣ sau: tỏi đen sau khi đƣợc lựa chọn đƣợc nghiền nhuyễn bằng máy xay và
tiến hành dịch hoá tỏi đen với nƣớc với tỉ lệ tỏi:nƣớc tƣơng ứng là 1:10. Dịch huyền phù

tỏi đen đƣợc bổ sung cellulase với tỷ lệ 0,06%. Hỗn hợp dịch chiết tỏi đen đƣợc ủ trong
tủ ấm với nhiệt độ 45oC trong 3 giờ để cellulase thủy phân tỏi đen. Sau đó, hỗn hợp trên
đƣợc đồng hóa bằng máy xay sinh tố và gia nhiệt đến 90oC trong 5 phút nhằm bất hoạt
26


enzyme cellulase. Hỗn hợp dịch trích ly tỏi đen đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman. Dịch
trích ly của tỏi đen đƣợc đóng chai 200ml và thanh trùng ở nhiệt độ 90oC trong 2 phút
(Hình 3.7).
3.8. Kiểm tra khả năng chống oxy hóa và thành phần dinh dƣỡng, các chỉ tiêu vi
sinh của nƣớc ép tỏi đen sau thanh trùng
Hàm lƣợng polyphenol và flavonoid (8,65 ± 0,56 mgGAE/g chất khô và 0,60 ±
0,01 mgQE/g chất khô), cũng nhƣ khả năng chống oxy hóa (49,31 ± 0,96%) của sản
phẩm nƣớc tỏi đen sau khi thanh trùng giảm nhẹ so với mẫu trƣớc thanh trùng (11,00 ±
0,16 mgGAE/g chất khô, 0,69 ± 0,02 mgQE/g chất khô, và 59,26 ± 3,82%, p<0,05).
Trong sản phẩm nƣớc ép tỏi đen có chứa protein (0.78 g/100ml), carbohydrate
(5,9g/100ml), nhƣng khơng chứa chất béo. Sản phẩm giàu chất khống đa lƣợng và vi
lƣợng, lần lƣợt là Kali (1.299 mg/L), Natri (378 mg/L), Phospho (271 mg/L) , Magie
(56 mg/L), Canxi (54,3 mg/L), Kẽm (3,3 mg/L), Sắt (1,9 mg/L), và Mangan (0,93
mg/L). Kết quả cho thấy sản phẩm không chứa vitamin A, C cũng nhƣ các amino acid
thiết yếu. Đối với các kim loại nặng nhƣ: Chì, Asen, Cadimi, Thủy ngân đều khơng có
mặt trong sản phẩm (Bảng 3.1).
Về các chỉ tiêu vi sinh, sản phẩm chỉ chứa một ít vi sinh vật hiếu khí (25
CFU/ml) và khơng chứa các vi sinh vật khác nhƣ coliforms, E. coli. S. aureus. C
perfringens, S. feacal, P. aeruginosa, cũng nhƣ bào tử nấm men, mốc. Khi đối chiếu với
các yêu cầu về vi sinh và kim loại nặng của sản phẩm đồ uống không cồn thuộc quy
chuẩn QCVN 6- 2:2010 BYT, ta nhận thấy sản phẩm đạt yêu cầu và có thể sử dụng làm
đồ uống (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát thành phần dinh dƣỡng và vi sinh của nƣớc ép tỏi đen
sau thanh trùng.

Các chỉ tiêu

Mẫu nƣớc ép tỏi đen

Quy chuẩn QCVN 6-2:2010

sau thanh trùng

BYT

Thành phần dinh dƣỡng

27