Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật để hoàn thiện quy trình nhân nhanh trong nuôi cấy mô hoa phong lữ thảo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA NÔNG – LÂM – NGƢ

Phùng Thị Thanh Mai

“NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT
ĐỂ HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN NHANH
TRONG NI CẤY MƠ HOA PHONG LỮ THẢO”
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Nhóm ngành: Khoa học cây trồng

Giảng viên hướng dẫn 1: ThS. Trần Thành Vinh
2: ThS. Nguyễn Viết Dũng

Phú Thọ, 2017


2

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đề tài khóa luận này, em ln nhận được sự nhiệt tình
giúp đỡ về nhiều mặt của các thầy cơ giáo và gia đình. Em xin chân thành bày
tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
ThS. Trần Thành Vinh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt
q trình thực hiện đề tài khóa luận.
TS.Lê Đức Thảo,Trưởng bộ môn Đột biến & Ưu thế lai, Th.s Nguyễn
Viết Dũng, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ
bảo trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của các thầy cơ, cán bộ cơng
nhân viên tại bộ môn Đột biến & Ưu thế lai, Viện Di truyền Nơng nghiệp Việt
Nam, gia đình, người thân và toàn thể bạn bè đã động viên, giúp đỡ, tạo mọi

điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Qua đây em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Trường Đại học
Hùng Vương đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em trong thời gian học
tập.


3

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BAP

: 6-Benzylaminopurine

CT

: Công thức

CV (%)

: Sai số thí nghiệm

ĐC

: Đối chứng

Kin

: Kinetin (6 –furfrylaminopurine)

LSD0,05

: Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%

MS

: Môi trường Murashige and Skoog

TB

: Trung bình

α – NAA

: Axit α – naphtyl axetic

PLT

: Phong lữ thảo


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Phong lữ thảo (Pelargonium Sp) là một lồi hoa đẹp, với những chiếc
lá to trịn, mềm mại, dịu dàng, vẻ đẹp của cây với màu sắc hoa phong phú đa
dạng đỏ, vàng, trắng, phấn hồng…Phong lữ thảo có nguồn gốc từ các nước
vùng Địa Trung Hải, hiện được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia có khí hậu
nhiệt đới và cận nhiệt đới. Từ khi hoa bắt đầu nở cho đến khi tàn kéo dài hơn

2 tuần. Cụm hoa Phong lữ thảo càng rực rỡ thêm khi vươn thẳng trên đám lá
xanh mướt, hoa có độ bền lâu, hài hồ với thân cành nên có giá trị thẩm mỹ
cao khi được trồng ở chậu hay trang trí trong gia đình, khn viên,
vườn hoa… Ngồi tác dụng làm đẹp cảnh quan, trồng chậu trang trí; trong y
học, Phong lữ còn là loại thuốc bổ chống suy nhược và có khả năng khử
trùng. Đặc biệt, cuống hoa, lá và hoa còn được dùng chưng cất tinh dầu hay
sản xuất các loại nước hoa dành cho nam giới.
Mặc dù mới du nhập vào nước ta, song nhờ các đặc điểm ưu việt trên
mà hoa Phong lữ thảo đã được người sản xuất cũng như người tiêu dùng rất
ưa chuộng và hiện đang là một trong những loại hoa trồng chậu đang được
phát triển, có giá trị kinh tế cao.
Tuy nhiên, năng suất cũng như chất lượng hoa cung cấp cho thị trường
còn rất hạn chế bởi do Phong lữ thảo là giống hoa mới nhập, chưa đáp ứng
được nhu cầu sử dụng của người tiêu dùng. Phương pháp nhân giống hoa
Phong lữ thảo hiện nay chủ yếu là giâm cành và gieo hạt được áp dụng phổ
biến tuy nhiên hai phương pháp này cịn có những mặt hạn chế như giống cây
đem giâm vẫn nhiễm bệnh, không đồng đều… Chính vì vậy, hiện nay phương
pháp nhân giống bằng ni cấy mô tế bào được áp dụng một cách phổ biến
hơn để khắc phục được những hạn chế của các phương pháp cổ điển. Với
phương pháp này, hồn tồn có thể tạo ra một quần thể cây trồng đồng đều,
giữ nguyên đặc tính tốt của giống mẹ, hệ số nhân giống cao, sớm cho hiệu
quả kinh tế, không tốn diện tích nhân giống. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu sử


2

dụng của nguời tiêu dùng với chất lượng cây giống cao với số lượng lớn,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật để
hoàn thiện quy trình nhân nhanh trong ni cấy mơ hoa Phong lữ thảo”
2. Mục tiêu của đề tài

Góp phần xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro hoa Phong lữ thảo.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học giúp hồn thiện
quy trình nhân nhanh giống hoa Phong lữ thảo
- Đối với nghiên cứu khoa học: Giúp sinh viên tiếp cận với công tác
nghiên cứu khoa học, nâng cao trình độ chun mơn đồng thời tạo cho mình
tác phong làm việc đúng đắn, nghiêm túc, sáng tạo, đúc rút được những kinh
nghiệm thực tế.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Qua kết quả nghiên cứu đề tài góp phần hồn thiện quy trình nhân nhanh
hoa Phong lữ thảo ứng dụng vào thực tiễn sản suất, nâng cao chất lượng hoa
trồng.


3

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại của cây hoa Phong lữ thảo
Phong lữ thảo (Pelargonium sp) có nguồn gốc tại Nam Phi, Reunion,
Madagascar, Ai Cập và Maroc, sau đó mới được phát triển ra các nước Châu
Âu như Ý, Tây Ban Nha và Pháp vào thế kỷ 17.
Hiện nay hoa Phong lữ thảo phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, đặc
biệt là vùng ôn đới và khu vực miền núi của vùng nhiệt đới Địa Trung Hải rất
thích hợp cho loại hoa này phát triển .
Phong lữ thảo có:
Tên khoa học: Pelargonium sp
Chi: Pelargonium

Họ: Geraniaceae (Mỏ hạc)
Bộ: Geraniales.
1.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây hoa Phong lữ thảo
- Lá : Lá của cây Phong lữ thảo thường có hình dạng lá trịn, lá xẻ thuỳ
với răng cưa nhỏ, bên trong mặt lá có các vịng trịn thẫm, kích thước bản lá
to, màu xanh sẫm.
- Hoa: Hoa của cây Phong lữ thảo có dạng chùm, cánh hoa có hình bầu
dục, mỗi bơng hoa là một cụm hoa dạng đầu, bao gồm những bông con tập
hợp lại với nhau. Tập hợp nhiều bông hoa trên một cành hoa.
- Quả và hạt: Quả của cây Phong lữ thảo có dạng quả nang, quả dài và
mảnh, trên một cành hoa có nhiều bơng hoa, mỗi bơng sau khi tàn chỉ có duy
nhất một quả và có một hạt màu đen bên trong. Bình quân mỗi cành hoa cho
từ 10 - 20 hạt.
- Thân: Cây Phong lữ thảo thuộc dạng thân bụi, chiều cao trung bình từ
20 đến 50cm, có khả năng phân cành mạnh nên trong sản xuất phải cắt tỉa
cành để tập trung dinh dưỡng cho các cành chính phát triển và tạo tán cho cây
phù hợp với yêu cầu trồng chậu.


4

- Rễ: Rễ cây Phong lữ thảo không ăn sâu và có nhiều rễ nhỏ, phát triển
theo chiều ngang ở tầng mặt đất, với số lượng rễ nhiều nên khả năng hút nước
và chất dinh dưỡng của cây rất mạnh, nên khi trồng chậu cho Phong lữ thảo
đường kính chậu thích hợp sẽ giúp cho bộ rễ phát triển tốt, tránh được những
ảnh hưởng bất thường của thời tiết như nắng nóng, khơ hạn.
1.1.2. u cầu ngoại cảnh của cây hoa Phong lữ thảo
1.1.2.1. Ánh sáng
Ánh sáng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của cây
hoa. Ánh sáng cung cấp năng lượng cho phản ứng quang hợp tạo ra chất hữu

cơ cho cây. Để hoa Phong lữ thảo đạt năng suất, chất lượng cao thì ánh sáng
là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình ra hoa của cây.
Tuy nhiên, nếu để cây chịu ánh sáng trực tiếp liên tục và nhiệt độ cao
có thể làm ảnh hưởng tới khả năng quang hợp của lá, làm cho lá bị héo, ngay
cả khi làm ẩm ướt, ngồi ra có thể gây đỏ cuống lá và thân cây. Cường độ ánh
sáng là nguyên nhân chính ảnh hưởng tới chiều cao cây cũng như khả năng ra
hoa cây Phong lữ thảo. (Nguyễn Xuân Linh, 2000).
1.1.2.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu trong ngày phụ thuộc vào cường độ ánh sáng. Phong lữ
thảo là cây có nguồn gốc ơn đới nên thích hợp ở những nơi có khí hậu mát
mẻ, có biên độ nhiệt độ ngày và đêm cao cây sẽ sinh trưởng, phát triển tốt. Độ
ẩm khơng khí thích hợp 80 - 85%, nhiệt độ thích hợp 18 đến 22 0C ban ngày,
ban đêm 15 đến 170C là tốt nhất.
1.1.2.3. Đất và dinh dưỡng
Giá thể đối với Phong lữ thảo hết sức quan trọng, giá thể có thể là trấu
hun, xơ dừa, mùn cưa…giá thể giúp cho cây đứng vững và là nơi giữ, cung
cấp nước, dinh dưỡng cho cây trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển.
Ngồi ra cịn phải cung cấp dinh dưỡng qua đất bằng cách bón các loại phân
trực tiếp vài đất trồng và cung cấp dinh dưỡng qua lá bằng cách phun các loại
phân bón lá thích hợp. Đối với đất, Phong lữ thảo có thể trồng trên bất cứ một
loại đất nào, tuy nhiên đất phải có cấu trúc tốt và thoát nước. Trong suốt quá


5

trình trồng, đất phải ln tơi xốp và bề mặt đất phải đủ ẩm. Nhìn chung,
Phong lữ thảo ưa đất có thành phần cơ giới nhẹ, nhiều mùn và có hàm lượng
dinh dưỡng cao như đất mùn trên núi, đất phù sa…. để đạt được hiệu quả
trang trí cao thì việc phối hợp giữa các giá thể xơ dừa, mùn, trấu hun...và đất
là một trong những khâu hết sức quan trọng để hoa Phong lữ thảo đạt năng

suất chất lượng cao.
1.1.3. Giá trị sử dụng
- Hoa đẹp cả về màu sắc và hình dáng hoa lá, được trồng làm hoa trang
trí phịng khách, bàn làm việc, trang trí khơng gian sinh hoạt của gia
đình…hay làm quà tặng khách hàng, tặng bạn bè, người thân…
- Có thể trồng hoa Phong Lữ thành từng luống hoặc trong chậu cảnh để
xếp thành những thảm hoa trang trí thuần màu hay xen kẽ với nhiều màu sắc
khác nhau trong khách sạn, biệt thự, lối đi nơi cơng viên,…nhìn rất đẹp mắt
và sinh động.
- Ngồi tác dụng làm đẹp cảnh quan, trồng chậu trang trí; trong y học,
Phong Lữ còn là loại thuốc bổ chống suy nhược và có khả năng khử trùng.
Đặc biệt, cuống hoa, lá và hoa còn được dùng chưng cất tinh dầu hay sản xuất
các loại nước hoa dành cho nam giới.
1.2. Tình hình sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm trên thế giới
Ngày nay sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm trên thế giới đang phát
triển một cách mạnh mẽ và đã trở thành một ngành thương mại cao. Sản xuất
hoa trồng chậu, trồng thảm đã mang lại lợi ích to lớn cho nền kinh tế các nước
trồng hoa, cây cảnh, trong đó có các nước Châu Á. Năm 2000 lượng tiêu thụ
hoa chậu trên thế giới vào khoảng 20 đến 23 tỷ USD. Mỹ nhập khẩu khoảng
1/3 lượng hoa chậu trên thế giới, sau đó là Đức 20%, rồi đến Pháp và Ý. Các
nước xuất khẩu hoa chậu lớn nhất thế giới là Hà Lan, Đan Mạch và Bỉ khoảng
1,75 tỷ USD năm 1995. (Lê Xuân Tảo, 2004) [2] .
Theo Terril A. Nell (2004), hoa trồng chậu chiếm một phần quan
trọng trong sản xuất trồng hoa ở Mỹ (20,3% của ngành trồng hoa) trong đó


6

năm tiểu bang là California, Florida, Texas, Pennsylvania, New York chiếm

tới 53% sản xuất hoa trồng chậu ở nước này. Thời vụ chủ yếu là vào mùa
xuân và mùa hè, đặc biệt là tháng tư và tháng sáu thì hoa Phong lữ thảo được
sản xuất và bán ra thị trường rất lớn. Phong lữ thảo trồng chậu được xếp hạng
là một trong số các loại hoa trồng chậu tiêu thụ cao ở thị trường nước Mỹ.
Ở Châu Á, Nhật Bản là nước sản xuất hoa trồng chậu lớn nhất (chủ
yếu phục vụ nội tiêu) năm 1994 diện tích hoa cắt cành khoảng 18.000ha, diện
tích hoa trồng chậu 2000ha). Tiếp theo là Isarael, Ấn độ và một số nước Đông
Nam Á và Nam Á khác như Thái Lan, Maylaysia, Hàn Quốc và Trung Quốc.
Hiện nay, Trung Quốc có xu hướng phát triển mạnh hoa trang trí, bao gồm
các loại hoa như: hoa Báo xuân (Primula), Trạng nguyên, Thu hải đường
(Begonia)... với diện tích khoảng trên 60.000ha, các loại cây này chủ yếu xuất
khẩu sang một số nước Asean, trong đó có miền Bắc Việt Nam. Thành phố
Côn Minh là thủ phủ của tỉnh Vân Nam, Trung Quốc, với lợi thế về thiên
nhiên và khí hậu tương tự như Sapa, có thể thấy Côn Minh tràn ngập đủ loại
hoa và đủ màu sắc khác nhau. Trên hè phố, trong các ô vuông trồng cây
lấy bóng mát cũng được trang trí bằng các chậu hoa nhỏ, màu sắc rất sặc sỡ.
Sản xuất hoa có thể xem là ngành chủ chốt của Cơn Minh, nơi cung cấp 70%
hoa tươi cho Trung Quốc.
1.2.2. Tình hình sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm ở Việt Nam
Tại Việt Nam, sản xuất hoa chậu chủ yếu tập trung ở một số tỉnh phía
Nam như Gị Vấp, Thủ Đức, Vĩnh Long, Tiền Giang, Thành Phố Hồ Chí
Minh. Đà Lạt là nơi sản xuất hoa nổi tiếng của nước ta, năm 2003 diện tích
trồng hoa của Đà Lạt chỉ 743ha, đến năm 2005 diện tích đã tăng lên 1063ha
hoa các loại và đến nay năm 2009 xấp xỉ 3000ha. Hiện Đà Lạt có nhiều cá
nhân và cơng ty sản xuất hoa chậu như Công ty TNHH Bonie Farm, công ty
TNHH Lang Biang, Cơng ty quản lý cơng trình đơ thị, công ty TNHH Ánh
Minh, Công ty Dalat Hasfarm và các nông hộ chuyên bán hoa chậu dọc
đường Nguyễn Thị Minh Khai, khu Hồ Bình, các điểm du lịch. Hoa chậu Đà
Lạt không những cung cấp cho nhu cầu của địa phương mà còn đáp ứng

7

người tiêu dùng nhiều tỉnh, thành trong cả nước. Mỗi độ xuân về, hoa chậu
Đà Lạt theo những chuyến xe đi khắp nẻo đường đất nước để đến với Hà
Nội, Đà Nẵng, Nha Trang… đem niềm vui, hương sắc của những loại hoa ôn
đới, làm tô đẹp thêm không gian của nhiều ngôi nhà. Sa Pa, là vùng du lịch
nổi tiếng ở khu vực phía Bắc với điều kiện thiên nhiên thuận lợi nên có tiềm
năng phát triển hoa rất lớn. Ngồi các loại hoa ơn đới như Hồng, Lay ơn, Cẩm
chướng, Địa Lan … thì việc sản xuất hoa trồng chậu, trồng thảm ở Sapa đã và
đang phát triển tuy nhiên còn khá khiêm tốn. Thị trường hoa cao cấp mới chỉ
phát triển trong địa bàn tỉnh Lào Cai, chưa có thị trường và thương hiệu ở các
vùng tiêu thụ lớn như Hà Nội, Hải Phòng, Quang Ninh…. Một số giống hoa
trồng chậu hiện được thị trường trong nước ưa chuộng như: hoa Mào gà
(Celosia argentea), Cúc lá nho (Cineraria), Mai Địa thảo

(Impatiens

walleriana), Dạ yến thảo (Petunia), Phong lữ thảo (Pelargonium sp.), Thu hải
đường (Begonia)….Trong đó 3 loại hoa Dạ yến thảo, Phong lữ thảo, Thu hải
đường có thể trồng được quanh năm ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà
Lạt, Sapa, Mộc Châu. Ngoài ra, 3 loại hoa này cũng có thể trồng và trang trí ở
các thành phố lớn như Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, Hải Phòng… trong các dịp
lễ tết như: 30/4, 1/5, 20/10, tết Dương lịch, Âm lịch…. Phong lữ thảo là một
trong những loài hoa đẹp, hoa dày lộ trên mặt tán, rực rỡ trên chậu cộng với
chiều cao vừa phải, rất thích hợp cho trang trí trong phịng khách, cửa sổ…,
tuy nhiên yêu cầu về nhiệt độ của loài hoa này không quá khắt khe, Phong lữ
thảo yêu cầu nhiệt độ sinh trưởng phát triển tốt khoảng 18 – 22 0C ban ngày
và khoảng 15 – 17 0C vào ban đêm. Hà Nội là nơi tiêu thụ, trang trí hoa trồng
chậu nhiều nhất qua các ngày lễ lớn của đất nước. Hoa được trang trí khắp nơi

trên địa bàn Hà Nội như: Hồ Gươm, Công viên, các đường phố lớn. Các
giống hoa trồng chậu dùng để trang trí chủ yếu là Phong lữ thảo, Thu hải
đường, Trạng nguyên…được lấy từ trong nước là Đà Lạt, Sapa và một số ít là
từ hoa Côn Minh ở Trung Quốc. Rõ ràng, hoa trồng chậu, trồng thảm đang là
một trong những xu hướng phát triển mới của người trồng hoa khi mà nhu cầu
chơi hoa, trang trí khn viên, khách sạn ngày càng tăng. Hoa Phong lữ thảo


8

đã và đang trở thành đối tượng được các nhà nghiên cứu và sản xuất trong và
ngoài nước quan tâm.
1.3. Tình hình nghiên cứu hoa ở Việt Nam và trên thế giới
1.3.1. Tình hình nghiên cứu hoa trên thế giới
* Những nghiên cứu về nhân giống
Các nhà nghiên cứu thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Quảng Châu, Trung
Quốc đã xác định, khi nhân giống in vitro Phong lữ thảo từ lá non và cuống lá
cho thấy 6-benzyladenine, thidiazuron và kinetin là hiệu quả nhanh ra chồi
non. Còn 4-dichlorophenoxyacetic acid và Naphthaleneaceticd chỉ có hiệu
quả trong việc kích thích ra rễ. Điều này cho thấy cytokinin đóng một vai trị
quan trọng trong việc nhân giống hoa Phong lữ thảo bằng lá non và cuống
cây.
Trong nghiên cứu về vấn đề xác định vi khuẩn trong nuôi cấy mô
Phong lữ thảo, tác giả G.Reuther cho biết, đối với hoa Phong lữ thảo khi nhân
giống bằng phương pháp ni cấy mơ thì dễ bị lây lan loại vi khuẩn
Endopytic và các chất ô nhiễm khác. Bằng phương pháp thử nghiệm vi khuẩn
và sự phân bố của chất ô nhiễm ở phần lát cắt gây ảnh hưởng tới khả năng tạo
nốt sần và hình thành chồi non.
Theo Razdan (2003) và Batra (2001)[7] thì sự kết hợp tốt của auxin và
cytokinin là cần thiết cho sự hình thành callus. Tăng sinh khối tối đa ở mơi

trường có sự kết hợp hoocmon MS với 20 µM IBA + 10 µM KIN, 20 µM
IBA + 10 µM BAP và 20 µM IAA +10 µM KIN.
Theo Saxena (2002) trong nghiên cứu của mình về phương pháp in
vitro cho việc nhân giống Phong lữ thảo đã phát hiện ra rằng MS và bổ sung
0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA có hiệu quả trong nhân nhanh chồi Phong lữ
thảo.
Theo Sreedhar (1999)[20] đã báo cáo rằng số lượng chồi lớn nhất trong
việc nhân giống Phong lữ thảo in vitro đã được quan sát ở môi trường BAP và
IAA ở mức 1 mg/l là tốt nhất cho sự nhân chồi.
* Nghiên cứu về giá thể


9

Tác giả Bunt (1965) , đã sử dụng hỗn hợp cho gieo hạt (tính theo thể
tích) 1 than bùn + 1 cát + 2,4 kg/m3 đá vôi nghiền đều cho cây con mập, khoẻ.
Theo JR Keseler, Đại học Auburn (1998), để Phong lữ thảo bền đẹp và
hoa lâu tàn thì cần chú ý trong việc lựa chọn kích thước đường kính chậu hợp lý,
cắt xén tỉa rễ khi cây sang năm thứ 2, bên cạnh đó để giá thể trồng chậu cũng cần
được thay mới và pH 5,8-6,2. Giá thể tốt cho Phong lữ thảo là phải tơi xốp, nhẹ
và thoát nước tốt như rêu, than bùn, rong biển, đá trân châu, vỏ thông hoặc đất
sét nung trộn đều và thêm một ít đá vơi dolomitic, supe lân, các vi chất dinh
dưỡng.
Theo George Kueper (2004) xơ Dừa là một sản phẩm cung cấp giá thể
tốt cho hoa trồng chậu của Mỹ. Hầu hết xơ dừa được nhập từ Ấn Độ,
SriLanka, Philippines, Indonesia và Trung Mỹ. So với than bùn thì xơ dừa có
pH từ 5,5-6,8 và thường chứa các hàm lượng kali, natri, clo cao hơn than bùn.
Thời gian sử dụng xơ dừa cũng tăng lên gấp 2-4 lần so với than bùn, phân và
nước giữ ẩm tốt hơn than bùn vì khơng có cutin sáp ngăn cản.
Kết quả nghiên cứu của Jiang Qing Hai (2004) cho thấy, để cây sinh

trưởng, phát triển tốt khi phối chế các vật liệu trồng cây cần chú ý các điều
kiện cơ bản gồm các tính chất:
- Tính chất vật lý, chủ yếu là mức độ tơi xốp, thơng thống khí, khả
năng hấp thu, khả năng hút nước và độ dày của vật liệu.
- Tính chất hố học, chủ yếu là độ chua (trị số pH) và mức độ hút dinh
dưỡng. Nếu vật liệu có khả năng hấp thu giữ các ion dinh dưỡng khó bị nước
rửa trơi mới có thể giải phóng dinh dưỡng cung cấp cho cây, hoặc vật liệu
trồng có lượng trao đổi ion khá cao có thể tích nhiều dinh dưỡng. Nếu lượng
trao đổi ion khá thấp chỉ tích được một ít dinh dưỡng thì cần phải thường
xun bón phân. Đồng thời, lượng trao đổi ion cao cịn có thể hạn chế tốc độ
biến đổi trị số pH.
- Tính chất kinh tế, chủ yếu là mức độ hữu hiệu của vật liệu ni cấy có
thể sử dụng lại, dễ lấy, tiện cho việc trộn, sạch sẽ, không mùi, giá cả rẻ.


10

Tác giả Northen (1974)[16] cho rằng, giá thể gồm 3 phần vỏ thông xay
nhuyễn + 1 phần cát (hoặc 8 phần osminda xay nhuyễn) + một phần than vụn,
phù hợp cho việc cấy cây phong lan con lấy từ ống nghiệm . Giá thể này cho
tỉ lệ sống của cây lan con cao và sinh trưởng, phát triển tốt.
*Những nghiên cứu về phân bón và chế phẩm dinh dưỡng
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón hỗn hợp có tác
dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật riêng rẽ như
E2001. Các sản phẩm phân bón thế hệ mới chứa đựng một tập hợp các vi sinh
vật như cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng, phân giải phosphate khó
tan, kiểm soát vi sinh vật gây bệnh.... Hiệu quả sử dụng của các chế phẩm hỗn
hợp này đối với từng loại cây trồng và từng tổ hợp vi sinh vật không giống
nhau, do sự phong phú đa dạng của hệ vi sinh vật đất và tác động qua lại của
các vi sinh vật với nhau, cũng như đối với cây trồng và điều kiện môi trường.

Khi nghiên cứu về dinh dưỡng cho Phong lữ thảo, các nhà nghiên cứu thuộc
Đại học Aubum, Hoa Kỳ đã nhận thấy: để Phong lữ thảo cho hoa thường
xuyên và đạt năng suất cao thì việc thử nghiệm, phân tích và mơ tả những
thành phần quan trọng như đất, dinh dưỡng, nước…là những yếu tố thúc đẩy,
khắc phục kịp thời để tốc độ tăng trưởng của cây không bị ảnh hưởng bất lợi.
Các thành phần dinh dưỡng như Nitơ, Photpho, Kali... đóng vai trị quan trọng
trong quá trình sinh trưởng của cây, chúng phải được bổ sung theo một tỷ lệ
nhất định
1.3.2. Tình hình nghiên cứu hoa tại Việt Nam
*Những nghiên cứu về nhân giống
Trung tâm hoa cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp đã sử dụng kích
phát tố Thiên nơng với liều lượng 1g/l sau đó nhúng gốc khoảng 30 phút, rồi
đem phần dung dịch thuốc cịn lại pha thêm 5g phân bón lá, cứ 3 - 5 ngày
phun dung dịch này một lần có thể đảm bảo từ 80-90% số cây ra rễ với thời
gian rút ngắn so với đối chứng từ 3 - 4 ngày. Phương pháp này thường được
áp dụng cho việc nhân giống cúc vào mùa hè để đạt hiệu quả cao.


11

Năm 2002, Nguyễn Thị Kim Lý đã tiến một số biện pháp kỹ thuật nhân
giống cây hoa cúc trên các vùng trồng hoa Hà Nội, kết quả cho thấy: sử dụng
IBA 1000ppm làm dung dịch để giâm cành cúc CN97 trên nền đất phù sa nhẹ
chỉ tưới đẫm 1 lần và phun Zineb 0,1% sẽ cho tỷ lệ cây xuất vườn vào vụ Hè Thu đạt cao nhất.
Với các giống hoa trồng chậu, trồng thảm thì ngồi việc nhân giống
bằng hình thức gieo hạt thì giâm cành cũng là một trong những biện pháp kỹ
thuật thường được áp dụng rộng rãi. Trong đó giá thể là một trong những yếu
tố quyết định thời gian và chất lượng của cành giâm
* Những nghiên cứu về giá thể
Các nhà sinh học tại Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã nghiên cứu

hoàn thiện quy trình sản xuất giá thể tổng hợp trồng hoa Lan và cây cảnh từ
các phụ phế phẩm nông nghiệp có ở Lâm Đồng. Nhóm nghiên cứu của
Nguyễn Duy Hạng đã sử dụng các loại phụ phế phẩm như bã mía, lõi ngơ, vỏ
đậu phộng, vỏ cà phê… đều có thể tận dụng để sản xuất phân hữu cơ nhờ các
chủng vi sinh ưa nhiệt, có khả năng phân giải các phụ phế phẩm này thành
các giá thể để trồng hoa, khơng chỉ hoa Địa Lan mà cịn có thể áp dụng cho
nhiều loại hoa khác nhau và cây cảnh, thay thế cho các giá thể truyền thống.
Nhóm tác giả thiết lập quy trình sản xuất giá thể tổng hợp trồng hoa lan từ các
phụ phế phẩm nông nghiệp bằng biện pháp lên men vi sinh. Loại giá thể tổng
hợp này được sản xuất từ các chất hữu cơ có nguồn thực vật, hệ vi sinh vật
hiếu khí và các chất khoáng đa lượng, trung - vi lượng nên rất thích hợp cho
việc ni trồng lan và các loại hoa, cây cảnh khác. Dạng giá thể tổng hợp này
có thể sản xuất dưới dạng viên hoặc sợi với thành phần dinh dưỡng gồm: chất
hữu cơ 47%; Nitơ tổng số 0,8%; Phosphor 0,7%; Kali tổng số 1%; Oxid calci
0,3%; Oxid ma-nhê 0,3%; S (lưu huỳnh) 0,1% và thành phần vi lượng như
Zn, Mo, Mn, Cu, B… Ngoài ra, trong giá thể cịn có các hợp chất với hoạt
tính sinh học cao, giúp cho cây trồng chậu có tính kháng bệnh. Một số hệ vi
sinh vật có ích có khả năng ức chế một số loại nấm gây bệnh ở rễ.


12

Năm 2006, tác giả Huỳnh Thanh Hùng đã nghiên cứu các vật liệu làm
giá thể trồng lan Dendrobium tại Thủ Đức ở Thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyên vật liệu thí nghiệm gồm phân giun đất nguyên chất, than gỗ (làm đối
chứng), xơ dừa, mụn xơ dừa, mạt cưa, rễ lục bình và dớn. Chậu trồng Lan
(bằng đất nung) có kích thước 11,5cm x 6,5cm x 8cm. Giá thể được phối trộn
các vật liệu và chất kết dính được nén chặt tạo thành khối. Sau 5 tháng nghiên
cứu theo dõi ảnh hưởng của giá thể trồng Lan, tác giả có kết luận, trong các
vật liệu phối trộn phân bùn với xơ dừa, rễ lục bình và dớn cho cây Lan

Dendrobium sinh trưởng tốt nhất.
Hiện nay, nhiều loại hoa được nhân giống bằng phương pháp Invitro ,
giai đoạn sau nuôi cấy trong ống nghiệm quyết định tỷ lệ sống và chất lượng
cây, giá thể giâm đóng vai trị quan trọng. u cầu của giá thể là vừa đảm bảo
độ tơi xốp, có khả năng thốt nước tốt, có tính giữ ẩm cao đồng thời phải
hoàn toàn sạch các mầm bệnh.
Năm 2006, tác giả Lê Xuân Tảo đã tiến hành làm thí nghiệm để nghiên
cứu loại giá thể thích hợp cho 2 loại hoa trồng chậu là hồng tiểu muội, cúc
Indo. Các tác giả đã đưa ra kết luận, giá thể thích hợp dùng để trồng cúc Indo
trong chậu gồm: ¼ trấu hun +1/4 vụn dừa + ¼ phân chuồng giúp cho cây sinh
trưởng phát triển tốt, tỷ lệ nở hoa trên cây và độ bền tự nhiên ngày của cây
cao.
* Những nghiên cứu về phân bón và chế độ dinh dưỡng
Dinh dưỡng là một trong những yếu tố tác động mạnh đến sự sinh
trưởng, phát triển cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng. Việc cung cấp
dinh dưỡng hợp lý là biện pháp hữu hiệu để nâng cao năng suất chất lượng
hoa.
Gần đây, trong sản xuất người ta áp dụng phổ biến phương pháp dưỡng
ngoài rễ chủ yếu là bằng cách phun lên lá. Phương pháp này có những đặc điểm
sau:
- Tiết kiệm được phân.
- Tiết kiệm được nhiên liệu.


13

- Tiết kiệm được thời gian và sức lao động.
Thường nên phun vào lúc cây còn non khi màng lớp cutin chưa thật
phát triển, hoặc vào lúc cây sắp đạt cường độ cực đại của q trình trao đổi
(Hồng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm, 2000).

Pomior là một loại phân bón qua lá được phối hợp nhiều chất dinh
dưỡng đa, trung và vi lượng, được phối hợp với các chất phức hoạt nhằm tăng
khả năng bám dính và khả năng thẩm thấu nhanh chất dinh dưỡng vào trong
cây. Tác giả Hồng Ngọc Thuận đã kết luận, việc bón phân Pomior qua lá cho
hoa cúc và các loại hoa trồng chậu là rất cần thiết, làm giảm tỉ lệ rụng nụ, tăng
cường quá trình trao đổi chất, hình thành và phát triển nụ rất tốt.
Khi nghiên cứu sử dụng chế phẩm phân bón lá nhằm giảm lượng phân
bón gốc cho hoa Đồng tiền trồng tại Hải Phòng, tác giả Nguyễn Thị Kim
Thanh, Phạm Thị Thanh Thuỷ (2008) đã khẳng định: hoa Đồng tiền được bón
bằng phân bón lá có thể giảm lượng 1/3 lượng phân bón gốc mà khơng ảnh
hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cũng như chất lượng
của hoa Đồng tiền. Các tác giả cũng xác định: trong các chế phẩm nghiên cứu,
chế phẩm Pomior và Đầu trâu tỏ ra có hiệu quả hơn đối với cây hoa Đồng tiền
so với các loại chế phẩm phân bón lá. Cơng thức sử dụng chế phẩm Pomior
và Đầu Trâu đều có hiệu quả tốt đến các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển và
năng suất.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Linh (2005)[3] cây hoa Cúc nếu
được bón đầy đủ và cân đối các loại phân như phân hữu cơ (phân bắc, phân
chuồng, nước giải, phân vi sinh), phân vô cơ và các loại phân vi lượng (Cu,
Fe, Zn, Mn, Bo, Co) sẽ sinh trưởng phát triển tốt, cho năng suất và chất lượng
hoa cao.
Theo Nguyễn Quang Thạch (2006), Kỳ Nhân là loại phân bón mới
nhập nội từ Trung Quốc, thông qua Viện sinh học Nông nghiệp, hiện loại
phân này đang được thử nghiệm với một số cây hoa Cúc, đồng tiền…, đã đem
lại những kết quả đáng kể. Phân bón qua lá Kỳ nhân có tác dụng chủ yếu hoạt


14

hoá gen tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây, đồng thời cung cấp dinh

dưỡng cho cây trồng.
Năm 2006, tác giả Nguyễn Thị Hải khi nghiên cứu phân bón cho hai
giống cúc Vàng pha lê và cúc Mâm xôi đã khẳng định cơng thức bón Phân
chuồng + NPK + Kỳ nhân cho cây sinh trưởng, phát triển, chất lượng và độ
bền tự nhiên hoa cao nhất.
1.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào
1.4.1. Cơ sở kỹ thuật của ni cấy mơ, tế bào thực vật
+ Tính toàn năng của tế bào
Vào năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng
một tế bào bất kì của một sinh vật đa bào có khả năng tiềm tàng phát triển
thành một cá thể hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ, 1999).
Theo quan điểm sinh học hiện đại thì một tế bào riêng rẽ đã phân hóa
đều mang tồn bộ thông tin di truyền cần thiết và vừa đủ của cả cơ thể sinh
vật đó. Khi gặp điều kiện thuận lợi mỗi tế bào đó đều có thể phát triển thành
một cá thể hồn chỉnh. Đó là tính tồn năng của tế bào.
Bản chất của quá trình này là một q trình hoạt hóa, ức chế các gen.
Trong q trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số
gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình
chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong
cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển
của cơ thể thực vật ln được hài hịa. Mặt khác, khi nằm trong khối mơ bình
thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được
tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh khơng cịn nữa thì
các gen được hoạt hóa và q trình phân hóa sẽ xảy ra theo một chương trình
định sẵn (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2004)
+ Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào mô sinh thành các tế bào
mô chuyên hóa thực hiện các chức năng khác nhau. Ví dụ mô dậu làm

15

nhiệm vụ quang hợp, mơ bì làm nhiệm vụ bảo vệ, mô dẫn làm nhiệm vụ
dẫn nước và chất dinh dưỡng.
Tuy nhiên khi các tế bào đã biến đổi thành các tế bào có chức năng
chun biệt, khơng hẳn là chúng sẽ mất đi khả năng biến đổi. Trong trường
hợp cần thiết, ở mơi trường thích hợp chúng lại có khả năng trở về dạng tế
bào phôi sinh, phân chia mạnh mẽ. Q trình đó gọi là phản phân hóa,
ngược lại với q trình phân hóa tế bào.
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ tế bào thực vật, thực
chất là kết quả của quá trình phản phân hóa và phân hóa của tế bào. Kỹ thuật
ni cấy mơ xét cho đến cùng cũng chính là q trình phát sinh hình thái tế
bào có định hướng. Để điều khiển q trình này người ta thường bổ sung vào
mơi trường nuôi cấy các chất điều tiết sinh trưởng thuộc các nhóm auxin hay
cytokinin. Tỷ lệ các chất này khác nhau sẽ kích thích tạo ra các phát sinh hình
thái khác nhau (Murashige, 1980). Tỷ lệ auxin nhiều hơn thường tạo rễ, tỷ lệ
cytokinin nhiều hơn tạo chồi.
1.4.2. Môi trường ni cấy in vitro
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ như mẫu cấy,
ánh sáng, nhiệt độ, pH, ... nhưng phải kể đến là các thành phần trong mơi
trường ni cấy. Có thể nói các thành phần này có khả năng quyết định sự
thành cơng hay thất bại trong ni cấy mơ. Vì nó ảnh hưởng trực tiếp tới sự
sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật. Thành phần này
thay đổi tuỳ theo lồi và bộ phận ni cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng
tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần mơi trường cũng thay đổi. Mơi
trường cịn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Tuy nhiên, tất
cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng,
khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
 Khống đa lượng:

Nhu cầu khống của mơ, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so
với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung


16

cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và cs,
2009).
 Khoáng vi lượng:
Nhu cầu khống vi lượng trong ni cấy mơ thực vật in vitro là lĩnh
vực cịn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,
người ta khơng nghĩ đến việc bổ sung khống vi lượng vào mơi trường ni
cấy. Các thí nghiệm lúc đó thành cơng là do agar và hố chất dùng để pha mơi
trường khơng tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần
nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào
là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo... (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và
cs, 2009).
 Carbon và nguồn năng lượng:
Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng
hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối khơng phải từ q
trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng
đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose. Các nguồn
carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose,
rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém
hơn so với glucose và sucrose. Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối
với mô và tế bào ni cấy. Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến
một sốtham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp
trong tế bào nuôi cấy (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
 Vitamin:
Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng

trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình
biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài
vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Các vitamin
thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid
nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol (Murashige and Skoog, 1962; Vũ
Văn Vụ và cs, 2009).


17

 Các chất điều hịa sinh trưởng thực vật
Có 5 nhóm chất điều hồ quan trọng trong ni cấy mơ thực vật: auxin,
gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Miller là người đầu tiên nhận
thấy tỉ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hố cơ quan của tế bào thực vật
ni cấy. Cả auxin và cytokinin đều được bổ sung vào môi trường ni cấy để
kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ hormone sử dụng để kích thích sự tạo
chồi hay tạo rễ không giống nhau (Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ
và cs, 2009).
 Auxin
Auxin tự nhiên là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid
(IAA). Các chất có cấu trúc gần giống IAA và có cùng vai trò với IAA trong
vài cơ quan đều được gọi là auxin (như IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T và
phenoxyaxetic acid). Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi
non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở
nồng độ cao, auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành
lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh). Auxin ở nồng độ cao
kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng cũng cản trở sự tăng
trưởng của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các
vitamine (như thiamine mà rễ không tổng hợp được), amino acid (như
arginin), và nhất là các hợp chất ortho- diphenolic (như cafeic acid,

chlorogenic acid) (Murashige, 1980).
 Cytokinin
Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia.
Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA và
RNA. Hợp chất cytokinin đầu tiên được khám phá là kinetin, tiếp theo là
zeatin – một hợp chất có trong phần lớn thực vật và vài vi khuẩn, cấu trúc gần
giống kinetin nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 lần. Sau zeatin, hơn 30
cytokinin khác nhau đã được cô lập. Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ
một nhóm hợp chất, thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống
kinetin.Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều là các


18

aminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, thí dụ như BA. Cytokinin kích thích
sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động trên cả hai
bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Trong nuôi cấy các mô
nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu), auxin kích thích sự phân đơi
nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng khơng có sự phân vách; sự
phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp sự gia tăng
kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự
kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào lá trưởng thành. Trong các
nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ Auxin/Cytokinin (A/C) là một yếu tố
rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi. Như vậy,
cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự
đốikháng giữa auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin (giúp tạo chồi); sự cân bằng
giữa hai kiểu hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển
(Murashige, 1980).
 Một số thành phần khác
Ngoài năm thành phần cơ bản trên, người ta còn bổ sung một số chất

hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA, …) và một số chất có
thành phần khơng xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… vào môi
trường nuôi cấy. Các hợp chất hữu cơ không xác định: bổ sung nhiều chất
trích hữu cơ khác nhau vào mơi trường ni cấy thường mang lại kết quả
thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô. Các chất bổ sung này là: protein
hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước
cam, nước cà chua. Tuy nhiên, chỉ có nước dừa và protein hydrolysate được
sử dụng rộng rãi.
Than hoạt tính: việc bổ sung than hoạt tính vào mơi trường ni cấy có
tác dụng khử độc. Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cạn, hút
các chất điều hoà sinh trưởng và làm đen môi trường. Người ta cho rằng tác
dụng cản tăng trưởng của mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó
hút các chất điều hồ sinh trưởng trong mơi trường như: NAA, kinetin, BAP,
IAA và 2iP. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than


19

hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời
gian nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1999).
Yếu tố làm đặc môi trường: agar là chất thường sử dụng để tạo môi
trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật. Khi agar được
trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ở nhiệt độ 60 - 100ºC, đặc lại
khi nhiệt độ xuống cịn 45ºC vì vậy agar ổn định trong tất cả các điều kiện
nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa,
agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của môi trường
quyết định bởi lượng agar sử dụng và pH của mơi trường.
Có một số cơng thức mơi trường thường được sử dụng chủ yếu để nuôi
cấy mô và tế bào thực vật như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5
(Gamborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng khống đa

lượng cao và một số mơi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret,
Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng khống đa lượng thấp hơn
(Murashige and Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
1.4.3. Các bước chính trong nhân giống vơ tính in vitro
Theo Georger (1993), q trình nhân giống vơ tính in vitro bao gồm
các bước sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây
mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt
là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong
điều kiện mơi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh
hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả
năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vtro.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này
cần đảm bảo các yêu cầu tỉ lệ: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và
sinh trưởng tốt.


20

Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.
Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa,
cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá,… Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể
được sử dụng làm mẫu cấy.
Bước 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lượng thơng qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và
tạo phơi vơ tính. Trong bước này cần xác định mơi trường và điều kiện ngoại
cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất.

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh
sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng
nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường
nhân nhanh giàu xytokinin sang mơi trường khơng chứa chất điều tiết sinh
trưởng.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất địn (số
lá, số rễ, chiều cao cây)
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát
nước.
+ Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm
cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
1.4.4. Ý nghĩa của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả
kinh tế to lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân in
vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự
tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương
pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô ni cấy dễ phân hóa và sau đó dễ tái sinh hơn.


21

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp
khác khơng có được đó là: có thể nhân giống ở quy mô công nghiệp (kể cả
trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thơng thường), phương pháp
có hệ số nhân rất cao và cho ra cá cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di
truyền.

Với phương pháp này, nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng
tiền, ly ly, cúc,…), cây lương thực, thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ
dầu, mía, cà phê, cải dầu,…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây,..), cây lâm
nghiệp (bạch đàn, keo lai, thông, tùng, dứa sợi…) đã được phổ biến rất nhanh
vào trong sản xuất.


22

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Cây Phong lữ thảo (Pelargonium sp)
- Vật liệu nghiên cứu: hạt giống hoa Phong lữ thảo F1 do Bộ môn Đột
biến và ưu thế lai, Viện di truyền Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu được thực hiện tại phịng thí nghiệm Bộ mơn Đột biến và
ưu thế lai, Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam
- Thời gian : Từ tháng 12/2016 đến tháng 5/2017
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm của
hạt Phong lữ thảo:
+ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian xử lý cồn 70º đến
tỷ lệ nảy mầm của hạt Phong lữ thảo
Môi trường nền (MTN): MS + 30g/l đường + 6,5 g/l agar
STT

Công thức

Thời gian xử lý (phút)

1

CT1

2

2

CT2

3

3

CT3

4

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu nhiễm (%); tỉ lệ mẫu sạch (%); tỉ lệ mẫu chết (%)
- Tỉ lệ mẫu nhiễm(%) = Số mẫu nhiễm/ Tổng số mẫu cấy x 100%
- Tỉ lệ mẫu sạch(%) = Số mẫu sạch/ Tổng số mẫu cấy x 100%
- Tỉ lệ mẫu chết(%) = Số mẫu chết/ Tổng số mẫu cấy x 100%
2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu nhân nhanh in vitro chồi hoa Phong lữ thảo
+ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến hệ số
nhân chồi
CT 1: (Đ/C) MS + 100ml/l nước dừa + 30g/l đường + 6,5g/l agar(Nền)
CT 2: Nền + 0,5 mg/l BAP