Tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β- galactosidase từ sáp ong

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
VI KHUẨN LACTIC SINH β- GALACTOSIDASE TỪ SÁP ONG
Nguyễn Thị Vân, Lớp K60B, Khoa Sinh học
GVHD: TS. Trần Thị Thúy
Tóm tắt: Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hữu ích, được dùng chủ yếu trong các chế phẩm probiotics
để cải tạo khu hệ vi sinh vật đường ruột ở người và động vật nuôi. Nhằm mục đích tuyển chọn được
chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme β- galactosidase ứng dụng tạo chế phẩm probiotics,
chủng vi khuẩn lactic LT12 đã được phân lập và tuyển chọn từ sáp ong ruồi (Apis andreniformis) tự
nhiên ở tỉnh Điện Biên. Chủng vi khuẩn lactic LT12 có khả năng sinh enzyme β-galactosidase cao và
ổn định, phổ kháng khuẩn rộng, ức chế được cả vi khuẩn G+ (Bacillus sp.), cả vi khuẩn G(Salmonella sp. and E. coli). Chủng LT12 sinh enzyme β- galactosidase nội bào, hiệu suất sinh
enzyme cao nhất sau 36 giờ nuôi cấy tĩnh (đạt 0,45 IU/mL) ở 30ºC trong môi trường MRS dịch thể.
Enzyme β-galactosidase từ chủng này có hoạt tính tối ưu ở 30°C, pH 7. Nghiên cứu thay thế 25 – 50%
(v/v) môi trường MRS dịch thể bằng nước chiết bắp cải, thu được hoạt tính enzyme khả quan (0,3 –
0,37 IU/mL). Do vậy, nước chiết bắp cải có thể được sử dụng để thay thế một phần môi trường MRS
để giảm chi phí sản xuất.
Từ khóa: β-galactosidase, vi khuẩn lactic, sáp ong, probiotics, lactose.

I. MỞ ĐẦU
Sữa là loại thực phẩm giàu protein và khống chất, đóng vai trị quan trọng trong chế
độ dinh dƣỡng của mọi lứa tuổi. Khoảng 75% dân số thế giới, trong đó có khoảng 46%
ngƣời ở độ tuổi 50 trở lên, gặp tình trạng bất dung nạp lactose hay cịn gọi là thiểu năng
chuyển hóa lactose (khi uống sữa, xuất hiện hiện tƣợng đầy hơi, chƣớng bụng, nôn, tiêu
chảy). Lactose (β-D-galactopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranose) là loại đƣờng đơi
(disaccharide) có trong sữa của hầu hết các động vật có vú. Sau khi sử dụng sữa, lactose
đƣợc enzyme  -galactosidase trong ruột non của ngƣời xúc tác thủy phân thành glucose
và galactose. Khả năng tổng hợp β-galactosidase ở ngƣời bị mất dần khi qua tuổi cai sữa.
Kết quả là đại đa số ngƣời trƣởng thành và ngƣời già trên thế giới đều mắc bệnh thiểu năng
chuyển hóa lactose. Vì vậy, sản phẩm sữa cho những ngƣời không hấp thụ đƣợc lactose
thƣờng phải đƣợc xử lí với enzyme β-galactosidase.

β-galactosidase là một trong những enzyme đƣợc ứng dụng trong nhiều ngành công
nghiệp chế biến cũng nhƣ trong nghiên cứu sinh học phân tử, đặc biệt là trong cơng nghiệp
sữa. Enzyme β-galactosidase có thể đƣợc thu nhận từ động vật, thực vật cũng nhƣ vi sinh
vật. Trong đó, β-galactosidase đƣợc sản xuất từ vi khuẩn lactic có năng suất và hoạt tính cao,
ổn định hơn hẳn so với enzyme từ động vật và thực vật.
Xuất phát từ thực tế trên, căn cứ vào khả năng nghiên cứu của cơ sở chúng tôi đề
xuất thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase từ
sáp ong”.
Mục đích của nghiên cứu này là tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic sinh βgalactosidase cao, dùng trong các chế phẩm probiotics, góp phần sản xuất ra sản
phẩm sữa có hàm lƣợng lactose thấp sao cho mọi ngƣời đều có thể sử dụng đƣợc.

147


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

II. NỘI DUNG
1. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ sáp ong.
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase cao.
- Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sinh tổng hợp β-galactosidase từ chủng vi
sinh vật đã tuyển chọn.
2. Kết quả nghiên cứu
2.1. Kết quả phân lập
Từ 8 mẫu sáp ong đƣợc thu tại các địa điểm khác nhau, chúng tôi đã phân lập đƣợc
61 chủng vi khuẩn lactic, 17 chủng nấm men và 4 chủng vi khuẩn có bào tử.
2.2. Kết quả tuyển chọn
Từ 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc, tiến hành tuyển chọn sơ bộ các chủng có
khả năng sinh enzyme β-galactosidase bằng chỉ thị X-gal. Kết quả tuyển chọn đƣợc 12
chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme β-galactosidase: LT27, LT28, LT32, LT45,

LT48, LT10, LT15, LT24 LT12, LT13, LT14, LT31.
Căn cứ vào thời gian xuất hiện màu xanh của khuẩn lạc, để tiến hành xác định hoạt
độ enzyme -galactosidase của 6 chủng có hoạt tính cao nhất trên cơ chất ONPG (Bảng 1).
Bảng 1. Hoạt độ enzyme -galactosidase tổng số của 6 chủng tuyển chọn
Tên chủng

IU/mL

LT10

0,04

LT12

0,26

LT13

0,13

LT14

0,13

LT31

0,23

LT24

0,08

Trong số 6 chủng trên, chủng vi khuẩn lactic LT12 có hoạt tính enzyme βgalactosidase mạnh nhất. Vì vậy, chọn chủng này cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.3. Xác định vị trí của enzyme β-galactosidase trong tế bào chủng vi khuẩn
lactic LT12
Bảng 2. Vị trí của enzyme β- galactosidase trong tế bào chủng LT12

148

Vị trí enzyme

Hoạt tính tổng số (IU/mL)

Dịch ngoại bào

0%

Xoang chu chất

0%

Nội bào

67,96%

Thành, màng tế bào

32,04%

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

Kết quả ở Bảng 2 cho thấy: enzyme β-galactosidase của chủng LT12 đƣợc sinh tổng
hợp nội bào, không có mặt ở xoang chu chất và dịch ngoại bào. Kết quả này phù hợp với
các báo cáo của các tác giả khác về enzyme β-galactosidase của vi khuẩn lactic [5, 7, 9].

2.4. Một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactic LT12 đƣợc tuyển chọn
Tiến hành đánh giá đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lí, sinh hóa của chủng LT12 sau
24 giờ ni cấy ở 30°C trên môi trƣờng MRS dịch thể hoặc trên thạch đĩa. Kết quả thể hiện
ở Bảng 3.
Bảng 3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng LT12
Các chỉ tiêu của chủng LT12
Hình dạng

Que, cặp

Nhuộm Gram

G+

Hình dạng

Trịn, lồi

Màu sắc

Trắng sữa

Kích thƣớc khuẩn lạc, sau 48 giờ

ni cấy trên mơi trƣờng MRS

Đƣờng kính khuẩn lạc (d):
1 - 1,5 mm

1. Tế bào

2. Khuẩn lạc

Đặc điểm

3. Sinh bào tử

-

4. Hoạt tính catalase

-

5. Khả năng sinh khí từ glucose

+

6. Phổ ức chế với các
VSV kiểm định

Bacillus subtilis

+

Escherichia coli

+

Salmonella typhimurium

+

Lactobacillus plantarum

-

Chú thích: - : khơng; + : có

Hình 1. Hình ảnh khuẩn lạc và hình ảnh tế bào của chủng vi khuẩn lactic LT12
Kết quả ở Bảng 4 cho thấy: Ở pH 4,5, chủng LT12 sinh trƣởng mạnh nhất. Ở dải pH
từ 5 đến 8, chủng LT12 sinh axit mạnh (pH ban đầu đến pH cuối giảm từ 3,33 đến 1,02). Ở
149


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

pH 7, chủng LT12 cho hoạt tính enzyme lớn nhất, sau đó giảm dần. Kết quả này phù hợp
với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hải Yến [2]: ở pH 7, hoạt tính enzyme của
chủng BK16 lớn nhất, đạt 360,69 mU/mL và tác giả Nguyễn Thị Vân Linh và cộng sự [1]
trong nghiên cứu Thu nhận và tinh sạch β-galactosidase từ Lactobacillus acodophilus: Ở
pH 7-7,5 hoạt tính của enzyme là cao nhất, enzyme thơ sau khi tinh sạch đạt 1,534 IU/mL.
Theo Shaikh SA và cộng sự, ở pH 7, nấm Rhizomucor sp cũng cho hoạt tính enzyme cao
nhất.
2.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, khả năng sinh axit và hoạt độ

enzyme β-galactosidase của chủng LT12
Bảng 4. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, khả năng sinh axit
và hoạt độ enzyme β-galactosidase của chủng LT12
pH
ban đầu

pH cuối

OD620

Số lƣợng tế bào
tƣơng ứng
(x109)

Hoạt tính tổng số
IU/mL

3,5

3,41

3,071 ±0,003

1,86

0,02 ±0,008

4

3,67

4,931 ±0,013

2,98

0,12 ±0,017

4,5

3,87

5,603 ±0,007

3,38

0,44 ±0,019

5

3,98

5,533±0,002

3,34

0,25 ±0,003

5,5

4,1

4,614±0,011

2,79

0,33 ±0,002

6

4,09

3,915±0,004

2,36

0,15 ±0,019

6,5

4,27

4,262 ±0,009

2,57

0,33 ±0,006

7

4,35

3,633 ±0,012

2,19

0,47 ±0,017

7,5

4,48

3,442 ±0,006

2,09

0,38 ±0,018

8

4,67

3,572 ±0,017

2,16

0,37 ±0,020

Hình 2. Phổ ức chế của chủng LT12 với các VSV kiểm định
150

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, khả năng sinh axit và hoạt độ
enzyme  -galactosidase của chủng LT12
OD620, pH cuối

Hoạt tính tổng số (IU/ml)

7.0

0.5

6.0
0.4
5.0
0.3

4.0
3.0

0.2

2.0

0.1

OD

OD620620

pH cuối

1.0
0.0

0.0
20

30

40

50

Hoạt tính tổng số
(IU/ml)

60

Nhiệt độ (°C)

Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, khả năng sinh axit
và hoạt độ enzyme của chủng LT12
Kết quả biểu diễn ở hình 3 cho thấy: Ở các nhiệt độ khác nhau, quá trình sinh tổng
hợp enzyme gắn liền với quá trình sinh trƣởng của chủng LT12. Nhiệt độ tối ƣu cho sinh
trƣởng và sinh tổng hợp enzyme là 30°C, sau đó giảm dần khi nhiệt độ tăng, ngoài 45°C
khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme giảm đáng kể.
2.7. Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp β-galactosidase của chủng LT12
Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase của
chủng LT12 (Hình 4) cho thấy: quá trình sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase tỉ lệ thuận

với quá trình sinh trƣởng của chủng LT12 trong sƣốt thời gian nghiên cứu. Trong khoảng
từ 2 giờ đến 10 giờ, cùng với sự tăng nhanh sinh khối tế bào là sự giảm nhanh pH của dịch
ni (pH từ 6,21 xuống cịn 4,42).
Sau 16 giờ, q trình sinh trƣởng trong dịch ni đi vào giai đoạn ổn định, sự tăng
trƣởng chậm dần và dần đạt trạng thái cân bằng, pH của dịch nuôi giảm chậm và gần nhƣ
không đổi trong suốt thời gian cịn lại. Q trình sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase
tăng nhanh và đạt cực đại tại thời điểm 28 giờ, sau đó giảm dần. Enzyme β-galactosidase
của chủng LT12 đƣợc sinh tổng hợp trong suốt pha cân bằng và đạt cực đại ở cuối pha cân
bằng. Vì vậy, cần phải thu hoạch enzyme β-galactosidase trƣớc thời điểm 36 giờ là hiệu
quả nhất. Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ kết quả nghiên cứu khác về thời gian sinh tổng
hợp enzyme β- galactosidase của các chủng vi khuẩn lactic đã đƣợc các tác giả khác báo
cáo [1, 2].

151


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

OD620

Hình 4. Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase
của chủng LT12
2.8. Ảnh hưởng của các môi trường thay thế đến sinh trưởng, khả năng sinh axit
và hoạt độ enzyme của chủng LT12
Sau 24 giờ nuôi cấy ở 30°C trên môi trƣờng MRS dịch thể (pH 7) và các môi trƣờng
thay thế, chúng tôi thu đƣợc kết quả ở Bảng 5.
Kết quả bảng 5 cho thấy: Ở môi trƣờng MRS, chủng LT12 sinh trƣởng mạnh nhất.
Trong các mơi trƣờng thay thế với mục đích giảm giá thành thì mơi trƣờng nƣớc chiết bắp cải
cho thấy chủng LT12 phát triển mạnh nhất. Chính vì thế, chúng tơi tiếp tục nghiên cứu sự ảnh
hƣởng của các tỉ lệ môi trƣờng thay thế (MRS: bắp cải) đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng

hợp enzyme -galactosidase của chủng LT12. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 6.
Bảng 5. Ảnh hưởng của các môi trường thay thế đến sinh trưởng,
khả năng sinh axit và hoạt độ enzyme  -galactosidase của chủng LT12
Môi trƣờng
MRS
Bắp cải
Giá đỗ
Cải ngọt
Hành
pH cuối
4,47
3,86
4,34
4,26
4,58
OD620
4,481
0,903
0,701
0,038
0,679
IU/mL
0,41
0,08
0,06
0,03
0,05
Bảng 6. Ảnh hưởng tỉ lệ môi trường đến đến khả năng sinh trưởng
và sinh tổng hợp enzyme của chủng LT12
Tỉ lệ môi trƣờng

100% bắp cải
75% bắp cải: 25% MRS
50% bắp cải : 50% MRS
25% bắp cải : 75% MRS
100% MRS
152

OD620

pH cuối

0,87 ± 0,01
2,27 ± 0,01
3,15 ± 0,01
4,08 ± 0,01
4,28 ± 0,01

3,85 ± 0,01
4,10 ± 0,01
4,27±0,01
4,35± 0,02
4,44 ± 0,02

Hoạt tính tổng số
(IU/mL)
0,073 ± 0,007
0,024± 0,004
0,302 ± 0,013
0,301 ± 0,005
0,373 ± 0,001

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

Số liệu của bảng 6 cho thấy: Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme của
chủng LT12 là tốt nhất trên môi trƣờng MRS dịch thể. Tuy nhiên, ở các thí nghiệm trên
mơi trƣờng thay thế: 50% bắp cải: 50% MRS, 25% bắp cải: 75% MRS hoạt tính enzyme
thu đƣợc (~ 0,30 IU/mL), khơng khác biệt nhiều so với trong mơi trƣờng 100% MRS (0,37
IU/mL) nên có thể đƣợc sử dụng để thay thế môi trƣờng 100% MRS để giảm giá thành sản
xuất enzyme. Môi trƣờng 25% bắp cải: 75% MRS cũng giúp chủng vi khuẩn lactic LT12
sinh trƣởng khá tốt (OD620 ~ 4,1) so với môi trƣờng 100% MRS (OD620 ~ 4,3) nên cũng có
thể đƣợc sử dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic từ chủng vi khuẩn lactic LT12.

III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Từ các mẫu sáp ong thu đƣợc, phân lập đƣợc 61 chủng vi khuẩn lactic và từ đó tuyển
chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic LT12 có khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme βgalactosiadse tốt. Khả năng sinh enzyme của chủng LT12 là tốt nhất sau 36 giờ nuôi cấy
(0,45 IU/mL) và trong điều kiện môi trƣờng MRS dịch thể, pH = 7 và nhiệt độ là 30oC.
Chúng tơi cũng tìm đƣợc mơi trƣờng thay thế 25% bắp cải: 75% MRS làm tiền đề cho việc
sản xuất enzyme β-galactosiadse với giá thành rẻ hơn.
2. Kiến nghị
Chủng vi khuẩn lactic LT12 và enzyme β-galactosidase của chủng này có triển vọng
tốt trong công nghiệp sữa và tạo chế phẩm probiotics. Chủng này cần đƣợc tiếp tục nghiên
cứu sâu (định loại, lên men sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase, thử nghiệm trên động
vật và ngƣời, …) theo định hƣớng tạo chế phẩm probiotics.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]

Nguyễn Thị Vân Linh, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Bích Lam, Thu nhận và tinh
sạch -Galactosidase từ Lactobacillus acodophilus, Tạp chí Phát triển Khoa học và

Cơng nghệ, 15, số T3, 2012.

[2]

Nguyễn Thị Hải Yến, Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzyme galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16, Đồ án tốt nghiệp,
CNSHA-K44, 5-11, 16-21, 27-30.

[3]

Chang B-S., Mahoney R. R., Factors affecting thethermostability of β-galactosidase
(Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) in milk: a quantitative study, Journal
of Dairy Research 56, 785-792, 1989.

[4]

Emanuel V, Adrian V, Ovidiu P, Gheorghe C., Isolation of a Lactobacillus
plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders,
African Journal of Biotechnology, Vol. 4 (5), 403-408, 2005.

[5]

Fatma Isık U., Production of -galactosidase using lactic acid bacteria and
optimisation of fermentation parameters, A Thesis Submitted to the Graduate School
of Engineering and Science of Izmir Institute of Technology in Partial Fulfilment of
Requyrements for the Degree of MASTER OF SCIENCE in Biotechnology, 2007.
153


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

[6]

Furlan S.A., Schneider A.L.S., Merkle R., Jonas MFC. & Jonas R., Formulation of a
lactose-free, low-cost culture medium for the production of β- D galactosidase by
Kluyveromyces marxianus, Biotechnology Letters 22, 589-593, 2000.

[7]

Greenberg N. A., Wilder T., Mahoney R. R., Studies on the thermostability of lactase
(Streptococcus thermophilus) in milk and sweet whey, Journal of Dairy Research 52,
439-449, 1985.

[8]

Mahoney R.R., Galactosyloligosaccharides formation during lactose hydrolysis,
Food Chemistry, 63, 147-154, 1998.

[9]

Montanari1 G., Zambonelli1 C., Grazia L., Benevelli M., Chiavar C., Release of galactosidase from Lactobacilli, Food technol. Biotechnol, 38 (2), 129-133, 2000.

[10] Thi Thuy Tran, Gashaw M., Bo M., Rajni H., Kaul, A thermostable phytase from
Bacillus sp. MD2: cloning,expression and high-level production in Escherichia coli,
J Ind Microbiol Biotechnol, 279-287, 2009.

154