Tài liệu Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật pdf

1

Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật
Nguyễn Hoàng Lộc
Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế

1. Các hợp chất thứ cấp thực vật
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm
có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình
thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ.
Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là
sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ
cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002).
Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên
tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein,
nicotine, caffeine và morphine. Một số loài thực vậ
- - (họ
Solanaceae). Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần
giống nhau. Đôi khi toàn câ
- -
(họ
Taxaceae).
dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin ), một số khác tác dụng
dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994).
Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung
môi. Giống như những
, ví dụ monoterpene
chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị
isoprene (Lee 2001).
Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic

glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược
phẩm (Lee 2001).

2. Nuôi cấy tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá
trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào
vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây, sự phát triển của các
hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực
nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung
2

cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật
nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004).
Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp
từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt
quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao
như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy
tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy
nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài
trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên
ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ
cấp (Lee 2001).
Nuôi cấy tế bào huyền phù thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn
trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ
dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn
trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu
nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền
phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của
tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng
cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994).

Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) có ưu điểm
là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé
nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn
dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ
xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù
thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự
với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng.

3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật
Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp
nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa
về mặt thương mại. Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị
có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công
nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995). Kỹ thuật nuôi cấy tế
bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để
nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu
cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp
sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: (1) tổng hợp các hợp
chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với
khí hậu và điều kiện đất trồng; (2) phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất
thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng); (3) có thể chọn lọc các giống cây trồng cho
nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau; (4) với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của
3

tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên
cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật
cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999).
Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều
kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu
được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác

nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi
cấy (Rao 2000, Dixon 1999). Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi
ở những điều kiện đặc biệt như (1) chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy
thích hợp, (2) chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, (3) bổ sung tiền chất nuôi cấy và (4) các
chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004).
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH
môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và
ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều
(Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và cs 1999). Một vài sản phẩm tích
lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều
kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố
cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy.
Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là
một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài
hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó
phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên
(Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được
sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn
lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau
3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L.
Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng
hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số
hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng
lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ.
Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả
trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno và cs 1993). Chẳng hạn, bổ sung
phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra
rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích
lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi
cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004).

Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp
trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ
thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ
máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm
hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học
và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các
4

hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất
cao (DiCosmo và Tallevi, 1985).

4. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học
Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính
toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng
các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa.
Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề
đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của
điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn
để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công
nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực
vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này. Bảng 2 giới
thiệu sản phẩm của một số cây dược liệu quan trọng đã được sản xuất từ nuôi cấy callus và tế
bào huyền phù (Mulbagal and Tsay 2004).
Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả
năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm
1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử
nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng
taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có
tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác
(Wickremesinhe và Arteca 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm

mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị
hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng
này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ
thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị
ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm
(Cragg và cs 1993). Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu
sử dụng ngày càng tăng trong y học.
Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp
ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff 1991). Hiện nay,
việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng
dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Fett-
Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác
lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu
quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu
sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại
Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn
gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi
trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol.
Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của
cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được
5

sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt
động chính trong điều trị các bệnh về da. Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana
bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được
nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn
lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm
imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày. Benzylamino purine ở nồng
độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate
và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin.

Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai
trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ
tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung
vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày
nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng
hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi
phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần.
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ
của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn
tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato
(1981) C. japonica. Sau
đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10
-8
M
gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất rất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa
1994).
Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử
dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn
tiêu hóa, bệnh đái đường,
sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích
thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô callus P. ginseng để phân lập saponins và
sapogenins. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công
nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung
nghiên cứu nhiều nhất.
Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách
gây nhiễm chủng A
4
của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một
spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm
lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ

không biến nạp chủng A
4
8 tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng
của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy
bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần
so với đối chứng.
Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của
cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình
tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi
trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho
tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối
6

lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay
đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp.
Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa
nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn
chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid
glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs
1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G.
davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế
bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L
kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp
chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày
nuôi cấy.
Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây
Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia
mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với việc hình
thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp
được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus

sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân
tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô).
Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus
tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường
có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003).
chi thuộc họ Solanaceae
như: Duboisia, Scopolia, Atropa, Hyoscyamus và Datura.
những
năm 1960 (Misawa, 1994). Tuy nhiên, hàm lượng của scopolamine và hyoscyamine trong tế
bào nuôi cấy thường rất thấp. Sau này, Tabata và cs (1971) đã bổ sung tropic acid vào dịch
huyền phù nuôi cấy Scopolia japonica
lên 15 lần.
Shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây Lithospermum
erythrorhizon . Tuy nhiên, người ta đã tạo
được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn
chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ
nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin.
Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây
Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn
xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984).
Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung
cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác. Nuôi
cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm
1981 và 1982. Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcohol
7

và b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ
sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0.013% theo
khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor chỉ sản xuất được 0.0035%
podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium

album đã sản xuất được 0.3% podophyllotoxin.

Kết luận
Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước
tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự
hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình
chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại.
Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y-dược ngày càng tăng nhưng sản
lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của
công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp
chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất
phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất
cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện ở
các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các
chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng đã cho thấy
các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các
chất trao đổi thứ cấp.

Bảng 2. Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Mulbagal and
Tsay 2004)

Loài thực vật
Hợp chất thứ cấp
Dạng nuôi
cấy
Tham khảo
Agave amaniensis
Saponins
Callus
Andrijany và cs 1999

Ailanthus altissima
Alkaloids
Huyền phù
Anderson và cs 1987
Ailanthus altissima
Canthinone alkaloids
Huyền phù
Anderson và cs 1986
Allium sativum
Alliin
Callus
Malpathak và David 1986
Aloe saponaria
Tetrahydroanthracene
glucosides
Huyền phù
Yagi và cs 1983
Ambrosia tenuifolia
Altamisine
Callus
Goleniowski và Trippi
1999
Anchusa officinalis
Rosmarinic alkaloids
Huyền phù
De-Eknamkul và Ellis
1985
Brucea javanica
Canthinone alkaloids
Huyền phù

Liu và cs 1990
Bupleurum falcatum
Saikosaponins
Callus
Wang và Huang 1982
8

Camellia sinensis
Theamine, dẫn xuất của
-glutamyl
Huyền phù
Orihara và Furuya 1990
Canavalia ensiformis
L-Canavanine
Callus
Ramirez và cs 1992
Capsicum annuum
Capsaicin
Huyền phù
Johnson và cs 1990
Cassia acutifolia
Anthraquinones
Huyền phù
Nazif và cs 2000
Catharanthus roseus
Indole alkaloids
Huyền phù
Moreno và cs 1993
Catharanthus roseus
Catharanthine

Huyền phù
Zhao và cs 2001
Choisya ternata
Furoquinoline alkaloids
Huyền phù
Sejourne và cs 1981
Chrysanthemum
cinerariaefolium
Pyrethrins
Callus
Rajasekaran và cs 1991
Chrysanthemum
cinerariaefolium
Chrysanthemic acid và
pyrethrins
Huyền phù
Kuel và cs 1985
Cinchona L.
Alkaloids
Huyền phù
Koblitz và cs 1983
Cinchona robusta
Robustaquinones
Huyền phù
Schripsema và cs 1999
Cinchona sp.
Anthraquinones
Huyền phù
Wijnsma và cs 1985
Cinchona succirubra

Anthraquinones
Huyền phù
Khouri và cs 1987
Citrus sp.
Naringin, Limonin
Callus
Barthe và cs 1987
Coffea arabica
Caffeine
Callus
Waller và cs 1983
Cornus kousa
Polyphenols
Huyền phù
Ishimaru và cs 1993
Corydalis ophiocarpa
Isoquinoline alkaloids
Callus
Iwasa và Takao 1982
Croton sublyratus
Plaunotol
Callus
Morimoto và Murai 1989
Cruciata glabra
Anthraquinones
Huyền phù
Dornenburg và Knorr
1996
Cryptolepis buchanani
Cryptosin

Callus
Venkateswara và cs 1987
Digitalis purpurea
Cardenolides
Huyền phù
Hagimori và cs 1982
Dioscorea deltoidea
Diosgenin
Huyền phù
Heble và Staba 1980
Dioscorea doryophora
Diosgenin
Huyền phù
Huang và cs 1993
Duboisia leichhardtii
Tropane alkaloids
Callus
Yamada và Endo 1984
Ephedra spp.
L-Ephedrine, D-
pseudoephedrin
Huyền phù
O’Dowd và cs 1993
Eriobotrya japonica
Triterpenes
Callus
Taniguchi và cs 2002
Eucalyptus tereticornis
Sterol và hợp chất
phenolic

Callus
Venkateswara và cs 1986
Eucommia ulmoides
Chlorogenic acid
Huyền phù
Wang và cs 2003
9

Fumaria capreolata
Isoquinoline alkaloids
Huyền phù
Tanahashi và Zenk 1985
Gentiana sp.
Secoiridoid glycosides
Callus
Skrzypczak và cs 1993
Ginkgo biloba
Ginkogolide A
Huyền phù
Carrier và cs 1991
Glehnia littoralis
Furanocoumarin
Huyền phù
Kitamura và cs 1998
Glycyrrhiza echinata
Flavonoids
Callus
Ayabe và cs 1986
Glycyrrhiza glabra var.
glandulifera

Triterpenes
Callus
Ayabe và cs 1990
Hyoscyamus niger
Tropane alkaloids
Callus
Yamada và Hashimoto
1982
Isoplexis isabellina
Anthraquinones
Huyền phù
Arrebola và cs 1999
Linum flavum
5-Methoxypodophyllo-
toxin
Huyền phù
Uden và cs 1990
Lithospermum erythrorhizon
Dẫn xuất của shikonin
Huyền phù
Fujita và cs 1981
Lithospermum erythrorhizon
Dẫn xuất của shikonin
Huyền phù
Fujita và cs 1990
Lycium chinense
Cerebroside
Huyền phù
Jang và cs 1998
Morinda citrifolia

Anthraquinones
Huyền phù
Zenk và cs 1975
Morinda citrifolia
Anthraquinones
Huyền phù
Bassetti và cs 1995
Mucuna pruriens
L-DOPA
Huyền phù
Wichers và cs 1993
Mucuna pruriens
L-DOPA
Callus
Brain K. R. 1976
Nandina domestica
Alkaloids
Callus
Ikuta và Itokawa 1988
Nicotiana rustica
Alkaloids
Callus
Tabata và Hiraoka 1976
Nicotiana tabacum
Nicotine
Huyền phù
Mantell và cs 1983
Nothapodytes foetida
Camptothecin
Callus

Thergane và cs 2003
Ophiorrhiza pumila
Camptothecin dạng
alkaloids
Callus
Kitajima và cs 1998
Panax ginseng
Saponins và sapogenins
Callus
Furuya và cs 1973
Panax notoginseng
Ginsenosides
Huyền phù
Zhong và Zhu 1995
Papaver bracteatum
Thebaine
Callus
Day và cs 1986
Papaver somniferum
Morphine, Codeine
Huyền phù
Siah và Doran 1991
Peganum harmala
Β-Carboline alkaloids
Huyền phù
Sasse và cs 1982
Phytolacca americana
Betacyanin
Huyền phù
Sakuta và cs 1987

Picrasma quassioides
Quassin
Huyền phù
Scragg và Allan, 1986
Podophyllum hexandrum
Podophyllotoxin
Huyền phù
Uden và cs 1989,
Chattopadhyay và cs
10

2002
Polygala amarella
Saponins
Callus
Desbene và cs 1999
Portulaca grandiflora
Betacyanin
Callus
Schroder và Bohm 1984
Polygonum hydropiper
Flavonoids
Huyền phù
Nakao và cs 1999
Ptelea trifoliata
Dihydrofuro [2,3-b]
quinolinium
alkaloids
Callus
Petit-Paly và cs 1987

Rauwolfia sellowii
Alkaloids
Huyền phù
Rech và cs 1998
Rauwolfia serpentina
Reserpine
Huyền phù
Yamamoto và Yamada,
1986
R. serpentina × Rhazya
stricta
3-Oxo-rhazinilam
Callus
Gerasimenko và cs 2001
Ruta sp.
Acridone, furoquinoline
alkaloids và coumarins
Callus
Baumert và cs 1992
Salvia fruticosa
Rosmarinic acid
Callus và
huyền phù
Karam và cs 2003
Salvia miltiorrhiza
Lithospermic acid B và
rosmarinic acid
Callus
Morimoto và cs 1994
Salvia miltiorrhiza

Cryptotanshinone
Callus
Morimoto và cs 1994
Sapium sebiferum
Tannin
Callus và
huyền phù
Neera và Ishimaru, 1992
Scopolia parviflora
Alkaloids
Callus
Tabata và cs 1972
Scutellaria columnae
Phenolics
Callus
Stojakowska và Kisiel
1999
Solanum chrysotrichum
Spirostanol saponin
Huyền phù
Villarreal và cs 1997
Solanum laciniatum
Solasodine
Huyền phù
Chandler và Dodds 1983
Solanum paludosum
Solamargine
Huyền phù
Badaoui và cs 1996
Stizolobium hassjoo

L-DOPA
Huyền phù
Huang và cs 2002
Tabernaemontana
divaricata
Alkaloids
Huyền phù
Sierra và cs 1992
Taxus spp.
Taxol
Huyền phù
Wu và cs 2001
Taxus baccata
Taxol, baccatin III
Huyền phù
Cusido và cs 1999
Taxus cuspidata
Taxoids
Huyền phù
Ketchum và cs 2003
Tecoma sambucifolium
Phenylpropanoid
glycosides
Callus
Pletsch và cs 1993
11

Thalictrum minus
Berberin
Huyền phù

Kobayashi và cs 1987
Thalictrum minus
Berberin
Huyền phù
Nakagawa và cs 1986
Torreya nucifera var.
radicans
Diterpenoids
Huyền phù
Orihara và cs 2002
Trigonella foenumgraecum
Saponins
Huyền phù
Brain và Williams 1983


Tài liệu tham khảo
1. Berlin J, Sasse F (1985) Selection and screening techniques for plant cell cultures. Advanced
Biochemistry and Engineering 31: 99-132.
2. Bruneton J (1995) Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. Intercept UK, 522.
3. Choi KT, Ahn IO, Park JC (1994) Production of ginseng saponin in tissue culture of ginseng
(Panax ginseng C.A. Mayer). Russian Journal of Plant Physiology. 41: 784-788.
4. Chueh FS, Chen CC, Sagare AP, and Tsay HS (2000) Quantitative determination of secoiridoid
glucoside in in vitro propagated plants of Gentiana davidii var. formosana by high performance
liquid chromatography. Planta Medica 67: 70-73.
5. Cragg GM, Schepartz SA, Suffuess M, Grever MR (1993) The taxol supply crisis. New NCI
policies for handling the large-scale production of novel natural product anticancer and anti-HIV
agents, Journal of Natural Products 56: 1657-1668.
6. Dicosmo F and Tower GHN (1984) Stress and secondary metabolism in ciltured plant cells. In:
Recent Adv Phytochem 18 (eds) Timmerman SC and Loewus FA. Plenum Press, NewYork: 97-

175.
7. Dicosmo F, Misawa M (1995) Plant cell and tissue culture: Alternatives for metabolite production,
Biotechnology Advance 13 (3): 425-453.
8. Dixon RA (1999) Plant natural products: the molecular genetic basis of biosynthetic diversity.
Current Opinion in Biotechnology 10: 192-197.
9. Fett-Neto AG, Stewart JM, Nicholson SA, Pennington JJ, and DiCosmo F (1994) Improved taxol
yield by aromatic carboxylic acid and and amino acid feeding to cell cultures of T. cuspidata.
Biotechnology Bioengineering 44: 967-971.
10. Fischer R, Liao YC, Hoffmann K, Schillberg S, Emans N (1999) Molecular farming of
recombinant antibodies in plants. Biological Chemistry 380: 825-839.
11. Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973) Isolation of saponins and sapogenins from
callus tissue of Panax ginseng. Chem Pharm Bull 21(1): 98-101.
12. Goleniowski M, Trippi VS (1999) Effect of growth medium composition on psilostachyinolides
and altamisine production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 56: 215-218.
13. Hu ZB and Alfermann AW (1993) Diterpenoid production in hairy root cultures of Salvia
miltiorrhiza. Phytochemistry 32: 699-703.
14. Issell BF, Rudolph AR, and Louie AC (1984) Etoposide (VP-16-213): An overview. In BF Issell,
FM Muggia, and SK Carter (eds.), Etoposide (VP-16-213)-Current status and new developments.
Academic Press Inc, Orlando.
15. Kadkade PG (1981) Formation of podophyllotoxin by Podophyllum peltatum tissue cultures.
Naturwiss 68: 481-482.
16. Kadkade PG (1982) Growth and podophyllotoxin production in callus tissues of Podophyllum
peltatum. Plant Sci Lett 25: 107-115.
17. Lee JM (2001) Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA.
12

18. Lee CY, Lin FL, Yang CT, Wang LH, Wei HL, and Tsay HS (1995) Taxol production by cell
cultures of Taxus mairei. Proc. Symp. on Development and Utilization of Resources of Medicinal
Plants in Taiwan, Taiwan Agricultural Research Institute, Taiwan. TARI Special Publication 48:
137-148.

19. Lee CWT, Shuler ML (2000) The effect of inoculum density and conditioned medium on the
production of ajmalcine and catharanthine from immobilizes Catharanthus roseus cells.
Biotechnology Bioengineering 67: 61-71.
20. Merkli A, Christen P, and Kapetanidis I (1997) Production of diosgenin by hairy root cultures of
Trigonella foenum-graecum L. Plant Cell Reports 16(9): 632-636.
21. Misawa M (1994), “Plant tissue culture: An alternative for production of useful metabolite”, FAO
Agricultural services bulletin, 108.
22. Miyasaka H, Nasu M, and Yoneda K (1989) Salvia miltiorrhiza: In vitro production of
cryptotanshinone and feruginol. In: Biotechnology in agriculture and forestry. 7, Medicinal and
Aromatic Plants II ed. By Bajaj YPS. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg: 417- 430.
23. Moreno PRH, Heijden R, Verpoorte R (1993) Effect of terpenoid precusor feeding and elicitation
on formation of indole alkaloids in cell suspension cultures of Catharanthus roseus. Plant Cell
Reports, 12: 702-705.
24. Mulbagal V, Tsay HS (2004) Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the
production of biologically important secondary metabolites. International Journal of Applied
Science and Engineering 2(1): 29-48.
25. Rao SR (2000) Biotechnological production of phyto-pharmaceuticals. Journal of Biochemistry
Molecular Biology Biophysics 4: 73-102.
26. Shimomura K, Kitazawa T, Okamura N, and Yagi A (1991) Tanshinone production in
adventitious roots and regenerates of Salvia miltiorrhiza. Journal of Natural Products 54: 1583.
27. Skrzypczak L, Wesolowska M, and Skrzypczak E (1993) Gentiana species XII: In vitro culture,
regeneration, and production of secoirridoid glucosides. In Y.P.S. Bajaj (ed.), Biotechnology in
Agriculture and Forestry, Vol. 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. Berlin, Heidelberg:
Springer-Verlag, 172-186.
28. Slichenmyer WJ, Von Horf DD (1991) Taxol: a new and effective anticancer drug. Anti-Cancer
Drugs 2: 519-530.
29. Smollny T, Wichers H, De Rijk T, Van Zwam A, Shasavari A, and Alfermann AW (1992)
Formation of lignans in suspension cultures of Linum album. Planta Med Suppl 58: A622.
30. Srinivasan V, Pestchanker L, Hirasuma MT, Taticek RA, and Shuler ML (1995) Taxol production
in bioreactors; kinetics of biomass accumulation, nutrient uptake, and taxol production by cell

suspensions of Taxus baccata. Biotechnol Bioeng 47: 666-676.
31. Silvestrini A, Pasqua S, Botta B, Monacelli B, Heijden R, Verpoorte R (2002) Effect of alkaloid
precusor feeding on a Camptotheca acuminata cell line. Plant Physiology and Biochemistry 40:
749-753.
32. Tabata M, Yamamoto H, and Hiraoka N (1972) Les Cultures de Tissus de Plantes. Colloques
internationaux de CNRS. No 193.
33. Tsay HS, Chang WD, Chen CC, and Chang YS (1994) The production of imperatorin from
Angelica dahurica var. formosana by cell suspesion culture. J Agric Assoc China. 168: 32-48.
34. Tsay HS (1999) Tissue culture technology of medicinal herbs and its application of medicinal
herbs and its application in Taiwan. In: CH Chou, GR Waller, and C Reinhardt (eds.), Biodiversity
and Allelopathy: from Organisms to Ecosystems in the Pacific. Academia Sinica, Taipei, Taiwan.
137-144.
35. Verpoorte R (1998) Exploration of nature’s chemodiversity: the role of secondary metabolites as
leads in drug development. Drug Discovery Today 3: 232-238.
13

36. Yamada Y, and Sato F (1981) Production of berberine in cultured cells of Coptis japonica.
Phytochemistry 20: 545-547.
37. Yamamoto Y, Mizuguchi R, Yamada Y (1982) Selection of a high and stable pigment-producing
strain in cultured Euphorbia millii cells. Theoretical and Applied Genetics 61: 113-116.
38. Yeh FT, Huang WW, Cheng CC, Na C, and Tsay HS (1994) Tissue culture of Dioscorea
doryophora Hance. II. Estabilshment of suspension culture and the measurement of diosgenin
content. Chinese Agronomy Journal 4: 257-268.
39. Wang HQ, Yu JT and Zhong JJ (1999) Significant improvement of taxane production in
suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose feeding strategy. Process Biochemistry 35: 479-
483.
40. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, and McPhail AT (1971) Plant antitumor agents VI.
The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus
brevifolia. Journal of American Chemical Society 93: 2325-2327.
41. Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus cultures: Intiation, growth optimization,

characterization and taxol production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 35: 181-193.
42. Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1994) Taxus cell suspension cultures: optimizing growth and
production of taxol. Journal of Plant Physiology 144: 183-188.
43. Woerdenbag HJ, Van Uden W, Frijlink HW, Lerk CF, Pras N, and Malingre ThM (1990)
Increased podophyllotoxin production in Podophyllum hexandrum cell suspension cultures after
feeding coniferyl alcohol as a -cyclodextrin complex. Plant Cell Rep 9: 97-100.
44. Wu CT, Vanisree M, Satish MN, Chen CL, Yang TF, and Tsay HS (2003) Isolation and
quantitative analysis of cryptotanshinone, an active quinoid diterpene formed in the callus of
Salvia miltiorrhiza Bunge. Biological and Pharmaceutical Bulletin 26(6): 845-848.
45. Zheng HZ, Dong ZH, and She J (1997) Longdan. In: Modern Study of Traditional Chinese
Medicine 2: 1398-1408. Beijing Xue Yuan Press, Beijing, China.