Tài liệu SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN MONODON BACULOVIRUS TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MALACHITE GREEN, NHUỘM HAEMATOXYLIN VÀ EOSIN, POLYMERASE CHAIN REACTION docx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN




QUẢNG THỊ MỸ DUYÊN




SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN
MONODON BACULOVIRUS TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
MALACHITE GREEN, NHUỘM HAEMATOXYLIN VÀ
EOSIN, POLYMERASE CHAIN REACTION






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ
Ø Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Cô Đặng Thị Hoàng
Oanh, Chị Trần Việt Tiên đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực
hiện luận văn.
Ø Tôi xin cảm ơn đến tất cả các thầy, cô, anh chị cán bộ khoa Thủy Sản-
Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện cho tôi học tập
và hoàn thành luận văn này.
Ø Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến các bạn lớp Bênh Học Thủy Sản K31
và các bạn bè xung quanh đã quan tâm, giúp đở tôi trong suốt thời gian
học tập tại đây.
Ø Cuối cùng, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến những người thân trong
gia đình đã hết lòng quan tâm, chăm sóc và động viên tôi trong suốt thời
gian qua.
Cần Thơ, ngày 14 tháng 05 năm 2009
Quảng Thị Mỹ Duyên

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện nhằm so sánh kết quả phát hiện Monodon
Baculovirus trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng 3 phương pháp nhuộm
Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction.
Đối với 30 mẫu tôm giống được phân tích bằng 3 phương pháp này thì có 8/30
mẫu (chiếm 27%) cho kết quả dương tính ở cả 3 phương pháp và 22/30 mẫu
(chiếm 73%) có sự khác biệt ở 3 phương pháp. Đối với 11 mẫu tôm thịt thì có
3/11 mẫu cho kết quả dương tính ở 2 phương pháp nhuộm Malachite Green và
Polymerase Chain Reaction. Riêng ở phương pháp nhuộm Haematoxylin và
Eosin thì 11/11 mẫu đều cho kết quả tế bào gan tụy bình thường. Qua kết quả này
cho thấy ở phương pháp Polymerase Chain Reaction thì tiện lợi hơn phương pháp
nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin trong việc phát hiện
mầm bệnh trong bất kỳ giai đoạn nào. Trong khi đó, ở phương pháp nhuộm
Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin thì lại có ý nghĩa trong việc
chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh, nhưng ở phương pháp nhuộm Malachite Green
thì thời gian thực hiện ngắn và đơn giản nên cho kết quả chẩn đoán nguyên nhân
gây bệnh ở cơ quan đích nhanh hơn nhuộm Haematoxylin và Eosin. Do đó, tùy
mục đích nghiên cứu mà chọn phương pháp phát hiện bệnh cho phù hợp.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC . iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v
DANH SÁCH BẢNG vi
DANH SÁCH HÌNH vii
CHƯƠNG1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu 2
1.3 Nội dung 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3
2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 3
2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó 4
2.4 Bệnh MBV 7
2.4.1 Tác nhân gây bệnh 7
2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý 8
2.4.3 Phân bố 8
2.4.4 Loài và giai đoạn cảm nhiễm 9
2.4.5 Phương thức lây nhiễm 9
2.4.6 Chẩn đoán bệnh 9
2.4.7 Phòng bệnh 10

2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green 10
2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin) 10
2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học 10
2.6.2 Ứng dụng mô học bệnh học trong thủy sản 11
2.7 Phương pháp PCR 12
2.7.1 Sơ lược về PCR 12
2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 13
2.7.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản 14
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu 15
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15
3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu 15
3.2.2.1 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Malachite Green 15
3.2.2.2 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin . 15
3.2.2.3 Dụng cụ dùng trong phương pháp PCR 15
3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 16
3.2.3.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green 16
3.2.3.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin 16
3.2.3.3 Phương pháp PCR 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu 16
3.3.1 Phương pháp thu mẫu 16
3.3.2 Phương pháp phân tích 17
3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green 17
3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin 17
3.3.2.3 Phương pháp PCR 20
3.4 Phương pháp xữ lý số liệu 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống bằng phương pháp nhuộm MG,
nhuộmH&E và PCR. 23
4.1.1 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm MG 23
4.1.2 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm H&E 25
4.1.3 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp PCR. 26
4.2 So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương
pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR 28
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề xuất 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC 36

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL Đồng Bằng sông cửu Long
NTTS Nuôi Trồng Thủy Sản
NCTS Nghiên Cứu Thủy Sản
PL Postlarvae
MBV Monodon Baculovirus
WSSV White Spot Syndrome Virus
MG Malachite Green
H&E Haematoxylin và Eosin
PCR Polymerase Chain Reaction

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vi
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson
’
s AFA 17
Bảng 3.2: Hóa chất sử dụng trong quy trình xử lý mẫu 18
Bảng 3.3: Các hóa chất sử dụng trong quy trình nhuộm mẫu 19
Bảng 4.1: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm giống bằng phương pháp
nhuộm MG, H&E và PCR 30
Bảng 4.2: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm thịt bằng phương pháp pháp
nhuộm MG, H&E và PCR 31

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vii
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 4.1: Tôm giống bị nhiễm bệnh MBV có kích cở không đều nhau 23
Hình 4.2: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương
pháp nhuộm MG 23
Hình 4.3: Tôm thịt bị nhiễm bệnh MBV 24
Hình 4.4: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng MG 24
Hình 4.5: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng MG 25
Hình 4.6: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương
pháp nhuộm H&E 26
Hình 4.7: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm
H&E 26
Hình 4.8: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm

H&E 26
Hình 4.9: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR 27
Hình 4.10: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp
PCR 27
Hình 4.11: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR 28
Hình 4.12: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp
PCR 28

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Ngày nay, thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và đem lại
hiệu quả kinh tế đáng kể cho đất nước. Trong đó, nuôi trồng thủy sản ở Đồng
Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm trên 70% sản lượng nuôi trồng và trên
60% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước (Nguyễn Chu Hồi,
2008). Trong các đối tượng nuôi chính thì tôm sú là đối tượng nuôi đã đem lại
hiệu quả kinh tế rất cao trong công tác xóa đói giảm nghèo và góp phần nâng
cao chất lượng cuộc sống cho người dân của vùng.
Phong trào nuôi tôm sú thương phẩm ở ĐBSCL phát triển rầm rộ từ năm 2000
khi chính phủ ban hành nghị quyết 09. Diện tích tôm nuôi hiện nay đã tăng
gấp đôi so với năm 2000 (từ 250.000 ha lên 540.000 ha và chủ yếu là tôm sú
(538.800 ha) tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang,
Trà Vinh, Tiền Giang, Bến Tre (Bộ NN&PTNN, 2008). Song song với việc
gia tăng diện tích, sản lượng tôm nuôi thì tình hình dịch bệnh cũng đang diễn
biến phức tạp và gây ra những tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi. Những
bệnh chính thường xuất hiện trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL gồm bệnh do vi
khuẩn như bệnh phát sáng, bệnh đen mang, nghiêm trọng hơn là các bệnh do
virus như White Spot Syndrome Virus (WSSV), Monodon Baculovirus

(MBV), Yellow Head Disease (YHD),… Trong đó, Monodon Baculovirus là
một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên tôm sú, đặc biệt là gây tỷ
lệ chết cao cho ấu trùng, đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng
hơn. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của Monodon Baculovirus còn tùy thuộc
vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Liao et al.,
1992 được trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo, 1997). Do hiện nay chưa có thuốc
đặc trị nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết.
Các phương pháp như nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và
Eosin giúp cho việc chẩn đoán bệnh dựa trên những biến đổi bệnh lý dưới mức
độ vi thể của tổ chức cơ quan. Bên cạnh đó, phương pháp Polymerase Chain
Reaction chẩn đoán bệnh ở cấp độ phân tử, giúp phát hiện kịp thời nhằm hạn
chế rũi ro do dịch bệnh ở mức thấp nhất. Do đó đề tài “So sánh kết quả phát
hiện Monodon Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng phương
pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin và
Polymerase Chain Reaction” được thực hiện.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
1.2 Mục tiêu
So sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên tôm sú bằng 3 phương
pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin và Polymerase
Chain Reaction.
1.3 Nội dung
Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:
(i) Phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm giống bằng phương
pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin,
Polymerase Chain Reaction.
(ii) Phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm thịt bằng phương pháp
nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase
Chain Reaction.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

3
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới hai khu vực nuôi tôm lớn nhất là Đông Nam Á và Châu
Mỹ. Sản lượng tôm nuôi ở Châu Á chiếm khoảng 80% sản lượng toàn cầu.
Các nước chiếm sản lượng tôm nuôi cao là: Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản,
Philippin, In-đô-nê-xi-a, Thái Lan, Hàn Quốc, Bănglađet, Việt Nam, Nauy ;
có khoảng 20 loài tôm được nuôi trên thế giới. Trong đó, các loài tôm được
nuôi nhiều nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm nương (Penaeus
chinensis), tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). Riêng 3 loài tôm này
chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Sản lượng tôm nuôi năm
2000 của thế giới là 1.087.111 tấn chiếm khoảng 66% giáp xác nuôi, giá trị
6,880 tỷ USD, chiếm 73,4% trong giá trị nuôi giáp xác. Năm 2001 sản lượng
đạt 1.270.875 tấn, giá trị 8,432 tỷ USD. Tổng sản lượng tôm nuôi chiếm 25%
sản lượng tôm nói chung của thế giới ( trích dẫn từ Bộ Thủy Sản, 2006).
2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Theo Ling (1973) và Rabanal (1974) thì nghề nuôi tôm ở Việt Nam đã tồn tại
từ thập niên 70 với hình thức nuôi tôm quảng canh. Trong đó, diện tích tôm
nuôi ở ĐBSCL ở thời kì này đạt khoảng 70.000 ha. Nghề nuôi tôm ở Việt
Nam thật sự phát triển từ sau năm 1987 và nuôi tôm thương phẩm phát triển
mạnh vào những năm đầu thập kỹ 90. Tuy nhiên, sự bùng nổ của nghề nuôi
tôm thương phẩm được đánh dấu vào năm 2000 khi chính phủ ban hành nghị
quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng
suất thấp, đất hoang hóa sang nuôi trồng thủy sản. Diện tích nuôi tôm đã tăng
từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001. Song song, với việc
mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ những năm 90 và
đặc biệt là từ sau năm 2000 Việt Nam đã trở thành một trong năm nước có sản
lượng tôm nuôi cao nhất thế giới (Bộ thủy sản, 2006). Năm 2003 tổng diện
tích tôm nuôi khoảng 518.557 ha đạt sản lượng hơn 258.034 tấn. Theo báo cáo

sơ bộ của tổng cục thống kê năm 2007 tổng diện tích nuôi tôm của cả nước
khoảng 625.600 ha đạt sản lượng khoảng 315.435 tấn. Trong đó, ĐBSCL là
vùng có diện tích và sản lượng tôm chiếm khoảng 60-80% diện tích và sản
lượng cả nước (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004). Các loài tôm
được nuôi chính ở Việt Nam là Tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa
(Penaeus merguiensis), tôm nương (Penaeus orientalis), tôm đất
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
(Metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản
lượng cao nhất. Gần đây tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) cũng được
nhập về nuôi ở nước ta (trích dẫn từ Bộ Thủy sản, 2006).
2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó
Cùng với sự phát triển, tốc độ gia tăng diện tích và sản lượng tôm nuôi là tình
hình dịch bệnh không ngừng bùng phát. Đây cũng là một trong những nguyên
nhân quan trọng làm giảm đáng kể sản lượng tôm nuôi.
Tại Thái Lan nghề nuôi tôm năm 1992 bị thiệt hại 30 triệu USD (Nash et al.,
1995); năm 1993 bệnh dịch đã làm cho những người nuôi tôm tại Trung Quốc
thiệt hại 400 triệu USD (Wei Qi, 2001); năm 1994 Ấn Ðộ thiệt hại 17,6 triệu
USD (Subasinghe et al., 1995); năm 1997 nghề nuôi tôm ở Thái Lan thiệt hại
600 triệu USD (Chanratchakool et al., 2001); năm 1999 bệnh tôm đã làm
Ecuador thiệt hại 280 triệu USD (Alday de Graindorge and Griffith 2001).
Theo Lightner (1996) thì virus là tác nhân chủ yếu và đã gây thiệt hại đáng kể
cho nghề nuôi tôm. Chẳng hạn như bệnh do virus đốm trắng (WSSV), đầu
vàng (YHD), hội chứng Taura đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi
tôm ở Châu Mỹ La tinh hoặc bệnh MBV cũng đã gây thiệt hại không nhỏ cho
nghề nuôi tôm sú ở Đài Loan năm 1987 và 1988 (Chen et al., 1988). Thiệt hại
hàng năm do bệnh dịch thủy sản gây ra cho thế giới là khoảng 3 tỷ USD
(Rosenberry, 1996) (trích dẫn từ Bộ Thủy Sản, 2006)
Năm 1989 lần đầu tiên ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn thể ẩn của MBV
trong cơ quan gan tụy của Postlarvae (PL) ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ

yếu ở Thái Lan và các nước châu Á) (Rosenberry, 1997). Theo kết quả nghiên
cứu của Liao (1999) thì quần đàn tôm mẹ bắt từ biển của Đài Loan 1987
nhiễm MBV 33%, đến năm 1989 nhiễm 100%, thường gặp nhiễm 85%. Loài
virus này được công bố là loài gây bệnh trên tôm nuôi công nghiệp ở Đài Loan
năm 1987-1988 (Liao et al., 1992). Natividad (1992) cho biết, ở Philippine
đến năm 1992 rất khó tìm được một đàn PL của tôm sú không nhiễm MBV
(trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo,1997).
MBV cũng được xem là tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến năng suất thu
hoạch ở Úc. MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi
và tôm tự nhiên (Lightner và Redman, 1981). Virus này gây tỷ lệ chết cao cho
ấu trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn (Liao et
al., 1992). Còn theo Lightner (1996) thì MBV có thể nhiễm ở hầu hết các giai
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
đoạn khác nhau của tôm, bắt đầu từ giai đoạn Zoea 2, riêng giai đoạn Nauplius
có tính trơ với virus. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc
vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (trích dẫn từ
Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
Theo Phan Lương Tâm (1994) thì tại Việt Nam trong hai năm 1994-1995 hiện
tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía
Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng. Các công trình nghiên cứu liên
quan đến việc xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi ở ĐBSCL
cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận sự xuất
hiện của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon
Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrome Virus) (trích dẫn từ Nguyễn
Văn Hảo và ctv, 1997).
Kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) cho thấy tại các tỉnh miền
Trung có khoảng 70% bể PL có MBV dương tính. Khi đưa PL xuống ao đất
để ương thành tôm giống, tỷ lệ nhiễm MBV trên đàn giống tăng cao, gần 90%
ao ương nhiễm MBV. Tôm bố mẹ dùng trong các trại sản xuất tôm sú giống ở

miền Trung bị nhiễm MBV từ 60 – 70%.
Đầu năm 2001, tôm sú đã chết hàng loạt, trên diện rộng ở ĐBSCL, được coi là
“đại dịch tôm sú’'. Tại các vùng mới chuyển đổi, đã có 20.854 ha bị thiệt hại;
một số vùng ở Cà Mau thiệt hại tới hơn 80%. Nôn nóng chuyển đổi tự phát,
không có kỹ thuật, hạ tầng thuỷ lợi chưa có là những nguyên nhân chính làm
cho bệnh đốm trắng phát tán và lan tràn. Vụ đầu năm 2002, bệnh tôm lại tái
diễn ở ĐBSCL, được xác định là do hạ tầng chưa cải thiện, môi trường nuôi
quá xấu. Đến hết tháng 9/2003, số diện tích nhiễm bệnh ở Kiên Giang là hơn
8.000 ha, Cà Mau bị hơn 232 ha; nhất là Miền Trung thất bại nặng nề khi
Khánh Hoà, Phú Yên, Quảng Nam, Ninh Thuận có hàng nghìn ha tôm bị
nhiễm bệnh. Riêng thiệt hại của Khánh Hoà ước tính 26,6 tỷ đồng, Bình Định
40 tỷ. Khảo sát của Trung tâm nghiên cứu thuỷ sản (NCTS) III cho thấy, nếu
tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh, tôm giống có nguy cơ nhiễm cao, đặc biệt với bệnh
MBV. Tôm giống sản xuất trong nước hiện tập trung ở miền Trung. Trong đó,
riêng Khánh Hoà đã có hơn 1.000 trại, cung cấp khoảng 7 tỷ tôm PL cho cả
nước. Với mật độ xây dựng trại giống ngày càng dầy, việc tuân thủ quy hoạch
và các tiêu chuẩn xử lý thải hạn chế, ấu trùng tôm có nguy cơ nhiễm bệnh cao.
Phòng bệnh học của Trung tâm NCTS III, đã phát hiện 30/54 mẫu kiểm tra
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
tôm bố mẹ nhiễm MBV, với mẫu tôm PL bị nhiễm là 40,5% (trích dẫn từ Mai
Phương và Hà Yên, 2003).
Báo cáo kết quả của ngành NTTS năm 2003 thì cả nước có 546.757 ha nuôi
tôm nước lợ thương phẩm. Trong đó, diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là
30.083 ha. Các tỉnh thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200
ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả
nước. Các bệnh xảy ra với tôm cũng chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh
MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần
đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Kết quả kiểm tra
bệnh ở tôm giống nhập về Hải Phòng và Quảng Ninh trong năm qua do Trạm

nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus đốm trắng từ
25-46,6%, trung bình 38,9% tỷ lệ nhiễm MBV từ 43,3-60%. Và trong số 4
nguồn cung cấp giống về cho 2 tỉnh vùng Ðông Bắc Bộ này, có tới 3 nguồn có
quá nửa số giống bị nhiễm bệnh MBV. Tại các tỉnh Nam Bộ theo báo cáo năm
2003 của Viện NTTS II thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm có biểu
hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50%
(Hà Anh, 2007).
Theo kết quả nghiên cứu của Trung tâm Quản lý bệnh thủy sản Khoa Thủy sản
trường Đại học Cần Thơ từ năm 2001-2003 thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng
trên tôm giống tại các tỉnh ĐBSCL là 13,1% và MBV là 33,8% (Đặng Thị
Hoàng Oanh và ctv, 2004).
Năm 2005 theo phòng kiểm dịch giống thủy sản Cà Mau cho biết qua số mẫu
kiểm dịch đã có tới 83% mẫu tôm giống ở tỉnh bị nhiễm MBV. Trung tâm
khuyến ngư tỉnh Bạc Liêu năm 2006 đã xét nghiệm 2.326 mẫu tôm phát hiện
có gần 50% số mẫu kém chất lượng; trong đó có 941 mẫu nhiễm MBV,184
mẫu nhiễm virus đốm trắng. còn ở Trung tâm khuyến ngư Kiên Giang thì qua
kiểm tra 100 mẫu tôm giống, số lượng tôm bị nhiễm bệnh còi chiếm đến 40%
lượng tôm sú giống nhập về (Cung Diễm, 2006).
Trong đầu vụ nuôi tôm sú năm 2008, hiện đã có gần 100.000 ha nuôi tôm sú ở
Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang, Trà Vinh… bị chết, mức độ thiệt
hại từ 30-90% . Riêng ở Kiên Giang ước lượng mức thiệt hại do tôm chết đã
trên 15 tỷ đồng. Trong đó, điển hình như huyện Vĩnh Thuận là 17.247 ha
chiếm 88,98%; huyện An Minh 15.904 ha chiếm 50,25%; huyện U Minh
hượng 3.653 ha chiếm 52,35%; và An Biên 2.475 ha chiếm 30,11% diện tích
thả nuôi (Song Huỳnh, 2008).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
Tại huyện Mỹ Xuyên-Sóc Trăng là nơi có mô hình nuôi tôm-lúa được các nhà
khoa học ở các viện, trường đại học trong cả nước đánh giá mang tính bền
vững cao. Tuy nhiên, đến khoảng trung tuần tháng 4-2008, nơi đây có hơn

2.500 ha tôm nuôi bị chết, chiếm gần 80% diện tích. Nhiều hộ nuôi tôm ở Trà
Vinh cũng lâm vào cảnh tương tự. Khi tôm được 2,5 tháng tuổi thì bị bệnh
đốm trắng, đầu vàng… tình trạng tôm chết hàng loạt cũng đang diển biến phức
tạp tại các huyện Châu Thành. Cầu Ngang, Duyên Hải…Cùng thời gian này,
tại các Trạm kiểm dịch động vật thủy sản thuộc Chi cục Bảo vệ nguồn lợi thủy
sản tỉnh Trà Vinh đã phát hiện và vận động các hộ sản xuất, kinh doanh tự tiêu
huỷ hơn 24,5 triệu con tôm sú giống có mang mầm bệnh MBV, đỏ thân, phát
sáng Trong đó, có trên 22,2 triệu con con tôm giống sản xuất tại địa phương
và gần 2,3 triệu con nhập ngòai tỉnh (Duy Hoàng, 2008).
Phần lớn các diện tích tôm bị chết là do người nuôi thả giống trước lịch thời
vụ. Trong thời gian đầu, tôm phát triển tốt, nhưng sau đó thì bị bệnh đốm
trắng, một số khác thì bị đỏ thân. Hiện nay, ĐBSCL mỗi năm cần khoảng 22
đến 25 tỷ con giống. Trong khi đó, nguồn tôm giống ở các địa phương chỉ đáp
ứng khoảng 30 đến 35%, còn lại phải thu mua con giống từ các tỉnh miền
Trung nhưng theo thống kê thì nguồn tôm giống ở các tỉnh này có tỷ lệ nhiễm
bệnh rất cao từ 65-70%. Theo Sở Thủy sản Bạc Liêu, qua kiểm tra trên 355
mẫu tôm giống tại các cơ sở bán tôm giống đã phát hiện có 52,4% (186/355)
mẫu bị nhiễm bệnh MBV; 10,4% (37/355) mẫu bị nhiễm bệnh đốm trắng;
11% (39/355) mẫu bị nhiễm bệnh đầu vàng (Nguyễn Kiểm, 2008).
Theo báo cáo của ngành thủy sản các tỉnh ĐBSCL cho biết, tôm sú hiện vẫn
tiếp tục chết tại nhiều tỉnh ven biển trên diện tích hàng ngàn hécta, nâng diện
tích tôm chết từ đầu năm đến nay trên 120.000ha, nhiều gần 3 lần tháng 3-
2008, tập trung tại Cà Mau với 57.789 ha, Kiên Giang 40.000 ha, Bạc Liêu
19.000 ha (Thảo An, 2008).
2.4 Bệnh MBV
2.4.1 Tác nhân gây bệnh
Tác nhân gây bệnh MBV là virus type A baculovirus monodon, có cấu trúc
nhân là ADN hai mạch, có lớp vỏ bao, dạnh hình que (Lightner, 1996). Chủng
MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ± 3 x 246
±15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± 4 x 324 ± 33 nm. Chủng MBV của tôm (P.

plebejus, P. monodon, P. merguiensis) từ Úc có kích thước nhân 45-52 x 260-
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
300 nm, kích thước vỏ bao 60 x 420 nm (Mari et al., 1993 được trích dẫn từ
Bùi Quang Tề, 2006).
Virus ký sinh ở tế bào biểu mô hình ống gan tụy và tế bào biểu bì phía trước
ruột giữa, virus tái sản xuất bên trong nhân tế bào vật nuôi, bao gồm các giai
đoạn sau:
Giai đoạn tiềm ẩn: sau khi tế bào nhiễm MBV là giai đoạn sớm của tế bào chất
biến đổi.
Giai đoạn 1: Nhân tế bào trương nhẹ, các nhiễm sắc thể tan ra và di chuyển ra
sát màng nhân. Tế bào chất mất dần chức năng của chúng và hình thành giọt
mỡ. Virus bắt đầu gây ảnh hưởng.
Giai đoạn 2: Nhân trương to, số lượng virus tăng nhanh, xuất hiện thể ẩn trong
nhân.
Giai đoạn 3: tế bào bị bệnh, nhân tăng lên 2 lần đường kính, 6 lần thể tích. Bên
trong nhân có một đến nhiều thể ẩn, trong thể chứa đầy các virus.
Các virus phá hũy tế bào ký chủ, tiếp tục di chuyển sang các tế bào khác hoặc
theo chất bài tiết của tôm ra môi trường, tạo thành virus tự do tồn tại trong bùn
và nước (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008).
2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý
Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2008) thì khi tôm mới nhiễm MBV, dấu hiệu bệnh
không biểu hiện rõ ràng. Khi tôm nhiễm bệnh nặng và phát bệnh thường có
biểu hiện một số dấu hiệu sau:
Tôm có màu tối hoặc xanh tái, xanh xẫm. Tôm kém ăn, hoạt động yếu và sinh
trưởng chậm. Các phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh
vật bám như: ký sinh trùng đơn bào, tảo bám và vi khuẩn dạng sợi.
Gan tụy teo lại có màu trắng hơi vàng, thối rất nhanh.
Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% hoặc có thể tôm chết hầu hết trong ao.
2.4.3 Phân bố

Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên năm 1980 ở đàn tôm sú đưa từ Đài Loan
đến nuôi ở Mêhico (Lightner et al., 1981,1983). Tiếp theo các nhà nghiên cứu
đã phát hiện bệnh MBV có xuất phát từ Đài Loan, Philippines, Malaysia,
Polynesia thuộc Pháp, Singapore, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc…Theo
Chen et al. (1989) thì những năm 1987 và 1988 ở Đài Loan bệnh MBV đã gây
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
thiệt hại nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm sú (trích dẫn từ Bùi Quang Tề,
2006).
Cho đến nay bệnh MBV đã phân bố rộng rãi ở tôm nuôi và tôm tự nhiên khu
vực Đông bán cầu và hiện nay ghi nhận ở Úc, Đông Á, Trung Á, Đông Nam
Á, Ấn Độ, Đông Châu Phi.
2.4.4 Loài và giai đoạn cảm nhiễm
Tôm sú là loài thường xuyên nhiễm bệnh MBV, các loài tôm khác cũng khả
năng bị nhiễm MBV như: P. merguiensis, P. semisulcatus, P. kerathurus, P.
plebejus, P. indicus, P. penicillatus, P. esculentus, P. vannamei (Lightner,
1996).
MBV nhiễm từ giai đoạn Post đến giai đoạn tôm trưởng thành, ngoại trừ
trứng, ấu trùng Nauplius (Lightner, 1996).
2.4.5 Phương thức lây nhiễm
Bệnh MBV lan truyền từ tôm bị nhiễm bệnh sang tôm khỏe (chủ yếu là tôm
khỏe ăn tôm bệnh hoặc nhiễm virus theo chất thải của tôm). (Trần Thị Tuyết
Hoa, 2008)
2.4.6 Chẩn đoán bệnh
Có thể chẩn đoán sơ bộ bệnh MBV thông qua các dấu hiệu chính của bệnh
như đã mô tả ở phần trên. Áp dụng phương pháp kiểm tra nhanh các mẫu mô
gan tụy ép tươi không nhuộm hay có nhuộm bằng Malachite green, dưới kính
hiển vi ở độ phóng đại 40X. Dưới kính hiển vi, có thể nhận biết sự hiển diện
của virus này thông qua sự tồn tại của các thể ẩn hình cầu, ít bắt màu thuốc
nhuộm, nằm trong các nhân phình to của tế bào biểu mô gan tụy. Có thể dùng

phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin để phát hiện các thể ẩn hình cầu,
bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan
tụy, ở độ phóng đại ≥ 40X.
Ngoài ra, cũng có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên
cứu virus này như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặc trưng của MBV,
dùng phương pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các vi thể virus MBV
trong nhân tế bào biểu mô gan tụy hay các kỹ thuật như ELISA, lai tại chổ
(Trần Thị Tuyết Hoa, 2008).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
2.4.7 Phòng bệnh
Không dùng tôm giống có nhiễm mần bệnh MBV.
Kiểm tra đàn tôm bố mẹ trước khi cho đẻ.
Cải tạo ao thật kỹ trước mỗi vụ nuôi.
Nuôi tôm đúng mùa vụ, quản lý, chăm sóc tốt, cung cấp đầy đủ thức ăn về
chất và lượng. Không để tôm sốc trong quá trình nuôi.
Xử lý nước bằng ozon và các chất sát trùng Benzalkon clorua trước khi ấp
trứng thì có thể sản xuất được đàn tôm PL không bị nhiễm MBV (Trần Thị
Tuyết Hoa, 2008).
2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green
Phương pháp nhuộm nhanh bằng Malachite green 0,05-0,1% được Lightner et
al. đề ra năm 1983 nhằm phát hiện các thể ẩn của MBV trong vòng 5 phút.
Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp này thì hạn chế, nó chỉ có thể kiểm tra
được những con tôm bị nhiễm bệnh cấp tính hoặc trước cấp tính trong một
quần đàn có tỷ lệ nhiễm cao (Lightner et al., 1989).
2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin)
2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học
Mô học được nghiên cứu bắt đầu từ khi chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế
tạo bởi Antoni Van Leuwenhock (1632-1723) người Hà Lan, đến cuối thế kỷ
XVIII Robert Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào

là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Tiếp theo lĩnh vực nghiên cứu này là Xanvier
Bichat (1771-1802), một giảng viên dạy giải phẩu học và phẩu thuật tại một
trường đại học ở Pari đã đưa ra khái niệm chung đầu tiên về mô học trên động
vật, và từ đó mô học trở thành một phần của môn giải phẩu học dạy cho sinh
viên y khoa. Tiếp theo đó, các nhà động vật học đã vận dụng công cụ mới này
vào nghiên cứu của họ trên nhiều động vật khác nhau (trích dẫn từ Tài Hoàng
Nhật Quang, 2008).
Để góp phần vào sự phát triển của mô học, nhà bệnh học người Đức Rudolph
Virchow (1821-1902) đã đề xuất ý tưởng “bệnh có thể được đặc trưng bởi
những biến đổi ở cấp độ tế bào”. Ý tưởng này đã đóng góp to lớn cho học
thuyết tế bào và sự phát triển của mô bệnh học. Từ đó, mô học không chỉ được
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
ứng dụng trong việc nghiên cứu cấu trúc mô bình thường mà còn được áp
dụng trong nghiên cứu những biến đổi cấu trúc của cơ quan bệnh.
Theo Lightner và Bell (1989) thì mô học là khoa học nghiên cứu các tổn
thương ở các mô và tế bào, như mô thần kinh, mô da. Những biến đổi bệnh lý
ở các mô và tế bào được gọi là những tổn thương vi thể. Nghiên cứu các tổn
thương có nghĩa là mô tả đầy đủ mọi chi tiết của tổn thương đó ở mức độ vi
thể rồi kết luận nó thuộc nhóm bệnh gì. Mô tả bệnh không chỉ mô tả tổn
thương mà còn là công việc so sánh đối chiếu các tổn thương đó đối với những
biểu hiện lâm sàng của tôm, cá. Nghĩa là tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa
những biến đổi hình thái với các rối loạn chức năng trên cơ sở xác định việc
chẩn đoán (trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003).
2.6.2 Ứng dụng mô học bệnh học trong thủy sản
Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng mô học trong việc hệ thống các
bệnh thường gặp trên tôm nuôi ở Châu Mỹ, Châu Á (Lightner et al., 1992).
Năm 1997 Wang, Tang và Chen chứng minh sự hiện diện virus đốm trắng trên
Penaeus monodon và Penaeus japonicus bằng việc quan sát tiêu bản mô học
dưới kính hiển vi quang học và điện tử. Kế đến năm 1998, Sudha et al. bằng

phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài virus gây nhiễm
trên các loài tôm biển ở Ấn Độ (trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003) .
Ở Việt Nam, năm 1999 Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú
nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học và PCR và năm 2000 ông cũng
ứng dụng tiếp 2 phương pháp này trong nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu bệnh
đỏ mang trên tôm sú bố mẹ, bệnh phát sáng, bệnh đục thân và bệnh đốm trắng
trên ấu trùng tôm sú giống tại các trại giống thuộc các khu vực Miền Trung và
Nam Bộ”. Năm 2001, Hòa cũng đã ứng dụng mô học trong việc xác định
cường độ cảm nhiễm MBV. Đến năm 2003, Bùi Quang Tề cũng đã ứng dụng
phương pháp này vào việc chẩn đoán bệnh tôm và đưa ra phương pháp phòng
trị. Cùng năm này, Phạm Trần Nguyên Thảo đã ứng dụng phương pháp mô
học và PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm giống và tôm thịt.
Theo Nguyễn Anh Tuấn và ctv (2003) thì phương pháp này là một kỹ thuật rất
quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp chỉ có thể chẩn
đoán được bệnh bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó cũng có những hạn chế
là thao tác tương đối chậm và chỉ phát hiện bệnh khi tôm đã nhiễm nặng.
Đồng thời khi sử dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh nên kết hợp với
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm vì đôi khi những hình thái
tổn thương của một số bệnh có biểu hiện giống nhau (trích dẫn từ Phùng Thúy
An, 2005).
2.7 Phương pháp PCR
2.7.1 Sơ lược về PCR
Polymerase Chain Reaction là phương pháp được Kary Mullis et al. phát minh
năm 1985 đã giúp các nghiên cứu về ADN nói riêng và về sinh học phân tử
nói chung đạt được những thành tựu to lớn.
PCR là kỹ thuật khuếch đại từ một đoạn ADN bất kỳ có thể nhân lên hàng tỷ
lần nhanh chóng nhờ sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (primer) chuyên
biệt (oligonucleotides) dài khoảng 17 đến 30 nucleotite có trình tự bổ sung với

trình tự của đoạn ADN gốc, enzyme tổng hợp ADN, các nucleotide tự do và
dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt. PCR có tính nhạy cao và cho
phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với một tiểu phần virus. Những virus
ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này
(Trần Việt Tiên, 2007). Hiện nay, PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều
lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền, phân tích pháp
y,…
Theo Khuất Hữu Thanh (2006) thì PCR là một chuổi chu kỳ (cycle) nối tiếp
nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm
các thành phần cần thiết cho sự sao chép (dNTP, enzyme ADN polymerase,
Mg
2+
…), phân tử ADN được biến tính cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của
phân tử, thường là 94-95
0
C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn lai (anealation): Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của
các đoạn mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ
này dao động trong khoảng 60
0
C-70
0
C, tùy theo độ lớn và Tm của các đoạn
mồi sử dụng và thời gian từ 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation): Nhiệt độ được tăng lên 72
0
C
giúp cho ADN polymerase tổng hợp tốt nhất (thường dùng Taq ADN
polymerase tách chiết từ̀ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus). Thời

gian của các bước này tùy thuộc độ dài của ADN cần khuếch đại, thường 30
giây đến nhiều phút.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp
đôi lượng mẫu so với lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo
tính toán thì sau 25 đến 35 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 2
25
-2
35
bản sao.
Trong qui trình PCR, sau những chu kỳ đầu, các chu kỳ cuối nhiệt độ cần tăng
thêm 1-2
0
C. Do về sau lượng mồi giảm, lượng khuôn tăng lên, mặt khác
enzyme Taq ADN polymerase hoạt động yếu dần do tác động nhiệt độ, vì vậy
cần tăng nhiệt độ chu kỳ sau để tăng hiệu quả tổng hợp ADN.
Sau phản ứng các ADN được nhuộm bởi Ethidium Bromide và có thể quan sát
thông qua điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và đọc kết quả dưới bàn
đọc UV.
2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
ADN khuôn: Theo Khuất Hữu Thanh (2006) khuôn ADN có vai trò rất quan
trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản ứng tối ưu với các đoạn
khuôn hoàn toàn tinh sạch, nhưng khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các
protein thì hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của ADN khuôn.
Enzyme: ADN polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các
đặc tính của ADN polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà
hiệu quả phản ứng khác nhau.
Mồi và nhiệt độ gắn mồi: Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản
ứng PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc:

Trình tự của mồi được chọn sao cho giữa mồi xuôi và mồi ngược không thể
bắt cặp bổ sung với nhau và cũng không có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ
sung giữa các phần khác nhau của một mồi (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005).
Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược phải tương đương nhau (thông
thường nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72
0
C). Thành phần nucleotide của
các mồi cân bằng tránh các cặp GC lập đi lập lại nhiều lần (Hồ Huỳnh Thùy
Dương, 2005). Độ dài mồi cần chọn khoảng 18-30 nucleotide, nếu mồi nhỏ
hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ
ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3.
Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng
với các trình tự lập lại trên gen.
Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng PCR
sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
Nồng độ các loại nucleotide tự do: Nồng độ các loại nucleotide (dATP,
dGTP, dCTP, dTTP) khoảng 20 – 200 µM / mỗi loại, khi nồng độ nucleotide
quá thấp sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao dễ dẫn
đến sự khuếch đại “kí sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2006)
Nồng độ Mg
2+
:

Ion Mg
2+
là thành phần không thể thiếu được của phản ứng
PCR, nồng độ Mg
2+

tối ưu để thực hiện phản ứng PCR từ 150-200 µM. Nước
sử dụng cho phản ứng phải là nước tinh khiết, không chứa bất kì ion lạ nào.
Không chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy acid nucleic.
Môi trường dung dịch đệm phải ổn định. Dung tích tổng số cho một phản ứng
PCR khoảng từ 20-50 µl.
Chu kỳ phản ứng: Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005) số lượng chu kỳ
PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng. Sở dĩ như vậy là vì
phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đọan đầu số lượng bản sao
tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại
giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: (1) sự phân hủy và cạn kiệt các thành
phần của phản ứng (2) sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng (3) các
bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau…
2.7.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản
Hiện nay, phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực
nghiên cứu như sinh học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán để phát
hiện mầm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm Trong thủy sản thì phương pháp này
theo Trần Thị Tuyết Hoa (2007) có những ứng dụng sau:
Phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc
cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi: (1) Chẩn
đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết. (2) Phòng
bệnh: kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống. (3) Kiểm soát
bệnh: theo dõi, kiểm tra theo khu vực và kiểm tra tôm giống nhập khẩu.
Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu – Sự nhiễm khuẩn
hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli.
Góp phần vào qui trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây
bệnh, hay có thể là các loài động vật thủy sản.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2009 – 5/2009
- Địa điểm phân tích mẫu: Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản - khoa
Thủy Sản - trường Đại học Cần Thơ
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Tôm giống
- Tôm thịt
3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu
3.2.2.1 Dụng cụ dùng trong phương pháp Malachite Green
- Bộ dụng cụ mổ
- Thớt nhựa
- Lame và lamella
- Kính hiển vi
3.2.2.2 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin
- Bộ dụng cụ mổ
- Kính hiển vi
- Lame và lamella
- Máy cắt lát mỏng
- Khuôn đúc
- Khay nhuộm
- Máy ảnh, bút chì, sổ ghi chép
3.2.2.3 Dụng cụ dùng trong phương pháp PCR
- Máy chu kỳ nhiệt
- Pipet tự động
- Ống típ 1.5 ml và 0.5 ml
- Que nghiền mẫu
- Máy ủ
- Máy li tâm

- Máy điện di
- Máy chụp hình UV
- Lò viba
- Cân điện tử
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
- Tủ lạnh
- Tủ -80
0
C
- Tủ -20
0
C
3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu
3.2.3.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green
- Malachite Green 0,05-0,1%, cồn 90
0

3.2.3.2 Phương pháp nhuộm haematoxylin và Eosin
- Nước cất
-Cồn tuyệt đối, cồn 95
0
, cồn 80
0
, cồn 70
0

- Xylen
- Formaline
- Paraffin

- Thuốc nhuộm Haematoxylin và Eosin (H&E)
- Keo canada palsam
- Dung dịch Davidson
’
s AFA (Davidson
’
s alcohol formaline acetic)
3.2.3.3 Phương pháp PCR
- Dung dịch nạp mẫu
- Agarose
- TAE buffer 0,5X
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp thu mẫu
- Địa điểm thu mẫu: Kiên Giang, Cần Thơ
- Số lượng mẫu thu:
Tôm thịt: 11 mẫu (được thu từ 4 ao)
Tôm giống: 30 mẫu
Trong đó, tại Kiên Giang thu 15 mẫu tôm giống và 11 mẫu tôm thịt; tại Cần
Thơ 15 mẫu tôm giống.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17
3.3.2 Phương pháp phân tích
3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green (theo phương pháp
Lightner, 1996)
Chuẩn bị tiêu bản:
- Tôm lớn: dùng dao mổ giáp đầu ngực của tôm và lấy gan tụy đưa lên
lame tán mỏng.
- Tôm giống: dùng pen và kim mũi giáo tách giáp đầu ngực của tôm và lấy gan
tụy đưa lên lame tán mỏng (lấy khoảng 25-40 con/mẫu).
- Nhỏ 1 giọt dung dịch malachite green 0.1% lên mẫu, đậy lamella lại

- Quan sát các thể ẩn MBV trong vòng 5 phút
- Các thể ẩn MBV bắt màu xanh, hình cầu đơn lẻ hay kết thành từng chùm.
3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin
a) Phương pháp cố định mẫu (theo phương pháp Lightner, 1996)
Chuẩn bị dung dich Davidson
’
s AFA
Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson
’
s AFA
Cố định mẫu
Tôm lớn
- Dùng kéo cắt bỏ các phần phụ trên cơ thể tôm như: các chân bơi và chân bò.
Sau đó, cắt đôi tôm tại vị trí nối của phần đầu và phần bụng, tiếp tục dùng kéo
cắt phần đầu của tôm ra làm đôi theo chiều dọc cơ thể.
- Cho mẫu vừa cắt vào lọ chứa dung dịch cố định.
- Sau khi mẫu được cố định từ 24-48 giờ thì chuyển mẫu sang cồn 50-70
0
để
bảo quản mẫu (thời gian trữ mẫu trong cồn thì không giới hạn).
Thành phần Thể tích
Ethyl alcolhol 95% 330 ml
Formaline 200 ml
Acid acetic 115 ml
Nước cất 335 ml
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version