(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------

Nguyễn Thị Tươi

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM CỦA
CÂY NHỌ NỒI VÀ NGẢI CỨU THÔNG QUA THỤ
THỂ TLR4

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

TIEU LUAN MOI download :


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------

Nguyễn Thị Tươi

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM
CỦA CÂY NHỌ NỒI VÀ NGẢI CỨU THÔNG
QUA THỤ THỂ TLR4
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA
HỌC:

TS. Trịnh Tất Cường

Hà Nội - 2012

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU

1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

3

1. Khái niệm viêm

3

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc

3

2.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc

3

2.1.1. Các chất kháng viêm

3

2.1.1.1. Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID)

3

2.1.1.2.Các chấ t kháng viêm có bản chấ t steroid

4

2.1.1.3. Các chất khác

4

2.1.2. Thụ thể glucocorticoid (GR) và cơ chế kháng viêm

5

2.1.3.Thụ thể họ toll-like và cơ chế kháng viêm

7

2.1.4.Tế bào marcrophage

12

2.1.5. Các mơ hình sàng lọc chất kháng viêm in vitro

13

2.1.5.1. Mô hình sàng lọc sử dụng gen ch ỉ thị luciferase có gắ n

13

NF-κB (NF-κB dependent luciferase reporter assay)
2.1.5.2. Mô hình sàng lọc sử dụng thụ thể GR

15

2.1.5.3. Mô hình sàng lọc sử dụng thụ thể toll like (TLRs)

17

2.1.5.4.Mô hình nghiên cứu viêm thực nghiê ̣m in vivo sử dụng

19

LPS
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
3. Cây nhọ nồi và cây ngải cứu

3.1. Cây nhọ nồi

20
22
22

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

3.2. Cây ngải cứu
4. Vai trò Wedelolactone của cây nhọ nồi và một số hợp chất của ngải cứu

23
24

trong quá trình chống viêm
4.1. Wedelolactone

24

4.2. Một số hợp chất của cây ngải cứu

25

Chƣơng 2- ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

27
27

2.1.1.Động vật thí nghiệm

27

2.1.2. Hóa chất

27

2.1.3. Thiết bị nghiên cứu

27

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu

27

2.2.1.Tách chiết macrophage từ tủy xƣơng của chuột.

27

2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng

27

sống của BMDM bằng kít CCK-8
2.2.3. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit

28

2.2.3.1. Giới thiệu về phương pháp

28

2.2.3.2. Nguyên tắc

28

2.2.3.3. Quy trình thí nghiệm

29

2.2. 4. Phƣơng pháp Western blot

31

2.2.4.1. Giới thiệu về phương pháp

31

2.2.4.2. Nguyên tắc

31

2.2.5. Phân tích ức chế của Wedelolactone trong q trình tạo phản

36

ứng oxy hóa
2.2.6.Phân tích thống kế

37

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

38

3. 1. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hƣởng bởi Wedelolactone

38

3.2. LPS kích thích tế bào BMDM sinh cytokine

39

3.3. Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine thơng qua thụ thể

40

TLR4 kích thích bằng LPS
3.4. LPS kích thích hoạt động của yếu tố tự phân bào (MAPK) thơng

41

qua thụ thể TLR4
3.5. Wedelolactone ức chế q trình phospho của yếu tố tự phân bào

42

bằng LPS kích thích thơng qua thụ TLR4
3.6.Wedelolactone đã ức chế quá trình sinh ROS thơng qua thụ thể

43

TLR4 kích thích bằng LPS
3.7. LPS kích thích hoạt động p47 phox trong q trình tạo ra ROS

44

3.8. Wedelolactone ức chế q trình sinh ROS thơng qua thụ thể TLR4

45

bằng LPS
3.9. Dầu ngải cứu không gây độc đối với BMDM

46

3.10. Dầu ngải cứu khơng có khả năng ức chế q trình sản xuất

47

cytokine thơng qua thụ thể TLR4 bằng LPS
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

50

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

Giải thích các chữ viết tắt
TT

Từ viết tắt

Nghĩa từ viết tắt

1.

BMDM

Bone Marrow-Derived Macrophage

2.

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

3.

IL

Interleukin

4.

LPS

Lipopolysaccharides

5.

NF-КB

Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells

6.

ROS

Reactive oxygen species

7.

TLR

Toll-like receptor

8.

TNF/ TNFα

Tumor necrosis factor/ Tumor necrosis factor alpha

9.

OD

Optical Density

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

Danh mục các hình trong luận văn

Thứ tự hình

TT

Trang

Hình 1.

Cơ chế hoa ̣t đơ ̣ng của thu ̣ thể Glucocorticoid trong tế bào

7

Hình 2.

Mơ hình cơ chế kháng viêm của Glucocorticoid

7

Hình 3.

Cơ chế hoạt động của một số TLR

10

Hình 4.

Biể u hiê ̣n của các TLR ở các tế bào ba ̣ch cầ u

12

Hình 5.

Mơ hình sàng lọc sử dụng gen thơng báo luciferase có gắn NF -

15

κB
Hình 6.

Mơ hiǹ h sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng thu ̣ thể glucocorticoid (GR)

16

Hình 7.

Mơ hình sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng thu ̣ thể toll like (TLRs)

18

Hình 8.

Mơ hiǹ h nghiên cƣ́u viêm thƣ̣c nghiê ̣m in vivo sƣ̉ du ̣ng LPS

20

Hình 9.

Cây nhọ nồi

23

Hình 10.

Cây ngải cứu

24

Hình 11.

Cấu trúc hóa học của Wedelolactone

25

Hình 12.

Biểu đồ Wedelolactone khơng gây độc đối với tế bào BMDM

38

Hình 13.

Biểu đồ LPS kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền
viêm và kháng viêm

39

Hình 14.

Biểu đồ Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm

40

trong BMDM đƣợc kích thích bằng zymosan
Hình 15.

LPS đã kích thích q trình phospho của ERK1/2 và p38 trong

41

BMDM
Hình 16.

Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho của ERK1/2 và p38

42

trong BMDM
Hình 17.

Wedelolactone hoặc Dex ức chế q trình sản sinh ROS đƣợc

43

kích thích bởi LPS thơng qua TLR4

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Hình 18.

Nguyễn Thị Tươi

LPS kích thích q trình phospho hóa của p47phox trong

44

BMDM.
Hình 19.

Wedelolactone đã ức chế q trình phospho hóa của p47phox

45

Hình 20.

Dầu ngải cứu khơng gây độc đối với tế bào BMDM

46

Hình 21.

Tinh dầu ngải cứu khơng có khả năng ức chế q trình sinh

47

cytokine tiền viêm trong BMDM đƣợc kích thích bằng LPS

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

MỞ ĐẦU
Viêm là đáp ứng tự nhiên của cơ thể để chống lại các tác nhân gây bệnh từ
mơi trường bên ngồi như: tia tử ngoại, các chất phóng xạ, các chất hóa học và đặc
biệt là các tác nhân gây bệnh. Kết quả của viêm là loại bỏ hoặc triệt tiêu hoàn toàn
các điều kiện sinh ra nó. Như vậy, viêm là đáp ứng có lợi cho cơ thể. Tuy nhiên,
nếu thời gian tồn tại quá lâu thì viêm sẽ chuyển từ giai đoạn cấp tính sang mãn tính
và gây nên những hậu quả nghiêm trọng cho cơ thể. Những tác động do viêm mãn
tính mang lại phải kể đến như: gây rối loạn q trình chuyển hóa, trao đổi chất, ảnh
hưởng đến hoạt động của các cơ quan, thậm chí nếu để nặng hơn có thể dẫn đến suy
giảm chức năng của thận, gan…
Do vậy, điều trị và làm giảm bớt tác động bất lợi của viêm đối với cơ thể là
vấn đề hết sức quan trọng hiện nay, đặc biệt là trong quá trình điều trị bệnh. Các
thuốc kháng viêm trên thị trường mà phổ biến là Dexamethasone, các chất có nguồn
gốc là cortiocoid, chủ yếu là các thuốc tổng hợp hóa học. Các loại thuốc này tuy có
tác động nhanh song cũng tiềm tàng các khả năng gây độc cho cơ thể và có thể gây
nên những tác dụng phụ khơng mong muốn. Sử dụng thuốc kháng viêm có nguồn
gốc thực vật có thể giải quyết những lo ngại trên với ưu điểm là an toàn, hiệu quả
lâu dài và giá thành thấp.
Cho đến nay, việc tìm kiếm các chất chống viêm mới có nguồn gốc từ thực vật
đang được quan tâm bởi những hiệu quả của nó. Gần đây, tại Phịng thí nghiệm
Trọng điểm Cơng nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà
Nội đã xây dựng mơ hình để sàng lọc và đánh giá khả năng chất chống viêm trên cả
mơ hình in vitro và in vivo. Với mơ hình này, Wedelolactone từ cây nhọ nồi đã

được tách chiết và bước đầu khẳng định được khả năng chống viêm.
Với hoạt tính phịng chống viêm đầy tiềm năng của Wedelolactone, cũng như
trên mơ hình sàng lọc chất chống viêm mới này, chúng tôi muốn nghiên cứu sâu
hơn nữa các đặc tính, cơ chế chống viêm ở mức in vitro. Ngồi ra, chúng tơi cũng

1

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

tiếp túc đánh giá khả năng chống viêm của cây ngải cứu qua mơ hình này. Từ
những kết quả có được này sẽ tạo cơ sở cho các nghiên cứu khoa học thử nghiệm
tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đích cuối cùng là làm ra thuốc
phòng ngừa và chữa trị các bệnh viêm nhiễm có nguồn gốc từ thực vật góp phần
vào việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Xuất phát từ cơ sở khoa học thực
tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây
nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4”.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu đề tài
Mục tiêu
1. Xác định được chức năng điều hòa quá trình đáp ứng viêm của Wedelolactone và
tinh dầu ngải cứu trong tế bào macrophage thông qua thụ thể TLR4.
2. Đánh giá được khả năng chống viêm của cây ngải cứu trong tế bào macrophage
thông qua thụ thể TLR4.
Nội dung nghiên cứu
1. Đánh giá khả năng điều hòa của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá

trình sản xuất cytokine tiền viêm trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu của TLR4,
ở đây chúng tôi sử dụng LPS.
2. Đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá
trình ức chế yếu tố tự phân bào MAPK ( mitogen-activated protein kinase).
3. Đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá
trình tạo phản ứng oxy hóa trong BMDM thơng qua cấu tử đặc hiệu TLR4, ở đây
chúng tôi sử dụng LPS.

2

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Khái niệm viêm
Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao
mạch với các vị trí bị tở n thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay
là những tế bào bị hỏng. Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa
chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi. Khi phản ứng viêm xảy ra , nhiề u
loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến ổ viêm như các loại tế bào di chuyển
(migrating cells) gồ m: bạch cầu đơn nhân , đa nhân, các tế bào lympho , tiể u cầ u , tế
bào nội mạc… Các t ế bào này giải phóng ra hàng loa ̣t các chấ t trung gi an, phầ n lớn
là các chất p rostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tớ
hoạt hóa tiểu cầu (PAF) và interleukin-1. Các chất này lại tiếp tục hoạt hóa các tế
bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải
protein như các proteinase

, các interleukin , TNF-α, các superoxide , H+,

hydroperoxide gây ra tổ n thương mô , qua đó khép kin
́ quá trin
̀ h viêm ma ̣n tin
́ h

.

Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới
những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ, nóng. Một vài chất tiế t ra làm
hẹp dòng chảy của máu dẫn tới bị sưng. Khi quá trình viêm kéo dài s ẽ dẫn tới hiệu
quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do quá trình viêm chi ếm ưu thế hơn q
trình kháng viêm và q trình đơng tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ
huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là
hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ
quan và tử vong [37].

3

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc
2.1.Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc

2.1.1. Các chất kháng viêm
Các chất kháng viêm được phân loại thành 3 nhóm chính gồm:
2.1.1.1. Các chất kháng viêm khơng có bản chất steroid (NSAID)
Đa ̣i diê ̣n cho nhóm này là aspirin , ibuprofen và naproxen . Cơ chế kháng viêm
của NSAID đư ợc phát hiện là do chúng ức chế sự tổng hợp

prostaglandins (PG).

Đić h tác du ̣ng đươ ̣c biế t rõ nhấ t của các chấ t này là cyclooxygenase
enzym có vai trò chuyể n hóa axit ar

achidonic thành prostaglandins

(COX), là
(PG) và

thromboxane (TX). Mô ̣t số chấ t kháng viêm không có bản chấ t steroid (NSAID) lại
có khả năng ức chế enzym liên quan đến sự bào mòn màng nhày dạ dày
cứu lâm sàng đã chứng minh các chấ t

. Nghiên

kháng viêm khơng có bản chất steroid

(NSAID) này có tác du ̣ng ức chế sự hin
̀ h thành prostaglandins (PG) ở màng nhày dạ
dày. Tuy nhiên , salysilate, mô ̣t chấ t kháng viêm thuô ̣c nhóm này cũng có tác du ̣ng
ức chế sự sinh tổng hợp của

prostaglandins (PG) nhưng la ̣i không làm bào m òn

màng nhày dạ dày như aspirin . Lý do tại sao lại có sự khác nhau về cơ chế tác dụng
giữa aspirin và salisylate là vấ n đề chưa giải thích đươ ̣c [42].
2.1.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid
Steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc mang một vịng 4 cycloalkane. Th ̣c
về nhóm chấ t này có các chấ t corticoid . Chúng tác dụng thông qua ức chế enzyme
phospholipases A2, là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa phospholipase A 2
thành axit arachidonic . Như vâ ̣y, cuố i cùng thì corticoid cũng ức chế sự sinh tổ ng
hơ ̣p của prostaglandins (PG), thromboxane và leukotrienes. Các chất kháng viêm có
bản chất stero id ức chế phospholipase A 2 mô ̣t cách gián tiế p thơng qua viê ̣c giải
phóng các chấ t ức chế protein có tên go ̣i là macrocortin , lipomodulin hay renocortin
có khối lượng phân tử đạt khoảng

15, 30 và 40 kDa. Đa ̣i diê ̣n nhóm chấ t này là

lipocortin đã đươ ̣c tinh sa ̣ch , thương ma ̣i và đươ ̣c xem là mô ̣t trong những chấ
kháng viêm mạnh [42]. Các chất có bản chất steroid thường là phối tử của thụ thể
glucocorticoid.

4

TIEU LUAN MOI download :

t


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

2.1.1.3. Các chất khác
Thuô ̣c về nhóm này có vàng và colchicine . Trong trường hơ ̣p của colchichine ,
chấ t này ức chế sự hì nh thành tinh thể urate trong khớp của bê ̣nh nhân gout thông
qua viê ̣c làm giảm sự tiế t các chấ t chemotaxis của ba ̣ch cầ u đa nhân và giải phóng
enzyme lysosom . Colchicine có tác du ̣ng ức chế đă ̣c hiê ̣u sự giải phóng mơ ̣t
glycoprotein có trọng lượng phân tử 8400 Da. Đây là mô ̣t chấ t chemotaxis của ba ̣ch
cầ u đa nhân đố i với các ba ̣ch cầ u trung tin
́ h và monocytes có khả năng thực bào các
thể urate [42].
2.1.2. Thụ thể glucocorticoid (GR) và cơ chế kháng viêm
Các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors – PRRs), bao gồm các
thụ thể toll-like, lectin và dectin-1 chi phối khả năng sống sót của vật chủ bằng viê ̣c
nhận dạng những phân tử mầm bệnh (pathogen-associated molecular patterns PAMPs) ở vi khuẩn, virus và nấm. Sau khi nhận dạng mầm bệnh, các thụ thể sẽ
truyền tín hiệu vào tế bào và kích thích tế bào ti ết ra các chấ t trung gian (mediator)
như cytokine, chemokine tiền viêm và kháng viêm, thậm chí ta ̣o mi ễn dịch đáp ứng
ban đầu [24, 12]. Bên cạnh các thụ thể PRRs như đã trình bày ở trên , Schäcke và
cộng sự (2009) đã phát hiê ̣n ra loa ̣i th ụ thể khác là glucocorticoid có khả năng kìm
hãm các yếu tố sinh ra quá trình viêm bằng cách liên kết vào Acid Deoxyribo
Nucleic (AND) trong nhân tế bào [38].
Glucocorticoid (GC) tự nhiên là hormon do tuyến thượng thận sản xuất, gồm hai
chất là hydrocortison và cortison, có vai trị quan trọng trong điều hịa chuyển hóa
các chất. Glucocorticoid hoạt động theo cơ chế liên kết với thụ thể gluc

ocorticoid

(GR). Thụ thể glucocorticoid (GR) là một thành viên của siêu họ thụ thể trong nhân
tế bào [38]. Thụ thể glucocorticoid có thể được phân chia thành 3 đoạn chính: thứ
nhất là đoạn cuối đầu N kích hoạt phiên mã , thứ hai là đoạn liên kết Acid
Deoxyribo Nucleic (AND) trung tâm và thứ ba là đoạn cuối đầu C liên kết với phối
tử (ligand) [26]. Các phối tử đặc hiệu liên kết thụ thể glucocorticoid bằng cách

xuyên qua màng plasma của tế bào. Khi thụ thể glucocorticoid đã được hoạt động
nhờ liên kết với phối tử đặc hiệu, nó sẽ thay đổi hình dạng và chuyển tới định vị

5

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

trên Acid Deoxyribo Nucleic (AND) của nhân tế bào và điều khiển quá trình biểu
hiện của các gen đích. Ở trạng thái chưa gắn kết với phối tử, thụ thể glucocorticoid
bất hoạt nằm ở tế bào chất có ch ứa các protein shock nhiệt 90, 70, 50. Sau khi liên
kết với phối tử đặc hiệu, thụ thể glucocorticoid được kích hoạt sẽ thay đổi hình dạng,
tách ra khỏi những protein shock nhiệt và tương tác trực tiếp với các vị trí trên
chuỗi Acid Deoxyribo Nucleic (AND) trong nhân tế bào bao gồ m các y ếu tố phản
ứng Glucocorticoid (glucocorticoid response element-GREs) trong vùng promoter
của những gen đích, hoặc những yếu tố (factor) phiên mã khác thông qua các tương
tác protein với protein, giữa thụ thể glucocorticoid và nhân tố phiên mã AP

-1

(activator protein 1) hoặc giữa thụ thể glucocorticoid với tổ hơ ̣p protein kiể m soát
phiên mã của Acid Deoxyribo Nucleic (AND) là NF -КB (nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cells) (Hình 1).
Glucocorticoid thực hiện vai trị cơ bản trong q trình điều hòa trạng thái cân
bằng nội sinh của cơ thể sống. Chúng cần thiết để duy trì rất nhiều hoạt tính sinh
học quan trọng, chẳng hạn trạng thái cân bằng nội sinh của trung tâm thần kinh và
hệ thống tim mạch, quá trình phản ứng miễn dịch và quá trình viêm nhiễm.

Glucocorticoid đóng vai trò như là các chấ t

ức chế miễn dịch và kháng viêm đặc

trưng không thay thế với nhiều bệnh viêm nhiễm, mẫn cảm miễn dịch, dị ứng và
liên quan đến quá trình phát triển của tế bào lympho , ví dụ bệnh th ấp khớp… Mặc
dù Glucocorticoid tổng hợp là những đại diện có tiềm năng nhất về chống viêm
nhưng khi sử dụng chúng lại sinh ra những phản ứng phụ khơng có lợi cho cơ thể.
Để khắ c phu ̣c vấ n đề này

, cấu trúc của đoạn liên kết với ph ối tử của thụ thể

glucocorticoid được xác đinh
̣ và c ấu trúc của phối tử đươ ̣c cải biế n đ ể làm thay đ ổi
hình dạng cuối cùng của phức hơ ̣p thụ thể glucocorticoid - phối tử. Điều này đã đem
lại thành công như trong trường hơ ̣p các ph ối tử của thụ thể oestrogen. Phố i tử này
giúp thụ thể glucocorticoid vẫn giữ được hoạt tính kháng viêm nhưng lại giảm đi
khả năng gây hiệu ứng phụ. Hướng nghiên cứu này đã mở ra kh ả năng phát triển
được nhiều hợp chất chố ng viêm hi ệu quả từ các Glucocorticoid tổ ng hơ ̣p trong
tương lai [15].

6

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

Hình 1. Cơ chế hoa ̣t đô ̣ng của thu ̣ thể Glucocorticoid trong tế bào [49]

Cơ chế kháng viêm của Glucocorticoid (Hình 2) trong q trình viêm mãn tính
đươ ̣c Peter và c ộng sự chứng minh là do nó đã ức chế quá trình hoạt động của các
yếu tố phiên mã giống như NF-КB và AP-1 (activator protein -1) [34].

7

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

Hình 2: Mơ hình cơ chế kháng viêm của thụ thể glucocorticoid [33]
Theo các tác giả này thì thụ thể glucocorticoid trong tế bào chấ t sau khi đươ ̣c
kích hoạt bởi glucocorticoid sẽ di chuyển vào nhân . Ở đây chúng liên k ết với các
yếu tố phản ứng Glucocorticoid (glucocorticoid response element-GREs) trong các
gen đích đáp ứng steroid, dẫn tới làm tăng quá trình phiên mã. Tuy nhiên, thụ thể
glucocorticoid lại làm gi ảm quá trình phiên mã c ủa những gen tham gia vào q
trình gây viêm và những gen khơng có vị trí GRE (glucocorticoid response element)
trong các vùng promoter của chúng. Khi hoạt động, thụ thể glucocorticoid có thể
liên kết với NF-КB đã được kích hoạt và ngăn cản nó khơng gắn vào các vị trí kB ở
những gen tham gia vào quá trình viêm . Quá trình tương tác này có th ể xảy ra trong
tế bào chấ t hoặc ở trong nhân. Cụ thể là glucocorticoid làm tăng q trình phiên mã
của gen IКBα mã hóa cho chất ức chế IkBa

(NF-kappa-B inhibitor alpha) dẫn tới

quá trình thay đổi hình dạng của protein liên kết với NF-КB. Protein IkBa (NFkappa-B inhibitor alpha) kích thích q trình tách rời của NF-КB trong phức hệ NFКB dẫn tới NF-КB tách rời khỏi phức hê ̣ và di chuyể n từ tế bào chấ t vào nhân

.

Những NF-КB bị tách ra khỏi phức hệ này sẽ bị thụ thể glucocorticoid bắt cặp và
cản trở liên kết với các đo ạn gen gây viêm . Các kế t quả thu đươ ̣c là rấ t có giá tr ị
trong viê ̣c tìm ra nh ững phối tử thụ thể glucocorticoid tổng hợp và tự nhiên từ thực
vật có tiń h kháng viêm ưu viê ̣t hơn các thuố c

glucocorticoid đã tim
̀ thấ y trước đó .

Điề u này đã được khẳng định trong các nghiên cứu của Schäcke và cộng sự [38]. Sử

8

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

dụng mơ hình sàng lọc

Nguyễn Thị Tươi

in vitro theo cơ chế hoa ̣t hóa hay ức chế

thụ thể

glucocorticoid và mơ hình gây viêm in vivo trên ch ̣t NMRI để theo dõi các phản

ứng phụ đặc trưng của

thụ th ể glucocorticoid

cũng như động dược học

(pharmacokinetic) của chất tiềm năng , các tác giả đã phát hiện thấy chất ZK
245186, mô ̣t chấ t ức chế cho ̣n lo ̣c

thụ thể glucocorticoid mới không có bản chấ t

steroid đang trong giai đoa ̣n thử nghiê ̣m cho xử lý viêm bề mă ̣t , thể hiê ̣n hoa ̣t tin
́ h
kháng viêm ưu việt nhất hiện nay.

2.1.3.Thụ thể họ toll-like và cơ chế kháng viêm
Đáp ứng ban đầu hay đáp ứng bẩm sinh với quá trình viêm gây ra bởi các mầm
bệnh là đáp ứng không đặc hiệu của quá trình bảo vệ vật chủ. Năm 1996, Toll đã
phát hiện ra protein c ủa ruồ i dấ m Drosophila và nhâ ̣n thấ y r ằng protein này khơng
chỉ địi hỏi trong sự phát triển của phơi đối với ruồi mà còn đáp ứng hiệu quả chống
lại nấm [30]. Từ khám phá này, các nghiên cứu đã phát hiện và hiểu rõ được chức
năng của các protein có tên go ̣i toll trong quá trình đáp ứng miễn dịch bẩm sinh. Ở
chuột có 12 loại thu ̣ thể toll go ̣i là toll like receptors

(TLR) được phân loại thành

TLR1- TLR12, ở người thì chỉ có 11 loại TLR. TLR là protein màng loại I được
biểu hiện trong các tế bào miễn dịch tham gia đáp ứng ở giai đoạn đầu tiên của vật
chủ đối với mầm bệnh bao gồm các đại thực bào (macrophage), tế bào tua, tế bào da
và bạch cầu trung tính. Lớp thụ thể này được gọi là các thụ thể nhận dạng mẫu mầm

bệnh (PRR). Chúng có khả năng nhận dạng rấ t phong phú t ừ protozoa tới vi khuẩn,
nấm và virus. Đây là các thu ̣ thể nhâ ̣n biế t quan tro ̣ng nhấ t các sản phẩ m của vi sinh
vâ ̣t. Các vùng ngoại bào của T LR chứa các motif giàu leucin (LRR) lă ̣p đi lă ̣p la ̣i
tạo dạng đế ngựa có thể nhận biết các LPS của vi khuẩn gram (-), peptidoglican của
vi khuẩ n gram (+), các lipoprotein, pipopeptide, roi (flagellin)…của vi khuẩ n . TLR
phát hiện các mầm bệnh bằng liên kết với các phân tử mẫu ở vi sinh vật (PAMPs).
Lớp thụ thể này, sau khi nhận dạng ra mầm bệnh sẽ truyền tín hiệu vào bên trong tế

9

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

bào. Khi đã đươ ̣c nhâ ̣n biế t , các LRR của TLR khơi mào hàng loạt chuỗi các
chuyể n hóa , ví dụ LP S hoa ̣t hóa TLR 4, oligoderoxynucleotide vi khuẩ n hoa ̣t hóa
TLR9… và kích hoạt sản xuất các cytokine, chemokine tiền viêm và kháng viêm,
interferon, quá trình phosphoryl hóa các yếu tố tự phân bào protein kinase
(mitogen-activated protein kinases-MAPKs), hay phản ứng oxi hóa [31]. Bên ca ̣nh
đó, TLR còn tham gia vào q trình kích thích ban đ ầu các lớp tín hiệu trong các tế
bào để phát triển miễn dịch đáp ứng nên được xem như là các thành viên kích thích
viêm. Trong sớ này , TLR4 tham gia hoạt động trong hệ thống miễn dịch cảm ứng
bằng lipopolysccharides vi khuẩn (LPS) thông qua nhận dạng đặc hiệu những phân
tử ngoại độc tố (lipid A). Đây là một yế u tố cơ b ản trong đáp ứng miễn dịch với vi
khuẩn gram âm. Quá trình hoạt động đầ y đủ của TLR truyền tín hiệu địi hỏi sự hợp
tác hoạt động của một vài adapter tín hiệu, bao gồm MyD88 (myeloid
differentiation primary response protein 88) và những adaptor của MyD88, chẳng

hạn như các tín hiệu của TLR2 phụ thuộc hoàn toàn vào MyD88(myeloid
differentiation primary response protein 88), hay TLR4 phụ thuộc vào đoạn protein
có chứa MyD88/TIR (TIRAP) hoặc đoạn thụ thể toll/IL-1 có chứa một adapter kích
thích sinh interfron (TRAM) để tạo ra những đáp ứng phân biệt [32] (Hình 3).

Hình 3. Cơ chế hoạt động của một số TLR [30]
Tín hiệu TLR khơng thích hợp hoặc khơng kiểm sốt được sẽ làm ảnh hưởng
xấu tới sinh lý m ầm bệnh của nhiều bệnh bao gồm: bệnh nhiễm trùng, các bệnh

10

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

viêm loét đại tràng, hội chứng mẫn cảm miễn dịch hay bệnh hủi. Nhiễm trùng có
thể được định nghĩa như những điều kiện lâm sàng gây ra b ởi đáp ứng miễn dịch
của bệnh nhân với quá trình nhiễm trùng, được đặc trưng bởi viêm hệ thống và q
trình đơng tụ [16]. Các n ỗ lực nhằ m đi ều trị kháng viêm (kháng LPS, kháng
cytokine) và kháng đông tụ trong nhiều năm qua đề u không mang la ̣i hiệu quả bởi lẽ
các liệu pháp này b ị giới hạn bởi tin
́ h kháng nhi ễm và viê ̣c chăm sóc h ỗ trợ khơng
được xử lý dưới góc độ mầm bệnh về mặt sinh lý học. Các nghiên cứu chu ẩn đoán
cho thấ y nhi ễm trùng gram âm chiếm khoảng 60% trong tổng số các trường hợp và
LPS là chất truyền đi ban đầu kích thích đáp ứng tăng cường viêm thơng qua hệ
thống miễn dịch. Ngoài ra , Bhattacharjee và Akira (2005) cũng chứng minh được
TLR4 là thụ thể nhận dạng đặc hiê ̣u LPS với bằ ng chứng là các vi khu ẩn đột biến

LPS không bộc lộ hoặc các động vật thiếu TLR4 khơng pháp triển chống nhiễm
khuẩn trong quá trình đáp ứng với LPS [10]. Với phát hiê ̣n này , các nhà nghiên cứu
hy vo ̣ng rằ ng viê ̣c điề u tri ̣bê ̣nh nhiễm trùng vi khuẩn có thể đươ ̣c cải thiê ̣n nhờ cách
can thiê ̣p vào con đường tín hiệu TLR, cụ thể là TLR4. Chất ức chế phân tử liên kế t
với TLR4 là MD-2 được xem như một đại diện chống viêm đã có m ặt trong danh
sách của các thuốc tiềm năng. Bên ca ̣nh đó , viê ̣c phát hiê ̣n thấ y LPS là phố i tử đă ̣c
hiê ̣u của TLR4 cũng giúp định ra hướng nghiên cứu mới về đi ều trị nhiễm trùng sử
dụng mơ hình chuột gây nhiễm trùng bởi LPS . Đây là hướng nghiên cứu rấ t có triể n
vọng trong việc tìm ra đư ợc các chất có khả năng kìm hãm quá trình sinh ra các yếu
tố gây viêm [10]. Chính vì thế , trong sớ các TLR đươ ̣c phát hiê ̣n thì TLR 4 được
quan tâm nghiên cứu nhiề u nhấ t .
TLR4 đươ ̣c nhận dạng đầu tiên và chứng minh chức năng thông qua nghiên cứu
với chuột C3H/HeJ và C57BL/10ScCr kháng LPS [31]. Các nghiên cứu ở chuột đột
biến đã chứng minh vai trò c ủa TLR4 trong quá trình bảo vệ chống lại nội độc tố
trong máu [22]. Chuột bị đột biến TLR4 có tính nhạy cảm v ới q trình nhiễm vi
khuẩn gram âm hệ thống so với đớ i chứng [43] vì quá trình hoạt động của TLR4 là
rấ t cầ n thiế t để ta ̣o mi ễn dịch bảo vệ chống lại q trình viêm cũng như truyền các
tín hiệu viêm nhiễm ngoại độc tố hệ thống mô ̣t cách hi ệu quả. Hàng loạt các nghiên

11

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

cứu về các mầm bệnh vi khuẩ n gram âm bao g ồm Neisseria meningitides, E. coli,
Haemophilus influenzae, Kleb-siella pneumoniae và Brucella abortus, S.

pneumoniae và Mycobacteria tuberculosis trên mơ hình chuột bị nhiễm kh̉ n đã
chứng minh vai trò quan tro ̣ng c ủa TLR4 [39]. TLR4 cũng có thể nhận dạng đươ ̣c
một sớ loại virus trong quá trình viêm bao gồm virus syncytial [28], các retrovirus ở
chuột, virus gây u động vật có vú và gây ung thư máu ở chuô ̣t

(murine leukemia

virus) [36]. Vai trò của TLR4 trong các bệnh lây nhiễm ở người đã được chứng
minh thông qua các nghiên cứu về tính đa hình biể u hiê ̣n của TLR 4 trong các bệnh
lây nhiễm tế bào, bệnh lây nhiễm, nhiễm trùng, quá trình lây nhiễm gram hoặc các
vi khuẩn khác như vi khuẩ n lao hay số t rét [20, 25, 41].
2.1.4.Tế bào marcrophage
Đại thực bào (macrophage) là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có
vai trị quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc
hiệu ở động vật có xương sống. Vai trị chính của chúng là thực bào các thành phần
cặn bã của tế bào và các tác nhân gây bệnh. Ngồi ra, chúng cịn đóng vai trị các t ế
bào trình diện kháng nguyên khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể. Do
đóng vai trị quan trọng trong quá trình thực bào của cơ thể, đại thực bào có liên
quan đế n m ột số tình trạng bệnh lý do miễn dịch. Ví dụ các đại thực bào tham gia
vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn thương viêm do nhiều
nguyên nhân khác nhau. Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong nhiễm
trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokine gây viêm mạnh, đóng vai trị quan
trọng trong q trình bệnh sinh của các hội chứng này. Các cytokine chính được
phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố hoại tử khối u α
(Tumor Necrosis Factor α - TNF α), IL-6, IL-8, IL-12, interferon (IFN)-γ, nitric
oxide (NO) và các phân tử dính kết tế bào dẫn đến làm tăng quá trình viêm

. Như

vâ ̣y, viê ̣c kiể m soát sản xuấ t các chấ t này có thể làm giảm khả năng viêm

.

Macrophage là tế bào có kić h thước tương đố i lớn và có khả năng đáp ứng nhanh
với các kích thích viêm ta ̣o ra bởi LPS . Ngoài ra, các TLR ở macrophage được biểu
hiê ̣n mạnh hơn so với các tế bào ba ̣ch cầ u khác

(Hình 4) nên nó thường đươ ̣c l ựa

12

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

chọn trong các mơ hình sàng lọc và nghiên cứu cơ chế kháng viêm in vitro của chất
quan tâm [48].

Macrophage
Granulocyte

Hình 4. Biể u hiêṇ của các TLR ở các tế bào bạch cầu [47]
2.1.5. Các mơ hình sàng lọc chất kháng viêm in vitro
Viê ̣c sàng lo ̣c các chấ t có hoa ̣t tin
́ h sinh ho ̣c thường đươ ̣c bắ t đầ u với mô hin
̀ h in
vitro. Hê ̣ thố ng in vitro cho phép sàng lo ̣c nhanh , hiê ̣u quả, đơn giản và ít tố n kém

hơn nhiề u so với sử du ̣ng mô hin
̀ h sàng lo ̣c in vivo. Ví dụ sử dụng mơ hình sàng lọc
chấ t kháng viêm in vitro sẽ rút ngắn thời gian sàng lọc xuống tới hơn

10 lầ n mà

không phải sử du ̣ng đô ̣ng vâ ̣t thực nghiê ̣m vì qui đinh
̣ về đa ̣o đức đố i với các nghiên
cứu hiê ̣n nay ở các nước phát triể n là phải giảm tố i đa tới mức có thể viê ̣c sử du ̣ng
đô ̣ng vâ ̣t thực nghiê ̣m . Hiê ̣n nay , để sàng lọc các chất chống viêm , các phịng thí
nghiê ̣m trên thế giới sử du ̣ng chủ yế u các mô hin
̀ h in vitro với tế bào macrophage.
2.1.5.1. Mô hình sàng lọc sử dụng gen ch ỉ thị luciferase có gắ n NF -κB (NF-κB
dependent luciferase reporter assay)
NF-κB là nhân tố phiên mã phản ứ ng nhanh ("rapid-acting" primary transcription
factors) có vai trị chính trong sản xuất các cytokine tiền viêm và các chất trung
gian, do đó đóng vai trò quan tro ̣ng trong điề u hòa đáp ứng tế bào

. NF-κB là tác

nhân đáp ứng đầ u tiên khi tế bào bi ̣kić h thić h . Các chất kích thích hoạt động của
NF-κB gờ m rấ t nhiề u ́ u tớ

, ví dụ như các gốc oxi hoạt động

interleukin 1-beta (IL-1β), lipopolysaccharide vi khuẩ n

(ROS), TNFα,

(LPS), isoproterenol,

cocaine và sự ion hóa. NF-κB kiể m sốt nhiề u gen tham gia vào quá trin
̀ h viêm nên
không có gì nga ̣c nhiên khi nó đóng vai trò chính trong rấ t nhiề u bê ̣nh viêm như

13

TIEU LUAN MOI download :

:


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

viêm co thắ t ruô ̣t (inflammatory bowel disease ), khớp, nhiễm trùng, hen. Cùng khởi
đô ̣ng với NF -κB còn có AP-1 (activation Protein-1) điề u khiể n phiên mã các gen
tiề n viêm dưới sự kích thích của TLR. AP-1(activation Protein-1) liên quan đế n con
đường tiń hiê ̣u MAPK điề u khiể n sản xuấ t ra các TNF -α, IL-1, IL-6, IL-12, NO và
PG. Vì NF-κB là chìa khóa trong q trình đáp ứng viêm nên ức chế tín hiệu NF -κB
là liệu pháp có triển vọng trong điều trị các b ệnh về viêm . Ví dụ như các thuốc
disulfiram, olmesartan và dithiocarbamates đang bán trên thi ̣trường . Rấ t nhiề u các
chấ t tự nhiên đươ ̣c biế t có hoa ̣t tính chố ng ung thư và chố ng viêm đề u thể hiê ̣n khả
năng ức chế NF -κB. Vì thế, các dịch chiết từ thực vật có thể là nguồn cung cấp các
chấ t ức chế của NF -κB hiê ̣u quả [33]. Trong mô hình sàng lo ̣c sử du ̣ng gen chỉ thị
luciferase có gắ n NF -κB, tế bào marcrophage của chuô ̣t đươ ̣c chuy

ển nhiễm

(transfected) với gen mã hóa luciferase có gắ n trung tâm liên kế t NF -κB. Viê ̣c gắ n
gen thông báo luciferase cho phép xác đinh
̣ đươ ̣c mức đô ̣ biể u hiê ̣n gen t

hông qua

viê ̣c đo hoa ̣t đô ̣ enzyme luciferase khi có mă ̣t cơ chấ t luciferin để ta ̣o thành sản
phẩ m phát quang có thể đo đươ ̣c b ằng huỳnh quang kế (luminator). Khi chấ t nghiên
cứu có tác du ̣ng ức chế biể u hiê ̣n của NF -κB, nó sẽ làm giảm hoạt độ của enzyme
luciferase. Sử du ̣ng mô hiǹ h này , Chao và Lin (2010) đã sàng lo ̣c và phát hiê ̣n thấ y
8 chấ t từ dich
̣ chiế t ethyl acetate của thực vâ ̣t Andrographis paniculata có khả năng
chố ng viêm [14]. Trong số này , chấ t andrograpanin thể hiê ̣n cả tin
́ h kháng viêm và
chố ng nhiễm trùng thông qua ức chế biểu hiện của gen luciferase phụ thuộc NF-κB
(NF-κB-dependent luciferase gen expression ). Kế t quả là mức đô ̣ giải phóng các
chấ t trung gian TNF-α, IL-6, macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2), oxit nito
(NO) bị giảm đi. Đi sâu nghiên cứu cơ chế kháng viêm, các tác giả đã phát hiện chất
này đã làm giảm sự sinh các oxit nito nội sinh

(iNOS) đươ ̣c cảm ứng bởi LPS và

tăng cường cảm ứng ở con đường tín hiệu ERK 1/2 và PI3K cũng như tăng cường
viê ̣c gắ n của oligonucleotide NF -κB vào protein nhân thông qua con đường tín hiê ̣u
ERK1/2 hay PI3/AKt. Phải nói rằng, sàng lọc sử dụng gen chỉ thị luciferase có gắn
NF-κB là phương pháp rấ t ưu viê ̣t và đươ ̣c mô ̣t số phòng thí nghiê ̣m trên thế giới sử
dụng. Tuy nhiên , do điề u kiê ̣n trang thiế t bi ̣của phòng thí nghiê ̣m Viê ̣t Nam hiê ̣n

14

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

nay chưa cho phép đo đươ ̣c mức đô ̣ biể u hiê ̣n gen

NF-κB sử du ̣ng máy luminat or

nên ta ̣i thời điể m hiê ̣n ta ̣i, chúng tôi chưa tiến hành triển khai mơ hình sàng lọc này .
LPS

Tế bào
macrophage

Marcrophage mang
gen luciferase
phụ thuộc NF-κB

Ưc chế biểu
hiện gen luciferase
phụ thuộc NF-κB

- Dịch chiết thực vật
- Chất nghiên cứu

- Dịch chiết tiềm năng
- Chất tiềm năng

Hình 5. Mơ hin
̀ h sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng gen thông báo luciferase có gắ n NF-κB
Đối tượng nghiên cứu tách lấy tế bào Macrophage. Sau đó bổ sung LPS,
chuyển gen luciferase, bổ sung thêm dịch chiết thực vật hoặc chất nghiên cứu.
Nghiên cứu khả năng ức chế biểu hiện gen luciferase ta thu được dịch chiết tiềm
năng hoặc chất tiềm năng.
2.1.5.2. Mô hình sàng lọc sử dụng thụ thể glucocorticoid
Đặc tính hóa ho ̣c của các loại thuốc điề u tri ̣viêm mới đặc hiệu thông qua thụ
thể glucocorticoid đã chứng minh hiệu quả ức chế chọn lọc các yếu tố phiên mã gen
điều khiển GRE (glucocorticoid response element) và hạn chế được một số hiệu ứng
phụ của th́ c . Những chấ t có kh ả năng kìm hãm quá trình phiên mã như vâ ̣y đư ợc
gọi là các phối tử chọn lọc của thụ thể glucocorticoid (selective glucocorticoid
receptor adaptors-SEGRAs) [40], ví dụ như hydrocortisone , prednisolone, methyl
predniso, dexamethasone, betamethasone. Hướng nghiên cứu này đã đươ ̣c Jo và
cô ̣ng sự ở Đa ̣i ho ̣c Chungnam , Hàn Quốc rất quan tâm . Nhóm nghiên cứu đã ch ứng
minh được chấ t Compound K chi ết xuất từ sâm của Hàn Quốc là một phố i tử của
thụ thể glucocorticoid thông qua mơ hình sàng lo ̣c thụ thể glucocorticoid [46]. Gần
đây, nhóm nghiên cứu của Elewaut (2009) đã phát hiê ̣n m ột chất tự nhiên khác có
tên là Compound A (CpdA) tách từ cây Salsola ở Namibia có tính chấ t SEGRs
(selective glucocorticoid receptor) bằ ng viê ̣c s ử dụng mơ hình sàng lọc thụ thể

15

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

glucocorticoid in vitro và in vivo. So sánh hiệu quả của Compound A và
dexamethasone đã cho th ấy dexamethasone vẫn dẫn tới tăng đường huyết và tăng
insulin trong khi đó Compound A khơng kích thích gây ra các hi

ện tượng này.

Chính việc phát hiện Compound A đã mở ra một hướng đi mới trong việc sử dụng
các phối tử của thụ thể glucocorticoid từ các chiết xuất thực vật để điề u tri ̣các b ệnh
viêm nhiễm mà không gây ra các phản ứng phụ [19]. Trong mô hin
̀ h sàng lo ̣c chấ t
kháng viêm in vitro sử du ̣ng thụ thể glucocorticoid, thụ thể glucocorticoid trên tế
bào macrophage, sau khi đươ ̣c gây ức chế hoa ̣t đô ̣ng bởi chấ t ức chế đă ̣c hiê ̣u , thì tế
bào sẽ được g ây cảm ứng viêm bằ ng LPS và xử lý với các chấ t nghiên cứu

. Hàm

lươ ̣ng các chấ t trung gian đươ ̣c giải phóng ra trong quá trình viêm (TNF-α, IL-6, IL10) bị ức chế sẽ gợi ý khả năng dịch chiết nghiên cứu có chứa phối tử của

thụ thể

glucocorticoid (chấ t chố ng viêm tiề m năng ). Để khẳ ng đinh
̣ điề u này , các tế bào
macrophage mang gen GR-siRNA (glucocorticoid receptor-Small interfering RNA)
sẽ được sử dụng để sàng lọc thứ cấp . Nế u kế t quả nhâ ̣n đươ ̣c là tương tự với kế t quả
sàng lọc ban đầu thì có thể khẳng định chắc chắn phối tử của thụ thể glucocorticoid
có mặt trong dịch chiết nghiên cứu và cơ chế kháng viêm của nó là

ức chế hoạt

động của thụ thể glucocorticoid thông qua ức chế NF-κB di chuyể n vào nhân t ế bào
(Hình 6).

LPS

Tế bào
macrophage

Chất ức chế
GR RU486

Marcrophage có
GR bị ức chế

- Dịch chiết thực vật
- Chất nghiên cứu

Đo mức độ ức chế chất
trung gian giải phóng ra

Có thể là phối tử của GR
trong mẫu nghiên cứu

Ức chế biểu hiện gene
GR-siRNA trong macrophage

Khẳng định là phối tử của GR
trong mẫu nghiên cứu

16

TIEU LUAN MOI download :


Luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Tươi

Hình 6. Mơ hin
̀ h sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng thu ̣ thể glucocorticoid (GR)
Động vật nghiên cứu tách lấy tế bào Macrophage, bổ sung chất ức chế GR
RU486. Sau đó bổ sung thêm LPS và dịch chiết thực vật hoặc chất nghiên cứu. Đo
mức độ ức chế thông qua chất trung gian giải phóng ra. Từ kết quả có thể khẳng
định có phối tử GR trong mẫu nghiên cứu. Ức chế biểu hiện gene GR-siRNA trong
Macrophage từ đó khẳng định phối tử GR có trong mẫu nghiên cứu.

2.1.5.3. Mơ hình sàng lọc sử dụng thụ thể toll like (TLRs)
Kể từ khi TLR của động vật có vú được chứng minh là những yế u tớ kích thích
cơ bản của hệ thớ ng miễn dịch bẩm sinh thì viê ̣c khám phá ra nh ững mầm bệnh vi
sinh vật đươ ̣c thực hiê ̣n thông qua các thu ̣ thể này TLR . TLR có thể nhận dạng một
phổ rộng các vi sinh vật và nhanh chóng sản xuất ra các chemokine, cytokine,
interferon và phản ứng oxy hóa kháng lại vi sinh vật để bảo vệ vật chủ chống lại sự
xâm nhập của mầm bệnh. Hơn nữa, tín hiệu TLR có thể k ết nối đươ ̣c v ới nhiều
bệnh khác nhau . Các nhà nghiên cứu hy v ọng rằ ng các ki ến thức sinh học về TLR
sẽ cho phép thiết kế những liệu pháp điều trị viêm mới, mang lại hiệu quả trong
điều trị bệnh. Nhiều công ty dược phẩm và phịng thí nghiệm đã tổng hợp đươ ̣c
những phân t ử nhỏ, là những chất ức chế hoặc là phối tử đặc hiệu của TLR, chẳng
hạn như CpG7909, imiquimod, resiquimod hay chloroquine [10] và đã chứng minh
đươ ̣c chúng rất an toàn khi sử dụng cho con người. Đặc biệt, CpG đã đươ ̣c sử du ̣ng
thử nghiệm làm tá dược vacxin cho rấ t nhiều bệnh của người. Điề u thú vi ̣là dựa vào

những tín hiệu của thụ thể TLR4, một số hợp chất từ thực vật cũng đ ã được chứng
minh có khả năng điều hịa đáp ứng viêm và điều trị hiệu quả chuột bị nhiễm khuẩn
nặng và chống nhiễm trùng. Ví dụ các ch ất tách chiết từ nhân sâm Hàn Quốc như

17

TIEU LUAN MOI download :