Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4114054

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN







Nguyễn Thị Tươi





NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM CỦA
CÂY NHỌ NỒI VÀ NGẢI CỨU THÔNG QUA THỤ
THỂ TLR4



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






Nguyễn Thị Tươi




NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM
CỦA CÂY NHỌ NỒI VÀ NGẢI CỨU THÔNG
QUA THỤ THỂ TLR4

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA
HỌC:

TS. Trịnh Tất Cường





Hà Nội - 2012
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi


MỤC LỤC


Trang
MỞ ĐẦU
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
3
1. Khái niệm viêm
3
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
3

2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
3


2.1.1. Các chất kháng viêm
3

2.1.1.1. (NSAID)
3



2.1.1.2.






4



2.1.1.3. 
4


2.1.2. Thụ thể glucocorticoid (GR) và cơ chế kháng viêm
5


2.1.3.Thụ thể họ toll-like va
̀
cơ chế kha
́

ng viêm
7


2.1.4.Tế ba
̀
o marcrophage
12


2.1.5. Các mô hình sàng lọc chất kháng viêm in vitro
13



2.1.5.1. 









  th 


NF-B (NF-B dependent luciferase reporter assay)
13

2.1.5.2. 














15



2.1.5.3. 














(TLRs)
17



2.1.5.4.












LPS
19

2.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
20
3. Cây nhọ nồi và cây ngải cứu

22

3.1. Cây nhọ nồi
22
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi



3.2. Cây ngải cứu
23
4. Vai trò Wedelolactone của cây nhọ nồi và một số hợp chất của ngải cứu
trong quá trình chống viêm
24

4.1. Wedelolactone
24

4.2. Một số hợp chất của cây ngải cứu
25
Chƣơng 2- ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
27

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
27


2.1.1.Động vật thí nghiệm
27

2.1.2. Hóa chất
27


2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
27

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
27


2.2.1.Tách chiết macrophage từ tủy xƣơng của chuột.
27


2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng
sống của BMDM bằng kít CCK-8
27


2.2.3. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit
28



2.2.3.1. Gii thiu v 
28

c
28



m
29


2.2. 4. Phƣơng pháp Western blot
31



2.2.4.1. Gii thiu v 
31



2.2.4c
31


2.2.5. Phân tích ức chế của Wedelolactone trong quá trình tạo phản
ứng oxy hóa
36


2.2.6.Phân tích thống kế
37

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi


Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
38

3. 1. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hƣởng bởi Wedelolactone
38

3.2. LPS kích thích tế bào BMDM sinh cytokine
39

3.3. Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine thông qua thụ thể
TLR4 kích thích bằng LPS
40

3.4. LPS kích thích hoạt động của yếu tố tự phân bào (MAPK) thông
qua thụ thể TLR4
41

3.5. Wedelolactone ức chế quá trình phospho của yếu tố tự phân bào
bằng LPS kích thích thông qua thụ TLR4
42

3.6.Wedelolactone đã ức chế quá trình sinh ROS thông qua thụ thể
TLR4 kích thích bằng LPS
43

3.7. LPS kích thích hoạt động p47 phox trong quá trình tạo ra ROS
44

3.8. Wedelolactone ức chế quá trình sinh ROS thông qua thụ thể TLR4
bằng LPS
45

3.9. Dầu ngải cứu không gây độc đối với BMDM
46

3.10. Dầu ngải cứu không có khả năng ức chế quá trình sản xuất
cytokine thông qua thụ thể TLR4 bằng LPS
47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
50











Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi


Giải thích các chữ viết tắt

TT
Từ viết tắt
Nghĩa từ viết tắt
1.
BMDM
Bone Marrow-Derived Macrophage
2.
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
3.
IL
Interleukin
4.
LPS
Lipopolysaccharides
5.
NF-
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells
6.
ROS
Reactive oxygen species
7.
TLR
Toll-like receptor
8.
TNF
Tumor necrosis factor/ Tumor necrosis factor alpha
9.

OD
Optical Density




















Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi


Danh mục các hình trong luận văn


TT
Thứ tự hình

Trang
h 1.










Glucocorticoid 


7

a Glucocorticoid
7

hong ca mt s TLR
10



















12

 -
B
15
















(GR)
16















(TLRs)
18









in vivo 





20

 ni
23

i cu
24

Cc ca Wedelolactone
25
2.
Bi i vi t 
38
3.
Bi  n xut cytokine tin

39
4.
Bi Wedelolactone c ch 
ng zymosan
40
5.

BMDM
41
6.
c ch 

trong BMDM
42
7.
Wedelolactone hoc Dex c ch      c

43
Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi


18.
       a p47phox trong
BMDM.
44
19.
Wedelolactonc ch a p47phox
45
20.
Du ngi ci vi t 
46
21.
Tinh du ngi c     c ch   
cytokine ting LPS
47

Lut nghip Nguyn Th 


1


M U
ng t   chng lnh t
 ngoc
binh. Kt qu ci b hoc tri
iu ki
nu thi gian tn t chuyn t n c
ng hu qu . Nh
i phi k i loi cht, nh
n hong c n dn suy
gim cha th
Do vu tr m bng bt li ci v 
v ht sc quan trng hic biu tr b
thu  bian

g yc tng hi thu
ng    
ng ph n. S dng thun
gc thc v gii quyt nhng lo ngu qu
p.
n nay, vit ch mn gc t thc vt
 i nhng hiu qu c    m
Tr i hc Khoa hc T 
N s t ch
        n 
u khc kh 
 


Lut nghip Nguyn Th 


2

                
nh
           

  





M 

M
c chia Wedelolactone 
tinh du ngi cu trong t  th TLR4.
c kh i cu trong t 
 th TLR4.
Nu
 a Wedelolactone u ngi cu 
n xut cytokine tiu t c hiu ca TLR4,
  dng LPS.
    c ch ca Wedelolactone   u ngi cu  
c ch yu t t MAPK ( mitogen-activated protein kinase).
3    c ch ca Wedelolactone   u ngi cu  
o phn u t c hiu TLR4,  
 dng LPS.




Lut nghip Nguyn Th 


3



 1- TU
1. 
   t ph  ng sinh hc phc tp c  
mch v  


 do b m bnh hay
ng t  hm bo v ci b hay sa
cha nhng v   li. 





 , 

(migrating cells) :  , ,  , 

, 
 











 an, 


 rostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, 
 (PAF) -1. 




 ,  , TNF-,  , H
+
,


 , 













 .
t ra cy ci
nh n ti hing b 
h



 dn ti b . 




  dn ti hiu
qu 

  
        chi        
huyn mch, thic b t 
hu qu tip sau dn tt ch
 vong [37].






Lut nghip Nguyn Th 


4

2. c
c
2.1.1. 
3 :
2.1.1.1.  (NSAID)











 , 

. 


  prostaglandins (PG).



















 (COX), 








 

 (PG) 
thromboxane (TX). 

 





 (NSAID) 
 . 











 
(NSAID) 













prostaglandins (PG) 
. , salysilate, 



















 prostaglandins (PG) 





 
 . 












[42].
2.1.1.2.

t hp cht h4 cycloalkane. 










 . 
phospholipases A2,  2
 . 

, 

















prostaglandins (PG), thromboxane leukotrienes. 
 i

 2 










 







 , lipomodulin hay renocortin
 15, 30  40 kDa. 

















 , 











 t
 [42]. 
glucocorticoid.
Lut nghip Nguyn Th 

5

2.1.1.3. 












 . 





 ,










































enzyme lysosom . 




















glycoprotein 8400 Da. 
































[42].
2.1.2. (GR) 
 th nhn dng mu (pattern recognition receptors  PRRs), bao g
th th toll--1 chi phi kh a vt ch b



nhn dng nh   mm bnh (pathogen-associated molecular patterns -
PAMPs)  vi khum. Sau khi nhn dng mm b th s
truy 

  (mediator)


n dng
u [24, 12] 
cng s (2009) 





  th 
  u t           Acid Deoxyribo
Nucleic (AND)  8].
Glucocorticoid (GC) t ng thn sn xut, gm hai
ch
t. Glucocorticoid  ocorticoid
(GR). T(GR)  th th 
t 8]. T  
nh  n cu    

, th     t Acid
Deoxyribo Nucleic (AND)  n cut vi phi
t    i t c hi  t t b



a t t c hong
nh t vi phi t c hi n tnh v
Lut nghip Nguyn Th 


6

Acid Deoxyribo Nucleic (AND) c u khiu
hin c trn kt vi phi t, t
bt hot nm   
kt vi phi t c hiu, t t s ng,
  i nhng protein shock nhi    c tip v    
chui Acid Deoxyribo Nucleic (AND)   u t phn
ng Glucocorticoid (glucocorticoid response element-   
ca nhc nhng yu t (factor) 


  i protein, gia t 

 

 -1
(activator protein 1) ho

 t v













 Acid Deoxyribo Nucleic (AND)  - nuclear factor kappa-
light-chain-enhancer of activated B cells) (1).
Glucocorticoid thc hi
bng ni sinh c sn thi t nhiu ho
hc quan trng, chng hn trng ni sinh cn kinh v
h thng tim m   n ng min d     m.
Glucocorticoid 



 c ch min dc
 vi nhiu bm, mn cm min dch, d 
n ca t ,  p kh Mc
 Glucocorticoid tng h   i di    t v ch 
 di sinh ra nhng phn ng ph .






 , c c c   


 i t ca t
glucocorticoid 





 a phi t 



 i
ng cua ph

t- phi t
l

 

i t  th oestrogen. 




t vn gi c hoi gi
kh u ng ph. 










  n
c nhiu hp ch u qu 



 Glucocorticoid 





Lut nghip Nguyn Th 


7

1. 











Glucocorticoid 



[49]

    a Glucocorticoid (       



 ng s 





 c ch ng c
yu t 

- AP-1 (activator protein -1) [34].
Lut nghip Nguyn Th 


8


2: 

a t [33]






  t 







 glucocorticoid s di chuy .  t vi 
yu t phn ng Glucocorticoid (glucocorticoid response element-GREs) 
ng steroid, dn tt
glucocorticoid  

 a nh
  (glucocorticoid response element)
g. Khi hong, t 
t vi NF-  
nh . 

  xy ra trong


c  . glucocorticoid 


ca gen IКBα  (NF-kappa-B inhibitor alpha) dn ti
    ng c   kt vi NF-   (NF-
kappa-B inhibitor alpha) i ca NF-c h NF-
n ti NF- 
















 .
Nhng NF- b i phc h  b t bt c
cn tr 

  .  







 




 ng phi t t tng h  thc
v










 glucocorticoid 







.


c khnh tro





ng s [38]. 


Lut nghip Nguyn Th 

9

 in vitro 





 t
glucocorticoid  in vivo 










 t  
(pharmacokinetic)  , 
245186, 








 t 


















 , 








.

2.1.3. toll-






ng bm sinh vm
b c hiu co v vt ch. 1996, 


 



 
ch i trong s n ci vi rung hiu qu chng
li nm [30]. T  c chc








 ng min dch bm sinh. 
chu








 
TLR1- TLR12,  h c
biu hi n dng  a vt
ch i vi mm bnh bao g

i th  
ch cp th th  c g th nhn dng mu mm
b n d

  protozoa ti vi khun,
n. 























.  





 (LRR) 






 (-), 




(+), , pipopeptide, roi (flagellin)




. TLR
m bnh bt v 

 vi sinh vt (PAMPs).
Lp th th n dng ra mm bnh s truy
Lut nghip Nguyn Th 


10

. 





 , 




 ,  



 4, 







t sn xu
      u t t    
(mitogen-activated protein kinases-MAPKs), hay phn  [31]. 




, 

 
 n min d
. 

 , TLR4 tham gia hong trong h thng min d




bng lipopolysccharides vi khun dc hiu nh
t ngoc t  ng min dch vi vi
khu ca TLR truy hii s hp
  ng ca m    u, bao gm MyD88 (myeloid
ng adaptor ca MyD88, chng
h    u ca TLR2 ph thu    (myeloid
differentiation primary response protein 88), hay TLR4 ph thun protein
a MyD88/TIR (TIRAP) hon th th toll/IL-1 



 to ra nht [32] (3).



hong ca mt s TLR [30]
p ho

 ng
x

 m bnh ca nhiu bnh bao gm: bnh nhi  nh
Lut nghip Nguyn Th 


11

i chng mn cm min dch hay bnh hi. Nhi
th u ki

 ng min dch
ca b thng 
   [16].   l u tr     
 trong nhi

u qu 







  gii h



 

  tr 
c x  mm bnh v mc.  
m khong 60% trong tng s ng h
t truy 
thng min dch. Ngo,  (2005) 
 th nhn d



 







 n t bin
c l hong vt thim
khung vi LPS [10]. 








, 








 














u TLR, 4. Cht c ch 





4 MD-i din ch

 t trong danh
c ti. 



, 
















4  u tr nhi
dh chu






. 












 u
t  [10].  , 









 c

quan 

.
TLR4 

n dng minh chu


t C3H/

1

t
bi

 o v chng li nc t
t b t bin TLR4  m vi
khu th



 [43ng ca TLR4 




 n dch bo v chng l
m ngoc t h th




u qu. 
Lut nghip Nguyn Th 


12

cu v m b

 m Neisseria meningitides, E. coli,
Haemophilus influenzae, Kleb-siella pneumoniae  Brucella abortus, S.
pneumoniae Mycobacteria tuberculosis t b nhi


chng minh vai 

 a TLR4 [39 nhn d


mm virus syncytial [28], 
chut, virung v





 (murine leukemia
virus) [36     m    c chng















 nh
m t nm, nhim gram ho


vi khu



[20, 25, 41].
2.1.4.




i thng t bch cuth
ng trong h min dch c hi min dc
hiu  ng vn
ca t  nh. 

ng min dc hiu c. Do
i th
 t s ng bn d i thc b
              u
hi ch thng nhim
ti th

cytokine 
trnh sinh ci chc
   i th  m: interleukin-1 (IL-1), yu t hoi t kh  
(Tumor Necrosis F  -  ), IL-6, IL-8, IL-12, interferon (IFN)-, nitric
oxide (NO)   . 


, 






















 .




































 . , 












 (4) 






 
Lut nghip Nguyn Th 


13

 in vitro 
8].

4. 







 [47]
2.1.5. in vitro

























 in
vitro. 

in vitro 





 , 

, 





















 in vivo. 


 in vitro  10 











































































 . 

,  , 
n













in vitro 



.
2.1.5.1. 










  th 



 -B (NF-B
dependent luciferase reporter assay)
NF-







ng nhanh ("rapid-acting" primary transcription
factors) 
gian, 
















 . NF-








 







 . 
NF- ,  (ROS), TNF,
interleukin 1-beta (IL-1), 

 (LPS), isoproterenol,
cocaine . NF-

























 :
Macrophage
Granulocyte
Lut nghip Nguyn Th 


14



(inflammatory bowel disease), 

, 



, hen. 




 -



AP-1 (activation Protein-1) 

















. AP-1(activation Protein-1) 










 

- IL-1, IL-6, IL-12, 


PG. -

 -B
  nh  . 
disulfiram, olmesartan dithiocarbamates 






 . 






 
















 -B. , 





 -



 [33]. Trong m














 -B, 







 



(transfected) 







 -B. 




















 






























 ng hunh quang k (luminator). 

















 -B,  
luciferase. 







 , 

(2010) 













8 









 Andrographis paniculata 
[14]. 

, 

















  NF-B
(NF-B-dependent luciferase gen expression ). 














-, IL-6, macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2), oxit nito
(NO) . 




, 
 (iNOS) 







 








  1/2 3








 -









ERK1/2 hay PI3/AKt. , 
NF-























. , 
















Lut nghip Nguyn Th 


15














 NF-B 





 or










, .






5. 
















-B
   y t  M   sung LPS,
chuyn gen luciferase, b   ch chit thc vt hoc ch  u.
u kh c ch biu hic dch chit tim
c cht ti
2.1.5.2. 







glucocorticoid







i thu

c hi
th glucocorticoid 

u qu c ch chn lu t 


u khin GRE (glucocorticoid response element) n ch c mt s hiu ng
ph c. 

  



 c
g   i t chn lc ca th th glucocorticoid (selective glucocorticoid
receptor adaptors-SEGRAs) [40],  , prednisolone, methyl
predniso, dexamethasone, betamethasone. 























 ,  .  ng
 t xut t t p ca
th th glucocorticoid 



 th th glucocorticoid [46]. Gn
,  (2009) 





 t ch





 (CpdA)   



 SEGRs
(selective glucocorticoid receptor) 

  d    c th th
T bo
macrophage
LPS
- Dch chit thc vt
- Cht nghiên cu
Ưc ch biu
hin gen luciferase
phụ thuc NF-κB
- Dch chit tim năng
- Cht tim năng
Marcrophage mang
gen luciferase
phụ thuc NF-κB
T bo
macrophage
LPS
- Dch chit thc vt
- Cht nghiên cu

Ưc ch biu
hin gen luciferase
phụ thuc NF-κB
- Dch chit tim năng
- Cht tim năng
Marcrophage mang
gen luciferase
phụ thuc NF-κB
Lut nghip Nguyn Th 


16

glucocorticoid in vitro  in vivo   u qu ca Compound A 


 y dexamethasone vn dn tng huy
    Compound A 

   
n Compound A 

 ra mi trong vic s dng
i t ca th th glucocorticoid t t xut thc v



nh
n ng ph [19]. 







 in vitro 



 th th glucocorticoid,  glucocorticoid 
, 















 , 
 
















 . 














(TNF-, IL-6, IL-
10)  th th

glucocorticoid ( ). 







 , 
macrophage mang gen GR-siRNA (glucocorticoid receptor-Small interfering RNA)
. 














 th th glucocorticoid
 c ch hot
ng ca th th glucocorticoid c ch NF-B 

  

(6).







T bo
macrophage
LPS
- Dch chit thc vt
- Cht nghiên cu
Đo mc độ c chế cht
trung gian gii phng ra
C thể l phi tử ca GR
trong mu nghiên cu
c chế biu hin gene
GR-siRNA trong macrophage
Marcrophage c
GR b c chế
Cht c chế
GR RU486
Khng đnh l phi tử ca GR
trong mu nghiên cu
T bo
macrophage
LPS
- Dch chit thc vt
- Cht nghiên cu

Đo mc độ c chế cht
trung gian gii phng ra
C thể l phi tử ca GR
trong mu nghiên cu
c chế biu hin gene
GR-siRNA trong macrophage
Marcrophage c
GR b c chế
Cht c chế
GR RU486
Khng đnh l phi tử ca GR
trong mu nghiên cu
Lut nghip Nguyn Th 


17



6. 














(GR)
ng v   y t  , b sung cht c ch GR
 ch chit thc vt hoc chu
m c ch t trung gian giT kt qu  khng
i t GR trong mu. c ch biu hin gene GR-siRNA trong
Macrophage t nh phi t u.

2.1.5.3. 













(TLRs)


 khi TLR cng vc ch



n ca h n dch b





 ng mm bnh vi
sinh v











  nhn dng mt
ph r        n xu    
n i vi sinh v bo v vt ch chng li s
p ca mm b   



 t n

 i nhiu
b


 .  

 n thc sinh h
s t k nhng liu tr vii, mang li hiu qu trong
u tr bnh. Nhi  c ph      ng h




 nhng cht c ch hoi t c hiu ca TLR, chng
h7909, imiquimod, resiquimod hay chloroquine [10]  chng minh




 dc bit, 








th nghi

u b

i. 







nhu ca th th TLR4, mt s hp cht t thc v

c chng
 u tr hiu qu chut b nhim khun
n.  t t 