(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu một số locut đa hình STR ở người việt nam nhằm sử dụng trong khoa học hình sự, nhận dạng cá thể và xác định huyết thống

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T NHIấN

Lê thị bích trâm

Nghiên cứu một số locut đa h×nh str ë ng­êi viƯt nam
nh»m sư dơng trong khoa học hình sự, nhận dạng cá
thể và xác định huyết thèng

LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc

HÀ NỘI - 2016

1

TIEU LUAN MOI download :


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T NHIấN

Lê thị bích trâm

Nghiên cứu một số locut đa h×nh str ë ng­êi
viƯt nam nh»m sư dơng trong khoa học hình sự, nhận
dạng cá thể và xác định huyết thống

Chuyên ngành
: Di truyền học
MÃ số
: 62 42 70 01

Luận ¸n tiÕn sÜ sinh häc

Ng­êi h­íng dÉn khoa häc:
1. PGS.TS. Đinh đoàn long
2. pgs.Ts. trịnh đình đạt

H NI - 2016

2

TIEU LUAN MOI download :


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả các kết quả nghiên cứu trong luận án là trung
thực và chưa từng được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Nếu sai tơi
xin chịu trách nhiệm hồn tồn.

Tác giả

Lê Thị Bích Trâm

3

TIEU LUAN MOI download :


LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hồn thành tại Phịng Kỹ thuật Sinh học nghiệp vụ
thuộc Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu
cần - Kỹ thuật, Bộ Cơng an.
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn :
PGS.TS. Đinh Đồn Long, Chủ nhiệm Bộ mơn Y dược học cơ sở, Phó
chủ nhiệm khoa Y- Dược, ĐH Quốc Gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ tơi trong q trình hồn thành luận án.
PGS.TS. Trịnh Đình Đạt, Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học - ĐH
Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi
trong q trình hoàn thành luận án.
TS. Nghiêm Xuân Dũng, Thạc sĩ Trần Minh Đôn, Thạc sĩ Lương Thị
Yến - Tổng cục Hậu cần - Kỹ thuật - Bộ Công an đã giúp đỡ và đóng góp
những ý kiến q báu cho tơi trong q trình hồn thành luận án.
Khoa Sinh học cùng các phòng chức năng, phòng Đào tạo sau ĐH Trường ĐH Khoa học tự nhiên - ĐH Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân cùng
tập thể cán bộ, giáo viên Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học - Trường ĐH
Khoa học tự nhiên - ĐH Quốc Gia Hà Nội và Lãnh đạo Viện Kỹ thuật Hóa
học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ đã ủng hộ và luôn tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong quá trình hồn thành luận án.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể cán bộ Phịng Kỹ thuật Sinh
học nghiệp vụ - Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ cùng
gia đình, bạn bè ln bên tôi, quan tâm, động viên và tạo điều kiện thuận lợi
nhất để tơi có thể hồn thành bản luận án này.
Tác giả

4

TIEU LUAN MOI download :

MôC LôC
Trang
Mục lục

1

Các chữ và từ viết tắt

5

Danh mục các bảng

6

Danh mục các hình

7

MỞ ĐẦU

10

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

15

1.1. Các phương pháp nhận dạng cá thể người

15

1.1.1. Phương pháp hình thái học

16

1.1.2. Nhận dạng cá thể bằng các yếu tố có bản chất

17

protein
1.1.3. Nhận dạng cá thể người qua phân tích ADN nhân

19

1.1.4. Phương pháp phân tích ADN ty thể

20

1.2. ADN và các phương pháp phân tích đa hình ADN ứng

22

dụng trong nhận dạng cá thể người
1.2.1. Cấu trúc đa dạng trong trình tự ADN có ý nghĩa

22

trong nhận dạng cá th
1.2.2. Kỹ thuật phõn tớch đa hình chiều dài on ADN

24

bằng enzym giíi h¹n
1.2.3. Phương pháp nhân bội ADN (PCR)

24

1.2.4. Kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR)

25

1.2.5. Kỹ thuật điện di

26

1.2.6. Kỹ thuật giải trình tự

28

1.3. Các locut STR trong hệ gen người và ứng dụng của

29

chúng trong nhận dạng cá thể
1.3.1. Khái niệm các đoạn lặp và STR

29

1

TIEU LUAN MOI download :


1.3.2. Cơ sở khoa học của phân tích STR trong nhận

30

dạng cá thể và xác định huyết thống
1.3.3. Cấu trúc của STR và danh pháp quốc tế

31

1.3.4. Vai trò của các STR trong phân tích hình sự

32

1.3.5. Vai trị của việc lựa chọn, phối hợp các locut

34

STR khác nhau trong xác định huyết thống
1.4. Tình hình nghiên cứu nhận dạng cá thể người bằng

35

phương pháp phân tích ADN trên thế giới và tại Việt Nam
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

35

1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

41

1.5. Các locut sử dụng trong nghiên cứu luận án

43

1.5.1. Các locut STR

43

1.5.2. Locut Amelogenin

45

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

46

2.1. Đối tượng nghiên cứu

46

2.1.1. Mẫu sinh phẩm

46

2.1.2. Các locut đa hình STR và locut giới tính

46

Amelogenin
2.2. Thiết bị và hóa chất

46

2.2.1. Thiết bị

46

2.2.2. Hóa chất

47

2.3. Các phương pháp nghiên cứu

49

2.3.1. Thiết kế mồi

49

2.3.2. Tách chiết ADN

51

2.3.3. Phương pháp PCR đa mồi (multiplex PCR)

51

2.3.4. Phương pháp điện di và phân tích sản phẩm PCR

53

2.3.5. Phương pháp chế tạo thang alen

55

2

TIEU LUAN MOI download :


2.3.6. Phương pháp xác định trình tự các nucletotide

57

2.3.7. Khảo sát tần suất alen và xử lý số liệu bằng các

57

chỉ số thống kê
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Thiết kế mồi và lựa chọn điều kiện PCR thích hợp cho

60
60

phức 4 locut F13A01, D8S1179, Amelogenin, HPRTB

3.1.1. Thiết kế mồi cho locut F13A01

60

3.1.2. Thiết kế mồi cho locut D8S1179

61

3.1.3. Thiết kế mồi cho locut HPRTB

61

3.1.4. Thiết kế mồi cho locut Amelogenin

62

3.1.5. Sàng lọc multiplex

63

3.1.6. Lựa chọn điều kiện PCR thích hợp cho phức 4

64

locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin
3.2. Khảo sát tần suất alen và đánh giá mức độ đa hình

74

của 15 locut STR ở quần thể người Việt (Kinh) bằng các

chỉ số thống kê.
3.2.1. Kết quả khảo sát tần suất alen 15 locut STR

74

3.2.2. Đánh giá tính đặc trưng quần thể và mức độ đa

77

hình của 15 locut STR
3.3. Chế tạo thang alen 4 locut F13A01, D8S1179,

99

Amelogenin, HPRTB
3.3.1. Kết quả chế tạo thang alen locut F13A01

99

3.3.2. Kết quả chế tạo thang alen locut D8S1179

102

3.3.3. Kết quả chế tạo thang alen locut Amelogenin

105

3.3.4. Kết quả chế tạo thang alen locut HPRTB

106

3

TIEU LUAN MOI download :


3.4. Đề xuất hướng ứng dụng các locut STR trong nhận

109

dạng cá thể và xác định huyết thống ở Việt Nam
3.5. Chế tạo bộ KIT và thử nghiệm phân tích
3.5.1. Chế tạo bộ kit nhân bội ADN phức 4 locut

110
110

F13A01, D8S1179, HPRTB, Amelogenin.
3.5.2. Phân tích xác định kiểu gen cá thể

111

3.5.3. Phân tích xác định huyết thống

115

KẾT LUẬN

118

KIẾN NGHỊ

120

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

121

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
122

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

4

TIEU LUAN MOI download :


CÁC CHỮ VÀ TỪ VIẾT TẮT
Chữ/từ
viết tắt
ADN
ARN
APS
bp
CPI

Tiếng Anh
Deoxyribonucleic acid

Ribonucleic acid
Amonium persulphate
base pair
Combined Parternity Index

dNTP
EDTA
NST
PBS
PCR

Deoxynucleoside triphosphate
Ethylendiamin tetraacetic acid

PD
PE
PI

Power of Discrimination
Power of Exclusion
Paternity Index

PM
FDAH

Matching Probability
F13A01, D8S1179, Amelogenin,
HPRTB
Restriction fragment length
polymorphism

RFLP

Tiếng Việt
Axít Deoxyribonucleic
Axít Ribonucleic
Cặp bazơ
Chỉ số quan hệ huyết
thống kết hợp

Nhiễm sắc thể
Phosphate buffered saline
Polymerase chain reaction

STR

Short tandem repeat

TBE
TEMED
Tm
VNTR

Tris Borat EDTA
N,N,N’,N’- tetramethylethylene diamine
Melting Temperature
Variable number of tandem repeats

CODIS

Combined DNA Index System

CSDL
KHHS

Phản ứng chuỗi trùng
hợp
Khả năng phân biệt
Khả năng loại trừ
Chỉ số quan hệ huyết
thống
Xác suất trùng lặp

Đa hình chiều dài đoạn
được cắt bằng enzym
giới hạn.
Đoạn ngắn lặp lại liên
tiếp

Nhiệt độ nóng chảy
Đoạn lặp lại liên tiếp
với số lượng thay đổi
Hệ thống chỉ số ADN
kết hợp
Cơ sở dữ liệu
Khoa học hình sự

5

TIEU LUAN MOI download :

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

1.1 Tần suất phân bố alen 15 locut STR ở quần thể người Trung
Quốc
1.2

Tần suất phân bố alen 15 locut STR ở quần thể người Ba Lan

Trang
38
39

1.3 Tần suất phân bố alen 15 locut STR ở quần thể người Mỹ (gốc
Phi)

40

1.4 Đặc điểm của 15 locut STR sử dụng trong nghiên cứu

45

2.1 Các thông số thử nghiệm thành phần PCR phức 4 locut
F13A01, D8S1179, Amelogenin và HPTRB

52

3.1 Trình tự và thơng số các cặp mồi của 4 locut F13A01,
D8S1179, HPRTB và Amelogenin

64

3.2 Kết quả lựa chọn thành phần PCR thích hợp cho phức 4 locut
FDAH

72

3.3 Kết quả lựa chọn chu trình nhiệt thích hợp cho phản ứng PCR
phức 4 locut FDAH

74

3.4 Tần suất phân bố alen của 15 locut đa hình STR trên 250 cá thể
người Việt (Kinh)

76

3.5 Số lượng alen khảo sát được của 15 locut STR ở 250 cá thể
người Việt (Kinh)

94

3.6 Kết quả lựa chọn alen cho locut F13A01

99

3.7 Kết quả lựa chọn alen cho locut D8S1179

102

3.8 Kết quả lựa chọn alen cho locut HPRTB

106

3.9 Kết quả phân tích kiểu gen 16 locut cho 10 phạm nhân

115

3.10 Kết quả phân tích kiểu gen 16 locut mẫu (B) và (C)

6

TIEU LUAN MOI download :

117


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Sơ đồ minh hoạ các khả năng di truyền một số alen thuộc
locut STR từ bố, mẹ cho con theo định luật Mendel

31

1.2

Bộ kit phân tích gen hình sự
Hình minh họa sự phối hợp các alen khác nhau trong phương
pháp chế tạo thang alen

42
55

3.1

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra cặp mồi locut
F13A01 và D8S1179

65

3.2

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra cặp mồi locut
Amelogenin và HPRTB

65

3.3

Ảnh hưởng của nồng độ mồi tới hiệu suất PCR và khả năng
phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

67

3.4

Ảnh hưởng của nông độ MgCl2 tới hiệu suất PCR và khả
năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

68

3.5

Ảnh hưởng của nồng độ dNTP tới hiệu suất PCR và khả
năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

69

3.6

Ảnh hưởng của nồng độ Taq - ADN polymerase tới hiệu suất
PCR và khả năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut
FDAH

70

3.7

Ảnh hưởng của nồng độ ADN khuôn tới hiệu suất PCR và
khả năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

71

3.8

Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi tới hiệu suất PCR và khả
năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

73

3.9

Đồ thị tần suất alen locut D5S818 ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

77

3.10

Đồ thị tần suất alen locut D7S820 ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

79

3.11

Đồ thị tần suất alen locut D13S317 ở các quần thể người
Việt (Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

81

3.12

Đồ thị tần suất alen locut CSF1PO ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

82

2.1

7

TIEU LUAN MOI download :


3.13

Đồ thị tần suất alen locut TPOX ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

83

3.14

Đồ thị tần suất alen locut TH01 ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

84

3.15

Đồ thị tần suất alen locut D16S539 ở các quần thể người
Việt (Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

85

3.16

Đồ thị tần suất alen locut D3S1358 ở các quần thể người
Việt (Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

86

3.17

Đồ thị tần suất alen locut vWA ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

87

3.18

Đồ thị tần suất alen locut FES/FPS ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

88

3.19

Đồ thị tần suất alen locut F13B ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

89

3.20

Đồ thị tần suất alen locut LPL ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

90

3.21

Đồ thị tần suất alen locut F13A01 ở các quần thể người Việt
(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

91

3.22

Đồ thị tần suất alen locut D8S1179 ở các quần thể người
Việt (Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

92

3.23

Đồ thị tần suất alen locut HPRTB ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

93

3.24

Kết quả giải trình tự một số alen locut F13A01

100

3.25

Kết quả chế tạo thang alen cho locut F13A01

102

3.26

Kết quả giải trình tự một số alen locut D8S1179

103

3.27

Kết quả chế tạo thang alen cho locut D8S1179

104

3.28

Kết quả lựa chọn mẫu chế tạo thang alen locut Amelogenin

105

3.29

Kết quả chế tạo thang alen cho locut Amelogenin

106

3.30

Kết quả giải trình tự một số alen locut HPRTB

107

3.31

Kết quả chế tạo thang alen cho locut HPRTB

108

8

TIEU LUAN MOI download :


3.32

Bộ kit nhân bội ADN phức 4 locut F13A01 - D8S1179 HPRTB và Amelogenin (FDAH)

111

3.33

Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN
sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut D5S818 - D7S820 D13S317 (3D)

112

3.34

Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN
sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut CSF- TPOX-TH01
(CTT)

112

3.35

Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN
sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut D16S539 - D3S1358 vWA (DDW)

113

3.36

Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN
sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut D16S539 - D3S1358 vWA (FFL)

113

3.37

Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN
sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut F13A01 - D8S1179 Amelogenin và HPRTB (FDAH)

114

3.38

Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen 16 locut xác định quan
hệ huyết thống cha con.

116

9

TIEU LUAN MOI download :


MỞ ĐẦU
Lịch sử phát triển của khoa học hình sự chuyển biến sang một bước
ngoặt mới kể từ sau phát hiện của Jeffreys – năm 1985 về khả năng ứng dụng
của các đoạn ADN đa hình trong nhận dạng cá thể người và đặc biệt là sau
phát minh của Kary Mullis - nhà Hóa học người Mỹ về phản ứng PCR vào
năm 1985. Đến nay, sau gần 30 năm phát triển, giám định ADN hay giám
định gen đã thực sự trở thành cơng cụ đắc lực trong điều tra hình sự với sự
phát hiện và ứng dụng rộng rãi của hàng loạt các locut đa hình có số lượng
các đoạn lặp khác nhau trên thế giới.

Các locut được sử dụng chủ yếu hiện nay là các đoạn ADN có trình tự
lặp lại từ 4 đến 5 nucleotit được gọi là các trình tự lặp lại ngắn liên tiếp (Short
Tandem Repeat - STR) [23, 25]. Các STR có thể dễ dàng được nhân bội bằng
phương pháp PCR, đồng thời số lượng đoạn lặp trong STR rất đa dạng ở các
cá thể nên tạo ra nhiều tổ hợp khác nhau. Hiện nay, nhiều phịng thí nghiệm
khác nhau trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu khảo sát hàng loạt các locut
STR nhằm lựa chọn những locut thích hợp đặc trưng cho mỗi quần thể đồng
thời cũng lựa chọn cơng nghệ phân tích phù hợp đối với điều kiện cụ thể của
nước mình. Năm 1994, Sở KHHS Anh đã nghiên cứu phát triển bộ phức thế
hệ thứ nhất (bao gồm 4 locut) và bộ phức thế hệ thứ hai (bao gồm 6 locut đa
hình và 01 locut giới tính) với khả năng trùng lặp khoảng 1/50 triệu [23, 26].
Năm 1996, Cục điều tra liên bang Mỹ (FBI) đã tài trợ cho việc lựa chọn thành
lập các locut “chủ đạo” STR (gọi tắt là CODIS) nhằm sử dụng cho CSDL
nhận dạng ADN quốc gia. Bộ này bao gồm 13 locut STR với khả năng trùng
lặp khoảng 1/1012 [23, 24]. Nhiều quốc gia khác trên thế giới cũng đã nghiên
cứu, phát triển ứng dụng các locut dựa trên cơng nghệ phân tích phù hợp với
điều kiện của nước mình [36, 41, 44, 49, 57, 59, 60, 66, 77, 87].
Tại Việt Nam từ năm 1998 đã có sự phát triển mạnh mẽ và nhanh
chóng về trình độ cũng như khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tích ADN trong

10

TIEU LUAN MOI download :


nhận dạng cá thể, giám định huyết thống nói chung và trong giám định hình
sự nói riêng. Từ những nghiên cứu về các locut đơn lẻ ban đầu mang tính chất
thăm dò như nghiên cứu của Nguyễn Văn Lợi [9], Lê Đình Lương [11], Phạm
Hải Sáng [13], Trần Thị Quỳnh Trang [15] … đến nay đã có một số phịng thí
nghiệm đã ứng dụng thành cơng cơng nghệ phân tích ADN trong hình sự và

nhận dạng cá thể người, giám định huyết thống sử dụng các hệ thống thiết bị
phân tích hiện đại với các bộ kit của nước ngồi [6, 8, 14, 92]. Việc sử dụng
các bộ kit cho kết quả phân tích chính xác. Tuy nhiên khơng phải cơ sở nào
cũng có thể thực hiện được vì địi hỏi trang bị máy móc cơng nghệ hiện đại
với chi phí cao đồng thời phụ thuộc nhiều vào các bộ kit sẵn có.
Trước thực tế đó, từ năm 2001 đến nay, Viện Kỹ thuật Hoá học, Sinh
học và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu Cần - Kỹ thuật - Bộ Công an đã
nghiên cứu chế tạo thành công một số bộ thang alen chỉ thị và các bộ kit phân
tích đơn gen, 3 gen ứng dụng trong phân tích 12 locut đa hình STR sử dụng
cơng nghệ điện di nhuộm bạc [2-5, 9]. Việc xây dựng các bộ thang alen chỉ
thị có ý nghĩa vơ cùng quan trọng trong xác định một cách chính xác tần suất
alen quần thể người Việt đối với mỗi locut STR. Tần suất alen các locut khảo
sát đặc trưng cho quần thể người Việt là cơng cụ hỗ trợ đắc lực trong tính tốn
độ tin cậy của mỗi ca giám định. Các kết quả nghiên cứu đã giúp chủ động về
công nghệ và hiện nay đã và đang được ứng dụng tốt trong trong phân tích
gen hình sự tại một số cơ sở giám định các đơn vị công an địa phương như Hà
Nội, Hải Phịng, Thanh Hóa, Cần Thơ, Khánh Hịa...
Tuy nhiên, nếu chỉ dừng ở phân tích 12 locut thì thực tế cho thấy trong
nhiều trường hợp cụ thể, đặc biệt là với những ca giám định phức tạp (như
giám định xác định tội phạm có nhiều nghi can mà những người này lại có
quan hệ huyết thống, họ hàng...) khó cho kết quả tin cậy. Trong những trường
hợp này, số locut được sử dụng để giám định thường từ 16 đến 24 locut [30,
35, 79].

11

TIEU LUAN MOI download :


Từ thực tế nêu trên, chúng tôi nhận thấy việc mở rộng nghiên cứu để

tăng số lượng locut đang sử dụng là yêu cầu cần thiết. Hơn nữa cần có sự
đánh giá tổng thể về tính đa hình và khả năng ứng dụng của các locut STR đối
với quần thể người Việt (Kinh). Mỗi quần thể có đặc trưng phân bố tần suất
alen riêng đối với mỗi locut, có những locut thể hiện tính đa hình rất cao ở
quần thể này nhưng lại thấp đối với quần thể khác. Từ việc đánh giá đó, có
thể đưa ra được hướng ứng dụng của các locut này trong nhận dạng cá thể
phù hợp với quần thể người Việt. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài luận án “Nghiên cứu một số locut đa hình STR ở người Việt Nam nhằm sử
dụng trong khoa học hình sự, nhận dạng cá thể và xác định huyết thống” với
các mục tiêu sau :
1. Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu để nhân bội và phân tích được tính đa
hình 03 locut STR (F13A01, D8S1179 và HPRTB) nhằm bổ sung vào bộ
các locut sử dụng trong nhận dạng cá thể ở người Việt (Kinh).
2. Khảo sát, xác định được tần suất phân bố các alen thuộc 15 locut STR ở
người Việt (Kinh), gồm D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01,
TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01,
D8S1179 và HPRTB.
3. Xây dựng được thang alen chuẩn cho 03 locut F13A01, D8S1179, HPRTB
và locut giới tính Amelogenin.

4. Đánh giá được mức độ đa hình và đề xuất được hướng ứng dụng của 15
locut STR trong truy nguyên cá thể và xác định huyết thống tại Việt Nam.
* NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN
Các nội dung nghiên cứu chính của luận án gồm có:
1. Thiết kế và thử nghiệm các cặp mồi PCR đặc hiệu cho từng locut STR
chọn lọc (F13A01, D8S1179, HPRTB) để phối hợp được với locut xác
định giới tính Amelogenin trong cùng phản ứng.

12

TIEU LUAN MOI download :


2. Nghiên cứu lựa chọn thành phần và điều kiện phản ứng PCR thích hợp áp
dụng cho phức 4 cặp mồi F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin và
điện di phân tích phức 4 locut trên gel polyacrylamide biến tính.
3. Khảo sát tần suất phân bố alen và đánh giá tính đa hình thuộc 15 locut
STR ở người Việt (Kinh), gồm D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO,
TH01, TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01,
D8S1179 và HPRTB.
5. Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị cho 4 locut F13A01, D8S1179,
HPRTB và Amelogenin.
6. Đề xuất hướng ứng dụng 15 locut STR trong nhận dạng cá thể và xác định
huyết thống tại Việt Nam.
* Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIẾN
1. Nghiên cứu bổ sung bốn locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin
kết hợp với các locut đã được nghiên cứu có ý nghĩa vơ cùng quan trọng
trong việc:
-

Tăng độ chính xác trong phân tích nhận dạng cá thể và xác định huyết
thống.

-

Chủ động về công nghệ phân tích ADN phù hợp với điều kiện Việt
Nam, đáp ứng kịp thời nhu cầu giám định của các địa phương trong cả
nước.

2. Số liệu khảo sát tần suất alen của các 15 locut đa hình STR cho quần thể

người Việt (Kinh) có ý nghĩa quan trọng, được sử dụng để tính tốn độ tin
cậy của các ca giám định nhận dạng cá thể và huyết thống ở Việt Nam.
3. Nghiên cứu chế tạo thành công thang alen chỉ thị cho 3 locut F13A01,
D8S1179 và HPRTB đảm bảo độ chính xác cao trong giám định cá thể và
xác định huyết thống.

13

TIEU LUAN MOI download :


* ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Nghiên cứu xây dựng được điều kiện thích hợp để phân tích tổ hợp 4
locut đa hình mới F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin có thể
nhân bội đồng thời trong cùng một phản ứng. Bổ sung cho các tổ hợp
locut đã nghiên cứu, góp phần làm tăng độ chính xác trong phân tích
nhận dạng cá thể người và giám định huyết thống phù hợp với điều
kiện phịng thí nghiệm tại Việt Nam.
2. Bổ sung số liệu khảo sát tần suất alen 15 locut đa hình người Việt
(Kinh), trong đó đã khảo sát mới 07 alen của locut F13A01, 06 alen của
locut HPRTB, 06 alen cuả locut F13B, 08 alen của locut FES/FPS và
05 alen của locut LPL; phát hiện thêm được 02 alen mới ở quần thể
người Việt (Kinh) là alen số 8 của locut CSF1PO, alen số 13 của locut
vWA.
3. Xây dựng được 04 bộ thang alen chỉ thị cho các locut F13A01,
D8S1179, HPRTB và Amelogenin sử dụng trong phân tích kiểu gen cá
thể đảm bảo độ chính xác cao.
4. Đánh giá được khả năng ứng dụng của 15 locut STR đối với quần thể
người Việt (Kinh) trong nhận dạng cá thể và xác định huyết thống tại
Việt Nam.

* BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 134 trang (chưa gồm 41 trang phụ lục), được bố cục gồm
5 phần: mở đầu 5 trang; tổng quan 31 trang; vật liệu và phương pháp nghiên
cứu 14 trang; kết quả và thảo luận 58 trang; kết luận, kiến nghị 03 trang.
Ngồi ra có 01 trang liệt kê danh mục các cơng trình khoa học đã cơng bố.
* NƠI THỰC HIỆN LUẬN ÁN
Luận án được thực hiện tại Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài
liệu nghiệp vụ - Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật - Bộ Công an.

14

TIEU LUAN MOI download :


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI
Công tác nhận dạng diễn ra thường xuyên trong các ngành khoa học và
thực tiễn cuộc sống. Quá trình nhận dạng thực chất là cách sắp xếp thành hệ
thống hay cịn gọi là phân loại, trong đó các nhóm được phân chia theo các
đặc tính chung và các nhóm có những đặc tính chung này sẽ được gọi một tên
chung. Bằng cách phân loại các nhà thực vật học phân loại cây, nhà động vật
học phân loại động vật và giám định viên pháp y phân loại và nhận dạng cá
thể người. Thông qua các đặc điểm đặc trưng mang tính cá thể của con người
về hình thái khn mặt, về đặc điểm của răng, đặc điểm vân da, nhóm máu,
ADN,... của các cá thể khác nhau thì khác nhau để các giám định viên tiến
hành công tác nhận dạng người.
Có nhiều phương pháp để giám định nhận dạng cá thể người. Các
phương pháp nhận dạng thường mang tính bổ trợ cho nhau. Để đạt được mục
đích cuối cùng của công tác nhận dạng cần tiến hành qua các bước như: phân
loại, sàng lọc và cuối cùng là xác định cá thể thì cần phối hợp nhiều phương

pháp với nhau hoặc nhiều phần trong một phương pháp. Ví dụ, phương pháp
vân da cần phân tích nhiều đặc điểm đường vân, phương pháp ADN cần phân
tích nhiều locut.... Việc sử dụng các phương pháp trong nhận dạng cá thể tuỳ
thuộc vào:
- Loại mẫu, số lượng và chất lượng mẫu (bao gồm cả mẫu giám định
nhận dạng và mẫu so sánh).
- Số lượng cá thể cần nhận dạng.
- Trang thiết bị của cơ sở giám định.
- Trình độ chun mơn của giám định viên.
Về ngun lý, cơng tác nhận dạng chính là việc so sánh các thuộc tính,
các đặc điểm của mẫu sinh phẩm thu được với những tiêu chuẩn, những chỉ
tiêu đã biết để xác định cá thể. Ví dụ xác định độ tuổi, giới tính, chủng tộc

15

TIEU LUAN MOI download :


trên xương sọ, ...) hoặc so sánh giữa những thuộc tính, những đặc điểm của
mẫu nghi ngờ với mẫu đối chứng để xem mức độ phù hợp hay không phù hợp
hoặc chúng có cùng một nguồn gốc hay khơng. Nếu các đặc tính giữa mẫu
cần giám định và mẫu so sánh giống nhau thì điều đó có nghĩa là hai mẫu này
có chung một nguồn gốc. Nếu các đặc tính khác nhau thì có nghĩa là mẫu
giám định và mẫu so sánh khơng cùng một nguồn gốc, có nghĩa là có nguồn
gốc khác nhau. Thơng qua việc phân tích các đặc tính chúng ta sẽ phân nhóm
được các mẫu giám định hoặc loại trừ được mẫu nghi ngờ trong nhóm đối
tượng cần giám định đôi khi chỉ bằng các phương pháp đơn giản hoặc một vài
đặc điểm nhận dạng. Như vậy, chúng ta sẽ giới hạn và khu trú dần số mẫu
(đối tượng) cần giám định. Khi số mẫu được khu trú càng ít thì khả năng xác
định cá thể càng cao, rút ngắn được thời gian và tiết kiệm được kinh phí cho

cơng tác giám định.
Một số phương pháp sử dụng trong nhận dạng cá thể người:
1.1.1. Phương pháp hình thái học
Phương pháp này dựa trên các đặc điểm hình thái học mang tính đặc
trưng của cơ thể con người để nhận dạng. Các đặc điểm hình thái bao gồm các
đặc điểm mơ tả về loại hình khn mặt, loại hình mắt, mũi, miệng, tai..., các
kích thước cơ thể, các chỉ số trên xương (xương sọ, răng…) để xác định các
đặc tính nhận dạng hay đặc điểm về vân da, vây tay…
Đây là các phương pháp rất thông dụng, cho đến nay vẫn được ứng
dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế giới trong lĩnh vực pháp y hình sự
[21, 65, 78, 90]. Tuy nhiên độ chính xác của phương pháp này phụ thuộc
nhiều vào yếu tố mẫu thu được và yếu tố so sánh. Ví dụ khi nhận dạng bằng
phương pháp tái tạo khuôn mặt từ hộp sọ thì mẫu thu được phải là xương sọ
tương đối nguyên vẹn; nhận dạng dựa trên đặc điểm về răng thì mẫu thu được
phải là răng hài cốt và đồng thời phải có hồ sơ răng của đối tượng cần xác
định.

16

TIEU LUAN MOI download :


* Nhận dạng bằng phương pháp xác định vân da:
Từ cuối thế kỷ thứ 19, giá trị nhận dạng bằng vân da đã được khẳng
định qua những nghiên cứu của Galton trong hai cuốn sách “Về các dấu tay”,
“Cách sắp xếp và sử dụng dấu tay”. Từ đó đến nay phương pháp nhận dạng
bằng vân da đã không ngừng được hoàn thiện.
Ngày nay mọi người đã quen thuộc với khái niệm nhận dạng cá thể
bằng vân da và thừa nhận khả năng nhận dạng của chúng. Vân da được mô tả
một cách có hệ thống và được xem là một trong những đặc tính khơng biến

đổi của mỗi cá thể. Thông qua nghiên cứu và lập tàng thư các nhà khoa học
đã đi đến một kết luận rằng khơng có hai vân da giống nhau trong hàng triệu
cá thể [55, 80].
Các nhà khoa học xác định rằng vân da (như số lượng đường vân, dạng
đường vân) không phải do một mà do nhiều gen quy định. Nó là kết quả của
sự kết hợp các yếu tố di truyền và không di truyền trong quá trình phát triển
của bào thai. Vì vậy, ngay cả hai anh em sinh đôi cùng trứng cũng có thể khác
nhau [55].
Tuy nhiên, nhận dạng bằng dấu vân da còn gặp phải những trở ngại như
chỉ thu được một vài dấu vân da, dấu vân da bị mờ nhạt, bị tẩy xoá, bị che dấu
một phần hay tồn bộ do điều kiện khách quan, do mưu mơ của kẻ phạm tội
(đeo găng tay, bọc đầu ngón tay, làm mất vân da trên đầu ngón tay, phẫu thuật
thay vân ngón tay hoặc sử dụng vân tay giả) làm cho việc nhận dạng nhiều
khi không thực hiện được hoặc nếu có thực hiện được thì rất khó khăn, mất
rất nhiều thời gian và công sức.
1.1.2. Nhận dạng cá thể bằng các yếu tố có bản chất protein
1.1.2.1. Xác định nhóm máu
Khi phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO, các nhà khoa học thấy có
sự khác nhau về nhóm máu của những cá thể trong quần thể.
Kháng nguyên nhóm máu A, B hay H (kháng nguyên H là của những

17

TIEU LUAN MOI download :


người mang nhóm máu O) là những hợp chất glycoprotein đặc hiệu trên màng
hồng cầu. Gen quy định nhóm máu di truyền không bị ảnh hưởng bởi môi
trường và được truyền từ cha mẹ sang con ngay từ khi hình thành hợp tử. Yếu
tố nhóm máu bền vững trong suốt cả cuộc đời. Ngày nay người ta đã xác định

được trình tự gen mã hố những kháng ngun nhóm máu [80].
Hiện nay, phân tích kháng ngun nhóm máu hệ ABO trong nhận dạng
pháp y hình sự vẫn được các nước trên thế giới sử dụng với các tính ưu việt,
thứ nhất là q trình phân tích khơng địi hỏi tốn nhiều thời gian, công sức và
vật chất; thứ hai là kháng ngun nhóm máu khá bền vững với mơi trường và
thứ ba là kháng ngun nhóm máu cịn tồn tại ở một số sinh phẩm khác như
lơng, tóc, tinh dịch, nước bọt, mồ hơi…
Tiếp sau hệ nhóm máu ABO, các nhà khoa học cịn tìm được nhiều hệ
nhóm máu khác như Rh, MN, Lewis, P…. Các yếu tố nhóm này được sử
dụng trong nhận dạng cá thể và xác định quan hệ huyết thống nhằm làm tăng
thêm khả năng xác định chính xác cá thể và chẩn đốn loại trừ .
1.1.2.2. Xác định một số nhóm protein và nhóm enzym
Vào những năm 1970, các nhà khoa học đã tìm ra các yếu tố nhóm
protein trong huyết thanh người như hệ thống haptoglobin, hệ thống
transferin, hệ thống 2 globulin, hệ thống Group Specific (GS)... và các hệ
enzym như phosphatase acid, adenilatkinase, lactatdehydrogenase, 6phosphoglucomutase (PGM)... Các hệ thống nhóm này ở các cá thể khác nhau
thì khác nhau, do đó chúng cũng là một công cụ hữu hiệu để nhận dạng cá thể
người trong pháp y hình sự [80].
Tuy nhiên việc sử dụng các yếu tố di truyền có bản chất protein trong
nhận dạng cá thể gặp một số khó khăn như cần nhiều loại kháng huyết thanh
đặc hiệu. Mẫu xét nghiệm phải cịn tươi, mới do các yếu tố nhóm có bản chất
protein kém bền vững dưới tác động của các tác nhân như nhiệt độ, độ ẩm, độ
pH, ánh nắng, vi sinh vật... Với các mẫu đã cũ hoặc bị phân huỷ thường

18

TIEU LUAN MOI download :


khơng có kết quả hoặc độ chính xác khơng cao.

1.1.3. Nhận dạng cá thể người qua phân tích ADN nhân
Năm 1985 Alec Jeffreys và cộng sự [48] khi nghiên cứu gen mã hóa
protein đảm nhiệm chức năng liên kết với oxygen trong cơ đã phát hiện đoạn
gen này có một trình tự gồm 33 nucleotit được lặp lại một số lần. Jeffreys và
cộng sự đã tinh sạch đoạn ADN – “tiểu vệ tinh” này, đưa vào plasmid PUC và
giải trình tự một số đoạn của một số người. Họ đã chọn, so sánh trình tự của
nhiều người và phát hiện ra rằng chiều dài của đoạn ADN nhận được từ mỗi
cá thể khác nhau phụ thuộc vào số lượng của các đoạn lặp. Đây là đặc điểm
quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể. Các “tiểu vệ tinh” này
(minisatellite), do có số lượng nucleotit trong đoạn lặp tương đối lớn (từ 7 đến
hàng chục nucleotit) được gọi chung là các đoạn đa hình trình tự lặp lại liên
tiếp có số lượng thay đổi (Variable Number of Tandem Repeat).
Đó là thời điểm giám định gen chính thức ra đời, khi đó người ta gọi kết
quả phân tích ADN theo phương pháp này là ADN Fingerprint (dấu vân
ADN), sau này được đề nghị bằng tên khác là “hồ sơ ADN” (ADN profile).
“ADN profile ” hay “ADN fingerprint” là tổ hợp các kiểu gen của một cá thể
cần được phân tích trong giám định (hình sự, huyết thống…).
Sau nghiên cứu của Jeffreys, các nghiên cứu về hồ sơ ADN của mỗi
người dựa trên tính đa hình của các minisatellite khác nhau đã được thực hiện
ở nhiều phịng thí nghiệm khác nhau. Hàng ngàn minisatellite chứa các đoạn
lặp liên tiếp từ 2 đến 6 bp được gọi chung là các trình tự lặp lại ngắn liên tiếp
(Short Tandem Repeat – STR) nằm rải rác trong các vùng intron đã được công
bố. Chúng được sử dụng như những chỉ thị liên kết để tìm các gen gây bệnh.
Tuy nhiên, một locut STR chỉ có thể sử dụng được cho mục đích nhận dạng cá
thể khi thỏa mãn những điều kiện nhất định. Thứ nhất, STR phải có tính đa
hình và mức độ dị hợp tử cao. Điều này giúp các nhà phân tích chỉ cần sử
dụng ít nhất số lượng STR mà vẫn đáp ứng được yêu cầu và độ tin cậy. Thứ

19

TIEU LUAN MOI download :


hai, các locut STR phải ít bị biến đổi dưới tác động của môi trường xung
quanh như nhiệt độ, độ ẩm, vi sinh vật để đảm bảo sự nguyên vẹn của phân
đoạn ADN trong q trình phân tích. Thứ ba, các STR phải di truyền độc lập
do vậy chúng phải nằm trên các NST khác nhau để tránh hiện tượng hốn vị
gen trên một NST trong q trình phân chia tế bào [23].
Mặc dù về lý thuyết, các locut chứa các đoạn lặp 2 – 3 nucleotit ví dụ (CA)n- hoặc - (ATC)n- sẽ có tính đa hình cao hơn so với các locut chứa số
đoạn lặp từ 4 hay 5 nucleotit, ví dụ -(ATTA)n- hoặc -(ACTAG)n- nếu chúng
có cùng độ dài, song vì lý do kỹ thuật và thực tiễn, các locut có các trình tự 4
nucleotit lặp lại được sử dụng nhiều nhất [22, 23, 80]. Các bộ sinh phẩm phân
tích STR nhận dạng cá thể hiện nay phần lớn chứa các đoạn lặp 4 nucleotit.
Những nghiên cứu về VNTR và STR cho thấy, đây là những locut mang tính
bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể.
Giá trị nhận dạng của phương pháp phân tích ADN phụ thuộc vào số
lượng các locut ADN được sử dụng và tần suất phân bố alen của các locut
trong quần thể. Với một vài locut thì giá trị xác định cá thể ở mức thấp nhưng
chúng lại có giá trị loại trừ và sàng lọc. Đặc biệt trong nhận dạng với số lượng
mẫu xét nghiệm nhiều thì vai trị sàng lọc và loại trừ là rất quan trọng nhằm
làm giảm thiểu số mẫu cần xét nghiệm xuống con số nhỏ nhất trước khi đi
đến bước cuối cùng trong nhận dạng là xác định cá thể.
1.1.4. Phương pháp phân tích ADN ty thể
1.1.4.1. Tính đa hình trình tự ADN ty thể
ADN nằm trong ty thể của tế bào gọi là ADN ty thể. ADN ty thể có cấu
trúc mạch vịng. Sự khác nhau về trình tự hệ gen ty thể của hai cá thể người
khác nhau trung bình khoảng 9 đến 66 nucleotit. Tỷ lệ đột biến trên ADN ty
thể lớn hơn nhiều lần so với ADN nhân. Tỷ lệ đột biến cao là kết quả của sự
tích luỹ nhiều đột biến thay thế bazơ nitơ trung tính và đặc hiệu cho mỗi quần
thể trong ADN ty thể. Các đột biến này được tích luỹ liên tục theo thời gian,

20

TIEU LUAN MOI download :


truyền theo dòng mẹ và được chia nhánh xấp xỉ với khoảng thời gian các quần
thể định cư ở các vùng khác nhau trên thế giới. Sự khác nhau của ADN ty thể
liên quan tới chủng tộc, dân tộc và nguồn gốc địa lý của các cá thể thể hiện rõ
nét hơn rất nhiều so với ADN nhân [22].
1.1.4.2. Phân tích ADN ty thể trong nhận dạng cá thể
Nhận dạng cá thể thơng qua phân tích ADN ty thể thường dựa trên sự
khác nhau về trình tự vùng D-loop (Displacement loop) hay còn gọi là vùng
HV (Hypervariable). Vùng D - loop có kích thước khoảng 1121 bp, chiếm
khoảng 7% hệ gen ty thể, nằm hai bên vị trí "O". Vùng HV gồm 2 vùng HV1
và HV2. Vùng HV1 và HV2 đều có kích thước trên dưới 400bp. Nhóm
nghiên cứu ADN thuộc các phịng thí nghiệm khoa học hình sự ở Mỹ
(TWGDAM) đưa ra tiêu chuẩn phân tích ADN ty thể là trình tự tối thiểu được
thừa nhận đối với vùng HV1 từ vị trí nucleotit 16024 đến vị trí 16365 và đối
với HV2 từ vị trí 00073 đến 000340 (theo trình tự Anderson và cs đã cơng bố
năm 1981). Gần đây đã có nhiều phịng thí nghiệm phân tích mở rộng tới
vùng HV3 hoặc giải trình tự tồn bộ genom ty thể [34, 40, 56]
Tế bào động vật có vú thường chứa từ vài trăm đến 10.000 bản sao của
ADN ty thể. Vì vậy, mặc dù ADN ty thể chỉ chiếm dưới 1% ADN tổng số của
tế bào nhưng chúng lại có số lượng bản sao lớn.
Cùng với số lượng bản sao lớn, một đặc tính khác rất hữu ích để ứng
dụng ADN ty thể trong nhận dạng pháp y đó là đặc tính di truyền theo dịng
mẹ. Trong q trình thụ tinh, gần 99,9% ty thể của hợp tử nhận được từ tế bào
trứng. Vì vậy, những cá thể cùng mẹ và tất cả cá thể liên quan theo dòng mẹ
chứa các bản sao ADN ty thể giống nhau. Đặc tính đặc biệt nữa của ADN ty

thể là tốc độ tiến hoá cao thể hiện ở đột biến nucleotit. Mức độ đột biến của
nó cao gấp 5 - 10 lần so với ADN hệ gen nhân [25].
Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp phân tích ADN ty thể trong nhận
dạng cá thể người chỉ tiến hành khi không thể thực hiện được phương pháp

21

TIEU LUAN MOI download :