BÁO CÁO KHOA HỌC: "SƠ BỘ NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MỘT SỐ MỒI ĐỂ XÁC ĐỊNH HUYẾT THỐNG Ở NGƯỜI" ppsx

SƠ BỘ NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MỘT SỐ MỒI ĐỂ
XÁC ĐỊNH HUYẾT THỐNG Ở NGƯỜI

Phạm Hải Sáng, Nguyễn Văn Mùi
Trường Đại học khoa học tự nhiên

I. Đặt vấn đề

Công nghệ gen đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác
nhau, song trong khoa học hình sự trên thế giới được biết
đến lần đầu tiên vào năm 1985 nhờ công trình nghiên cứu
của Alec Jeffreys và các cộng sự. Đây là một công nghệ có
tính đột phá trong khoa học hình sự, giúp giải quyết một số
vụ án tưởng chừng như bế tắc [7]. Hiện nay, các phòng thí
nghiệm tiên tiến trên thế giới đã xác định huyết thống
người bằng phức hợp 10, 14, thậm chí 16 mồi. Ở nước ta,
việc giám định gen trong xác định huyết thống mới đã được
thực hiện ở một số nơi. Trung tâm Công nghệ sinh học -
Đại học Quốc gia Hà Nội nghiên cứu xác định huyết thống,
xác lập cây phả hệ người [4]. Viện Khoa học hình sự - Bộ
công an đã sử dụng phức hợp 10 mồi [2,3] và đang tiến
hành giám định gen sử dụng hệ (9 gen) nineplex xác định
tội phạm. Ngoài ra còn có một số cơ sở khoa học đặt vấn đề
nghiên cứu, có tính chất điều tra thăm dò mà chưa có tính
phổ cập và ứng dụng rộng rãi. Tuy nhiên, sự phân tích
nhiều mồi khá tốn kém vì đòi hỏi phải có máy móc hiện
đại. Vì vậy, chúng tôi thử nghiên cứu sử dụng một số cặp
mồi để giám định huyết thống nguời Việt Nam.

Như chúng ta đã biết, ở người qua qúa trình thụ tinh,
người con bao giờ cũng nhận 23 NST từ bố thông qua tinh

trùng và 23 NST từ mẹ thông qua trứng. Như vậy hệ gen
của người con bao giờ cũng có một nửa có nguồn gốc từ bố
và một nửa có nguồn gốc từ mẹ[1,5]. Các locut dùng để xác
định huyết thống là các đoạn lặp lại ngắn ( STR – Short
Tandem Repeats ) [9,10]. Các đoạn lặp lại ngắn này có
chiều dài từ 2 đến 6 nucleotit[13] và ở mỗi cá thể có số lần
lặp lại khác nhau, do vậy các locut này có tính đa hình cao
nên rất có giá trị để phân biệt cá thể.

Để xác định huyết thống bằng phương pháp nhân cặp
mồi đơn ở đây chúng tôi sử dụng 4 cặp mồi TH01, F13A,
vWA, FES để nhân bản 4 đoạn gen tương ứng.

II. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

1. Nguyên liệu và hoá chất

Mẫu máu, tóc của bố, mẹ, con của 3 gia đình

Các cặp mồi:

+ TH01:



• Nằm ở intron 1 của gen tyrozin hydroxylaza người định vị
trên nhánh ngắn NST 11, có 20 alen. Số các đoạn STR
trong locus TH01 dao động từ 3 – 14.

• Trình tự lặp lại:AATG

• Kích thước alen: 152 – 196[11]



+ FES:


• Nằm ở intron thứ 5 của gen tiền ung thư, định vị trên
nhánh dài của NST 15, có 9 alen.

• Trình tự lặp lại: ATT

• Kích thước alen: 206 – 238[11]



+ F13A:



• Nằm trên nhánh ngắn của NST số 6, có 16 alen.

• Trình tự lặp lại: AAAG

• Kích thước alen: 179 – 235[11]



+ vWA:

• Nằm trên nhánh ngắn NST số 12, có 20 alen.

• Trình tự lặp lại: TCTA

• Kích thước alen: 179 – 235 bp[11]



Cùng các hoá chất và thiết bị của các hãng Sigma,
Pharmacia đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu sinh học phân tử.

2. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết ADN sử dụng Chelex[11]

- Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế[1]

- Phản ứng PCR [6]

- Kỹ thuật điện di gel polyacrylamit [12]

- Kỹ thuật nhuộm bạc [12]

III. Kết quả và thảo luận

1. Định lượng ADN

Sau khi tách chiết ADN bằng phương pháp sử dụng chelex.

ADN được định lượng bằng máy đo quang phổ. Kết qủa
OD thu được, tính theo công thức:
CADN(g/ml) = OD
260
x độ pha loãng x 50g.

Các mẵu ADN tách chiết có độ sạch (OD
260nm
/OD
280nm
)
từ 1,52 – 1,75, đủ để làm phản ứng PCR.

2. Phản ứng PCR.

Mẫu ADN đã đủ độ sạch đem thực hiện phản ứng PCR với
nồng độ các chất và điều kiện phản ứng thích hợp.

Mồi TH01, FES, vWA: 95
0
C – 5 phút, (60
0
C – 1 phút,
72
0
C – 1 phút 30 giây, 94
0
C – 1 phút) x 30 chu kỳ, 60
0
C –

30 phút.
Mồi F13A: 95
0
C – 5 phút, (57
0
C – 1 phút, 72
0
C – 1 phút 30
giây, 94
0
C – 1 phút) x 30 chu kỳ, 57
0
C – 30 phút.

Sản phẩm PCR thu được đem điện di trên gel polyacrylamit
8%, sau đó nhuộm bạc, kết qủa thể hiện ở các hình 1,2,3.

Hình 1 : các locus TH01, vWA, FES, F13A

L: thang ADN chuẩn 100 bp, B: bố, M: mẹ, C: con, ĐC:
đối chứng

Qua hình 1a dựa vào ADN thang chuẩn 100 bp, ta thấy sản
phẩm PCR nhân lên nằm trong khoảng từ 100 – 200 bp,
đúng với kích thước alen của locus TH01. Ta thấy ở locus
TH01 của gia đình 1 người bố và người mẹ đều có 2 băng
(dị hợp tử). Người con có một băng trùng với băng của bố
và một băng trùng với băng của mẹ, điều đó chứng tỏ rằng
người con nhận một alen của bố và một alen của mẹ. Hai
alen này có kích thước khác nhau nên người con mang

locus TH01 ở trạng thái dị hợp tử.

Qua hình 1b cho thấy, ở locus vWA của gia đình 1 người
bố và người mẹ đều có một băng với kích thước bằng nhau
(đồng hợp tử). Người con có hai băng trong đó một băng
dưới trùng với băng của bố còn một băng trên trùng với
băng của mẹ, điều đó chứng tỏ người con nhận một alen
của bố và một alen của mẹ, hai alen này có kích thước khác
nhau nên người con mang locus vWA ở trạng thái dị hợp
tử.

Qua hình 1c cho thấy, ở locus FES của gia đình 1 người bố
và người mẹ đều có một băng với kích thước bằng nhau
(đồng hợp tử). Người con cũng chỉ có một băng và trùng
với băng của cả bố và mẹ, điều đó chứng tỏ rằng người con
nhận một alen của bố và một alen của mẹ, nhưng vì hai
alen này có kích thước bằng nhau nên người con chỉ có một
băng tức là mang locus FES ở trạng thái đồng hợp tử.

Qua hình 1d cho thấy, ở locus F13A của gia đình 1 người
bố và người mẹ đều có 2 băng (dị hợp tử). Người con có
một băng dưới trùng với 1 băng của bố và một băng trên
trùng với một băng của mẹ, điều đó chứng tỏ rằng người
con nhận một alen của bố và một alen của mẹ. Hai alen này
có kích thước khác nhau nên người con mang locus F13A ở
trạng thái dị hợp tử.

Như vậy, Qua hình 1 cho thấy ở cả 4 locus TH01, vWA,
FES, F13A người con đều nhận một alen từ bố và một alen
từ mẹ. Điều này cho phép kết luận rằng 3 người này có

quan hệ huyết thống với nhau.

Hình 2: Các locus TH01, vWA, F13A, FES của gia đình 2

L: thang ADN chuẩn 100 bp, B: bố, M: mẹ, C: con, ĐC:
đối chứng

Qua hình 2a cho thấy người bố xuất hiện 2 băng, người mẹ
chỉ xuất hiện một băng trùng với băng dưới của bố, điều đó
thể hiện người bố mang locus TH01 ở trạng thái dị hợp tử
còn người mẹ ở trạng thái đồng hợp tử. Người con xuất
hiện một băng duy nhất trùng với băng dưới của bố và của
mẹ. Điều này chứng tỏ người con đã nhận một alen từ bố
và một alen từ mẹ. Người đàn ông đối chứng (ĐC) có một
băng duy nhất (đồng hợp tử) không trùng với băng của
người con chứng tỏ người đàn ông đối chứng và người con
không có quan hệ huyết thống với nhau.

Qua hình 2b cho thấy cả bố và mẹ đều xuất hiện 2 băng
nghĩa là đều dị hợp tử, người đang ông đối chứng (ĐC) có
một băng duy nhất chứng tỏ đồng hợp tử. Người con có 2
băng (dị hợp tử) do nhận một băng trên của bố và có băng
dưới là do nhận từ mẹ, không có băng nào trùng với băng
của người đàn ông đối chứng, chứng tỏ đối chứng và người
con không có quan hệ huyết thống với nhau.

Qua hình 2c cho thấy bố có 2 băng và mẹ 2 có 1 băng ,
người con 2 nhận 1 alen từ bố và 1 alen từ mẹ 2 . Do 2 alen
này có kích thước bằng nhau nên người người con 2 có 1
băng (đồng hợp tử).

Ở gia đình số 3 người cả bố và mẹ đều có một băng
(đồng hợp tử). Người con có 2 băng, băng trên trùng với
băng của người bố còn băng dưới trùng với băng của người
mẹ, hai băng này có kích thước khác nhau nên người con
mang locus FES ở trạng thái dị hợp tử. Người đàn ông đối
chứng có một băng trùng với băng dưới của người con
nhưng do người con đã nhận băng này từ người mẹ nên có
thể kết luận người đàn ông đối chứng và người con không
có quan hệ huyết thống với nhau.

Qua hình 2d cho thấy người bố xuất hiện 2 băng (dị hợp
tử), người mẹ chỉ xuất hiện một băng (đồng hợp tử). Người
con xuất hiện 2 băng, băng trên trùng với băng trên của bố
và băng dưới trùng với một băng của mẹ. Điều này chứng
tỏ người con nhận một alen từ bố và một alen từ mẹ. Người
đàn ông đối chứng có 2 băng (dị hợp tử) nhưng không có
băng nào trùng với người con chứng tỏ người đàn ông đối
chứng và người con không có quan hệ huyết thống với
nhau.

Như vậy, qua hình 2 ở cả 4 locus TH01, vWA, FES, F13A
người con đều nhận một alen từ bố và một alen từ mẹ. Điều
này cho phép kết luận rằng 3 người này có quan hệ huyết
thống với nhau.

Hình 3: Các locus FES, TH01, vWA, F13A của gia đình 3

L: thang ADN chuẩn 100 bp, B: bố, M: mẹ, C: con, ĐC:
đối chứng

Hình 3a cho thấy ở gia đình số 3 người cả bố và mẹ đều có
một băng (đồng hợp tử). Người con có 2 băng, băng trên
trùng với băng của người bố còn băng dưới trùng với băng
của người mẹ, hai băng này có kích thước khác nhau nên
người con mang locus FES ở trạng thái dị hợp tử. Người bố
đối chứng có một băng trùng với băng dưới của người con
nhưng do người con đã nhận băng này từ người mẹ nên có
thể kết luận người đàn ông đối chứng và người con không
có quan hệ huyết thống với nhau.

Qua hình 3b cho thấy ở người bố xuất hiện 2 băng, người
mẹ chỉ xuất hiện một băng thể hiện người bố mang locus
TH01 ở trạng thái dị hợp tử còn người mẹ ở trạng thái đồng
hợp tử. Người con xuất hiện một băng duy nhất trùng với
băng trên của bố và băng của mẹ. Điều này chứng tỏ người
con đã nhận một alen từ bố và một alen từ mẹ.

Qua hình 3c cho thấy cả bố và mẹ đều xuất hiện 2 băng
nghĩa là đều dị hợp tử. Người con có một băng trên trùng
với băng dưới của bố, một băng dưới trùng với băng trên
của mẹ, 2 băng này kích thước khác nhau nên người con ở
trạng thái dị hợp tử. Vậy người con nhận một alen từ bố và
một alen từ mẹ.

Qua hình 3d cho thấy, ở locus F13A của gia đình 3 người
bố và người mẹ đều dị hợp tử (có 2 băng). Người con có
một băng trùng với bố và một băng trùng với mẹ, điều đó
chứng tỏ người con nhận một alen của bố và một alen của
mẹ. Hai alen này có kích thước khác nhau nên người con ở

trạng thái dị hợp tử.

Như vậy, qua hình 3 cho thấy ở cả 4 locus TH01, vWA,
F13A, FES người con đều nhận một alen từ bố và một alen
từ mẹ. Điều này cho phép kết luận rằng 3 người này có
quan hệ huyết thống với nhau.

IV. Kết luận

1- ADN tách từ máu và tóc có đủ độ tinh khiết để nhân các
cặp mồi TH01, vWA, FES, F13A

2- Đã hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân 4 cặp mồi TH01,
vWA, FES, F13A đối với ADN tóc và máu của người Việt
Nam.

3- Trong mỗi gia đình phân tích bằng 4 cặp mồi TH01,
vWA, F13A, FES thì đều thấy có liên quan về huyết thống.

4- Một trường hợp lấy người đàn ông khác làm đối chứng
(hình 2a, 2b, 2d, 3a) thì không thấy có quan hệ huyết thống.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1998), Sinh học phân tử, Nhà
xuất bản giáo dục, Hà Nội, tr. 7 - 11.
2- Trần Văn Đôn (1999), "Góp phần nghiên cứu một số dấu
di truyền người phục vụ công tác xác định huyết thống” ,
Tạp chí thông tin bộ nội vụ, số12, tr. 4 - 8.

3- Hà Quốc Khanh (1999), Nghiên cứu và ứng dụng quy
trình kỹ thuật giám định gen từ dấu vết máu người trong
điều kiện Việt Nam, Hà Nội.
4- Lê Đình Lương, Lưu Xuân Hoà, Nguyễn Xuân Hùng,
Trịnh Đức Anh (2003), Nghiên cứu xác định dấu AND ở
người Việt bằng các locut trên nhiẽm sắc thể giới tính,
Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống.
Hội nghị toàn quốc lần thứ hai nghiên cứu cơ bản trong
sinh học, nông nghiệp, y học. Huế.
5- Budowle B., Giusti AM., Wage JS., Baechtel FS.,
Fourney RM., Adams DE., Fresley LA. et al (1991), Am J
Hum Genet, (48), 841-855.
6- Henry A.erlich (1989), "PCR Technology: principles and
application for DNA amplification” , Am J. Hum. Genet ,
(55), 175.
7- Jobertson J., Ross A. M., Burgoyne A. L. (1990), DNA
in Forensic Science, Ellis Horwood Limited, 119 - 120.
(1960), oxyribonucleic acid”, Sience, tr. 129 - 131.8-
Kornberg A. Biologycal synthesis of de
9- Promega Corp (1996), GenePrintTMSTR Systems
Technical Manual, USA, tr.12 - 13.
10- Promega (1999), Technical manual - Geneprint
fluorescent STR system, USA.
11- GenBank http ://
www2.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/genbank.
STRase http :// ibm4.carb.nist.gov:8800/dna/home.htm.
12- Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989),
Molecular cloning , Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Vol (1), 6.3 - 6.17.
13- D.,Urquhart A. J., Oldrod N. J., Downes T., Baber M.

Selection of STR Alliston -Greiner R., Kimton C. P., Gill
P. D. (1996), loci for forensic identification system”,
Advances in forensic Haemogenetics, Volume6, 115 - 117.

SUMMARY

Applified single pairs of primer to human descent
determination

Pham Hai Sang, Nguyen Van Mui
Faculty of Biology, Hanoi University of science

Researching some encoded DNA products is to have only
eliminated effect on descent determination, not to exactly
determine actual parent. It’s necessary to use PCR and gene
technology techniques to resolve this problem.

Human total genomic DNA is extracted from blood and
hairs by chelex. DNA is quantified by spectrometric
method. Extracted DNA is pure enough to run PCR
reactions. PCR products are analysed by polyacrylamide
gel electrophoresis and detected by silver stain.
In this experiment, TH01, FES, F13A, vWA loci are used.
These loci are valuable to discriminate individual,
especially to determine descent relationship since they have
length polymorphism characteristics.

When analysis blood DNA of another man, he used for
control with four primers TH01, vWA, FES and F13A by
PCR, show that he have not been bloodline relations with

three study families. Because, we can applied four primers
before for Vietnamise study bloodline.

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS. Trịnh Đình Đạt.