Phát triển phương pháp phân tích 1 naphthylacetic acid và 1 naphthylacetamid trong trái táo đỏ bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.72 MB, 134 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
---------------------------
PHẠM MINH TIẾN
PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1-NAPHTHYLACETIC ACID VÀ
1-NAPHTHYLACETAMID TRONG TRÁI TÁO
ĐỎ BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ DAD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Cơng Nghệ Thực Phẩm
Mã số ngành: 8540101
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 09 năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
---------------------------
PHẠM MINH TIẾN
PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1-NAPHTHYLACETIC ACID VÀ
1-NAPHTHYLACETAMID TRONG TRÁI TÁO
ĐỎ BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ DAD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
Mã số ngành: 8540101
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÂM VĂN MÂN
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 09 năm 2021
CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. LÂM VĂN MÂN
Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM ngày 12
tháng 09 năm 2021
Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)
TT
Họ và tên
Chức danh Hội đồng
1
TS. Nguyễn Lệ Hà
Chủ tịch
2
TS. Ngô Đức Vượng
Phản biện 1
3
GS.TS. Đống Thị Anh Đào
Phản biện 2
4
TS. Nguyễn Thị Ái Vân
Ủy viên
5
TS. Nguyễn Minh Xuân Hồng
Ủy viên, Thư ký
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được
sửa chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV
TS. Nguyễn Lệ Hà
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM
VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
TP. HCM, ngày 15 tháng 09 năm 2021
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: PHẠM MINH TIẾN
Giới tính: Nam
Ngày, tháng, năm sinh: 02/02/1992
Nơi sinh: Đồng Nai
Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
MSHV: 1841910012
I- Tên đề tài: Phát triển phương pháp phân tích 1-naphthylacetic acid và 1-naphthylacetamid
trong trái táo đỏ bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD
II- Nhiệm vụ và nội dung:
Nhiệm vụ: Xây dựng phương pháp phân tích NAA và NAAm trong quả táo đỏ bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD
Nội dung: cần thực hiện 3 mục tiêu cụ thể sau:
Xây dựng quy trình phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD.
Xây dựng quy trình xử lý mẫu táo đỏ dùng phân tích NAA và NAAm trên thiết bị sắc
ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dị DAD.
Phân tích NAA và NAAm trong quả táo đỏ được thu mua từ chợ địa phương và siêu
thị.
III- Ngày giao nhiệm vụ: 30-01-2021 theo quyết định số 1773/QĐ-ĐKC
IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 15-09-2021
V- Cán bộ hướng dẫn: Tiến sĩ Lâm Văn Mân
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)
(Họ tên và chữ ký)
TS. Lâm Văn Mân
i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào
khác.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện Luận văn
Phạm Minh Tiến
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
ii
LỜI CÁM ƠN
Để hồn thành khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Viện Khoa Học
Ứng Dụng nói chung và thầy cơ bộ mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm nói riêng đã truyền đạt
cho em kiến thức trong chuyên môn cũng như trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn thầy TS. Lâm Văn Mân – người đã trực tiếp hướng dẫn em
thực hiện đề tài này. Thầy đã luôn giúp đỡ em trong việc hiểu thêm kiến thức chun mơn,
cách nhìn nhận vấn đề khoa học và cách suy luận logic, Thầy cũng luôn quan tâm, động
viên mỗi khi em gặp khó khăn trong cuộc sống.
Cuối cùng tơi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động
viên và giúp đỡ để tơi hồn thành đề tài này.
Phạm Minh Tiến
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
iii
TÓM TẮT
Ngày nay, việc sử dụng các loại thuốc tăng trưởng để tăng năng suất ra quả cho các loại
cây được sử dụng nhiều, các loại thuốc tăng trưởng này ngồi khả năng kích thích cây
ra quả cịn làm ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Vì vậy cần có các quy định về
giới hạn tối đa cho phép cũng như phương pháp phân tích các chất tăng trưởng này.
Hai chất tăng trưởng 1-naphthylacetic acid và 1-naphthylacetamid được EU giới hạn ở
mức tối đa cho phép trong táo đỏ là 0,15mg/kg. Trong đề tài này đã xây dựng được quy
trình phân tích riêng biệt hai chất này ở mức giới hạn định lượng cho mỗi chất
0,06mg/kg, phù hợp cho phân tích mẫu thực tế. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép
đầu dò DAD là một thiết bị rẻ tiền và vận hành đơn giản được sử dụng để phân tích
mẫu NAA và NAAm trong quả táo đỏ.
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
iv
ABSTRACT
Today, plant growth regulators have been used for increase productivity in tree fruits.
However, it affect human health. Therefore, it is necessary to have the regulations on
the maximum allowable limit as well as the method of analyzing these plant growth
regulators. The plant growth regulators 1-naphthylacetic acid and 1-naphthylacetamide
are limited by the EU to the maximum allowed in red apples of 0.15mg/kg. In this
thesis, Simultaneous Analysis procedure for these two substances has been established
at quantitative limits for each substance 0.06mg/kg, suitable for real sample analysis.
The High Performance Liquid Chromatograph – Diode Array Detector is a cheap and
simple-to-operate device used to analyze NAA and NAAm samples in red apples.
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
v
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN ....................................................................................................................... ii
TÓM TẮT ............................................................................................................................ iii
ABSTRACT..........................................................................................................................iv
MỤC LỤC .............................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................. viii
DANH MỤC CÁC HÌNH .....................................................................................................ix
MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Cấu tạo, danh pháp, tính chất và độc tính của 1-napthylacetic acid (NAA) và
1-naphthylacetamid (NAAm) ................................................................................. 3
1.1.1. Cấu tạo, danh pháp và tính chất của NAA và NAAm.................................... 3
1.1.2. Nghiên cứu độc tính của NAA và NAAm ...................................................... 4
1.2. Các phương pháp phân tích NAA và NAAm .................................................. 4
1.2.1. Các phương pháp phân tích NAA và NAAm ................................................. 4
1.2.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò quang phổ mảng diod (DAD).... 4
1.2.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ ................................... 8
1.2.1.3. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò huỳnh quang ........................... 13
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký lỏng
ghép đầu dị DAD .................................................................................................. 14
1.3.1. Dung mơi hịa tan ...................................................................................... 14
1.3.2. Cột sắc ký lỏng .......................................................................................... 14
1.3.3. Pha động sắc ký lỏng ................................................................................ 15
1.3.4. Bộ phận tiêm mẫu ..................................................................................... 15
1.3.5. Nhiệt độ buồng cột .................................................................................... 15
1.4. Các thông số phê duyệt phương pháp ........................................................... 16
1.4.1. Độ đặc hiệu/ độ chọn lọc ........................................................................... 16
1.4.2. Xây dựng đường chuẩn.............................................................................. 16
1.4.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ...................................... 16
1.4.4. Độ đúng của phương pháp ........................................................................ 17
1.4.5. Độ chụm của phương pháp........................................................................ 17
1.4.6. Khoảng xác định ....................................................................................... 17
1.5. Nghiên cứu trong nước................................................................................... 18
1.6. Nghiên cứu quốc tế ......................................................................................... 19
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 23
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 23
2.1.1. Hóa chất, chất chuẩn và dụng cụ............................................................... 23
2.1.1.1. Hóa chất, chất chuẩn .......................................................................... 23
2.1.1.2. Dụng cụ ............................................................................................. 23
2.1.2. Thiết bị ...................................................................................................... 24
2.1.3. Nguyên liệu ............................................................................................... 26
2.2. Quy trình nghiên cứu dự kiến........................................................................ 26
2.2.1. Xây dựng quy trình phân tích NAA và NAAm trong quả táo đỏ bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD.............................................. 26
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
vi
2.2.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu táo đỏ dùng phân tích NAA và NAAm bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD ................................. 27
2.2.3. Phân tích NAA và NAAm trong quả táo đỏ được thu mua từ chợ Phạm Văn
Bạch, siêu thị coop-mart Quang Trung và siêu thị BigC Gò Vấp. ........................ 27
2.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 27
2.3.1. Xây dựng quy trình phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD ...................................................... 28
2.3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu táo đỏ dùng phân tích NAA và NAAm bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD ................................. 34
2.3.3. Phân tích NAA và NAAm trong quả táo đỏ được thu mua từ chợ và siêu thị
địa phương ......................................................................................................... 38
2.4. Phương pháp phân tích số liệu....................................................................... 40
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 42
3.1. Xây dựng phương pháp phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm trên thiết bị
HPLC-DAD ........................................................................................................... 42
3.1.1. Khảo sát bước sóng cực đại ...................................................................... 42
3.1.2. Khảo sát thành phần pha động .................................................................. 43
3.1.3. Khảo sát tỷ lệ pha động ............................................................................. 44
3.1.4. Khảo sát nhiệt độ cột phân tích ................................................................. 47
3.1.5. Khảo sát thể tích tiêm mẫu. ....................................................................... 49
3.1.6. Xây dựng đường chuẩn NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD ............... 50
3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu táo đỏ dùng phân tích NAA và NAAm bằng
thiết bị HPLC-DAD .............................................................................................. 54
3.2.1. Khảo sát hàm lượng NAA và NAAm trong quả táo đỏ bằng phương pháp
HPLC-DAD ........................................................................................................ 54
3.2.2. Khảo sát thành phần dung môi chiết mẫu đến độ thu hồi NAA và NAAm ... 56
3.2.3. Khảo sát kỹ thuật chiết .............................................................................. 57
3.2.4. Khảo sát thời gian chiết............................................................................. 59
3.2.5. Kỹ thuật làm giàu mẫu .............................................................................. 60
3.2.6. Xác định hàm lượng NAA và NAAm trên mẫu táo đỏ theo quy trình xử lý
mẫu đã tối ưu. ..................................................................................................... 65
3.2.7. Xác định hiệu suất thu hồi NAA và NAAm trên mẫu táo đỏ thêm chuẩn ..... 65
3.3. Phân tích hàm lượng NAA và NAAm thu được từ chợ và siêu thị địa
phương................................................................................................................... 67
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................ 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 71
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 74
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ACN: Acetonitril
DAD: Diode array detector – Đầu dò quang phổ mảng diod
EU Pesticides database: European Union pesticides database – Cơ sở dữ liệu về tồn dư
thuốc bảo vệ thực vật của Liên minh Châu Âu
FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations – Tổ chức lương thực
và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc.
HCOOH: Acid formic
HPLC: High perfomance liquid chromatography – Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC-DAD: High perfomance liquid chromatography - Diode array detector – Sắc ký
lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò quang phổ mảng diod
LOD: Limit of detection – Giới hạn phát hiện
LOQ: Limit of quantitation – Giới hạn định lượng
RSD: Relative standard deviation – Độ lệch chuẩn tương đối
UPLC-MS/MS: Ultra perfomance liquid chromatography- Mass spectrometry/ Mass
spectrometry – Thiết bị sắc ký siêu hiệu năng ghép đầu dò khối phổ hai lần
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Cấu tạo, danh pháp và tính chất của NAA và NAAm ............................................. 3
Bảng 1.2: Thơng số khối phổ cho chất NAA và NAAm (Lozano et al., 2012) ...................... 21
Bảng 2.1: Số lượng mẫu cần thực hiện ................................................................................. 39
Bảng 3.1: Bảng kết quả độ phân giải và hệ số kéo đuôi giữa các thành phần pha động ......... 43
Bảng 3.2: Bảng kết quả độ phân giải và hệ số kéo đuôi giữa các tỷ lệ pha động ................... 46
Bảng 3.3: Bảng kết quả độ phân giải và hệ số kéo đuôi khi thay đổi nhiệt độ buồng cột ....... 48
Bảng 3.4: Độ ổn định khi phân tích NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD qua 2 ngày
khác nhau............................................................................................................................. 50
Bảng 3.5: Kết quả phân tích hàm lượng NAA và NAAm trong mẫu táo NZ Queen .............. 65
Bảng 3.6: Kết quả tổng hợp độ tái lặp, độ thu hồi và độ không đảm bảo đo của NAA với nồng
độ chuẩn thêm là 0,06mg/kg ................................................................................................ 66
Bảng 3.7: Kết quả tổng hợp độ tái lặp, độ thu hồi và độ không đảm bảo đo của NAAm với
nồng độ chuẩn thêm là 0,06mg/kg ........................................................................................ 66
Bảng 3.8: Kết quả xác định chất tăng trưởng trong quả táo thu được từ chợ Phạm Văn Bạch 67
Bảng 3.9: Kết quả xác định chất tăng trưởng trong quả táo hiệu Kanzi ................................. 68
Bảng 3.10: Kết quả xác định chất tăng trưởng trong quả táo hiệu Red .................................. 68
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Tách hai chất hóa học bằng cách sử dụng côt sắc ký (Hage, 2018) .......................... 5
Hình 1.2: Hệ thống sắc ký lỏng điển hình (Hage, 2018) ......................................................... 6
Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo đầu dị UV-Vis (Jones, 1985)............................................................ 7
Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo chất nền cột Chiralpak IG .......................................................... 8
Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo pha tĩnh cột Chiralpak IG .......................................................... 8
Hình 1.6: Cấu trúc của máy khối phổ MS............................................................................... 9
Hình 1.7: Mơ hình bộ phân tích tứ cực chặp ba .................................................................... 12
Hình 1.8: Quy trình làm sạch mẫu (Lu et al., 2014) .............................................................. 22
Hình 2.1: Hình ảnh thực tế cột Chiralpak IG ........................................................................ 23
Hình 2.2: Hình ảnh máy HPLC-DAD được dùng trong đề tài ............................................... 24
Hình 2.3: Hình ảnh giao diện phần mềm điều khiển thiết bị HPLC-DAD ............................. 25
Hình 2.4: Hình ảnh máy cơ quay chân khơng ....................................................................... 25
Hình 2.5: Hình ảnh máy ly tâm ............................................................................................ 25
Hình 2.6: Hình ảnh máy siêu âm .......................................................................................... 25
Hình 2.7: Hình ảnh máy đo pH............................................................................................. 25
Hình 2.8: Quy trình phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD ............ 28
Hình 2.9: Khảo sát thành phần pha động tối ưu .................................................................... 29
Hình 2.10: Khảo sát tỷ lệ pha động tối ưu ............................................................................ 30
Hình 2.11: Khảo sát nhiệt cột sắc ký lỏng ............................................................................ 31
Hình 2.12: Khảo sát thể tích tiêm mẫu.................................................................................. 32
Hình 2.13: Quy trình khảo sát các ........................................................................................ 34
Hình 2.14: Quy trình xác định hiệu xuất thu hồi NAA và NAAm trên mẫu táo..................... 38
Hình 2.15: Quy trình xử lý mẫu táo để phân tích NAA và NAAm ........................................ 39
Hình 3.1: Sắc ký đồ bước sóng cực đại của NAA và NAAm ................................................ 42
Hình 3.2: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn ở điều kiện thành phần pha động tối ưu ...................... 44
Hình 3.3: Sắc ký đồ khảo sát NAA và NAAm với tỷ lệ dung mơi 1:9................................... 45
Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn ở điều kiện tỷ lệ pha động tối ưu ................................ 47
Hình 3.5: Khảo sát tại nhiệt độ cột 35oC............................................................................... 48
Hình 3.6: Khảo sát tại nhiệt độ cột 40oC............................................................................... 48
Hình 3.7: Khảo sát tại nhiệt độ cột 45oC............................................................................... 48
Hình 3.8: Khảo sát tại nhiệt độ cột 50oC............................................................................... 48
Hình 3.9: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn ở nhiệt độ tối ưu ......................................................... 49
Hình 3.10: Độ phân giải của NAA và NAAm theo thể tích tiêm ........................................... 50
Hình 3.11: Đồ thị đường chuẩn NAA ngày 17-04-2020 ....................................................... 52
Hình 3.12: Đồ thị đường chuẩn NAAm ngày 17-04-2020 .................................................... 52
Hình 3.13: Đồ thị đường chuẩn NAA ngày 20-04-2020 ....................................................... 53
Hình 3.14: Đồ thị đường chuẩn NAAm ngày 20-04-2020 .................................................... 54
Hình 3.15: Hàm lượng NAA và NAAm trong mẫu táo đỏ NZ QUEEN ................................ 55
Hình 3.16: Độ thu hồi NAA khi thêm chuẩn 1,2g/g vào mẫu táo đỏ ................................... 56
Hình 3.17: Độ thu hồi NAAm khi thêm chuẩn 1,2g/g vào mẫu táo đỏ ................................ 56
Hình 3.18: Độ thu hồi NAA khi thêm chuẩn 1,2g/g với 3 kỹ thuật chiết............................. 57
Hình 3.19: Độ thu hồi NAAm khi thêm chuẩn 1,2g/g với 3 kỹ thuật chiết.......................... 58
Hình 3.20: Độ thu hồi NAA khi thêm chuẩn 1,2g/g thay đổi theo thời gian chiết ............... 59
Hình 3.21: Độ thu hồi NAAm khi thêm chuẩn 1,2g/g thay đổi theo thời gian chiết ............ 59
Hình 3.22: Độ thu hồi NAA khi thêm chuẩn vào mẫu táo đỏ với 3 kỹ thuật làm giàu mẫu.... 60
Hình 3.23: Độ thu hồi NAAm khi thêm chuẩn vào mẫu táo đỏ với 3 kỹ thuật làm giàu mẫu. 61
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
x
Hình 3.24: Kết quả phân tích hàm lượng các loại đường trong mẫu táo và các phân lớp dung
môi khi chiết mẫu ................................................................................................................ 63
Hình 3.25: Khả năng tách lớp của muối MgSO4 và NaCl ..................................................... 64
Hình 3.26: Độ thu hồi của NAA và NAAm sau khi thêm muối để loại nước ........................ 64
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
1
MỞ ĐẦU
Ngày nay, nhu cầu ăn uống không chỉ ăn no, ngon, cân bằng dinh dưỡng, mà
còn chú trọng vào việc bảo vệ sức khỏe, sử dụng các sản phẩm không gây ảnh
hưởng xấu đến sức khỏe. Các loại độc tố cần kiểm soát trong thực phẩm bao gồm:
nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, độc tố vi nấm, chất kháng sinh, kim loại nặng, thuốc
bảo vệ thực vật (Thông tư của bộ y tế số 50-2016-TT/BYT). Trong các loại cây
trồng, nhóm các chỉ số thuốc bảo vệ thực vật và chất kích thích tăng trưởng được
quan tâm nhiều hơn so với kim loại nặng, do kim loại nặng sinh ra chủ yếu từ nguồn
đất và nguồn nước bị nhiễm (Qi et al., 2011, Candeias et al., 2014), các chỉ tiêu về
vi sinh có thể giảm hoặc mất đi trong quá trình sơ chế và chế biến (Rhee et al.,
2003, BURFOOT et al., 1990). Theo quy định của Liên minh Châu Âu (EU), hơn
400 chất và nhóm chất thuốc bảo vệ thực vật trong gạo, táo đỏ và thanh long phải
được kiểm soát (Commission, 2005).
Sản lượng táo đỏ năm 2018 của châu Âu khoảng 1,9 triệu tấn, châu Á là 5,3
triệu tấn và Thế giới là 86 triệu tấn (Division, 2018). Hiện nay, táo đỏ nhập khẩu
vào Việt Nam rất nhiều và để kiểm tra tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trong các loại
trái cây nhập đặc biệt là táo đỏ, nhất thiết phải cần có quy trình kiểm sốt chất
lượng. Trong quả táo đỏ các chất 1-naphthylacetic acid (NAA) và 1naphthylacetamid (NAAm) phải được kiểm soát theo giới hạn nhỏ hơn 0,15mg/kg
của EU (Commission, 2005). Hiện nay, trong nước chưa có trung tâm nào phân tích
được NAA và NAAm trong phân bón, thực phẩm cũng như trái táo đỏ (theo văn
phịng cơng nhận chất lượng Việt Nam - BOA). Chính vì những lý do nêu trên, việc
“phát
triển
phương
pháp
phân
tích
1-naphthylacetic
acid
và
1-
naphthylacetamid trong quả táo đỏ bằng kỹ thuật sắc ký hiệu năng cao ghép
đầu dò DAD” là cần thiết để tạo thuận lợi cho phân tích chất lượng NAA và
NAAm trong quả táo đỏ trước khi nhập khẩu.
Mục tiêu tổng quát: Xây dựng phương pháp phân tích NAA và NAAm trong
quả táo đỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
2
Mục tiêu cụ thể: cần thực hiện 3 mục tiêu cụ thể sau để hoàn thành mục tiêu
tổng quát của nghiên cứu này:
Xây dựng quy trình phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD.
Xây dựng quy trình xử lý mẫu táo đỏ dùng phân tích NAA và NAAm
trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dị DAD.
Phân tích NAA và NAAm trong quả táo đỏ được thu mua từ chợ địa
phương và siêu thị.
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Cấu tạo, danh pháp, tính chất và độc tính của 1-napthylacetic acid
(NAA) và 1-naphthylacetamid (NAAm)
1.1.1. Cấu tạo, danh pháp và tính chất của NAA và NAAm
Bảng 1.1: Cấu tạo, danh pháp và tính chất của NAA và NAAm
NAA (PubChem, 2020b)
NAAm (PubChem, 2020a)
Cấu tạo
Danh pháp
Phân tử khối
Nhiệt độ nóng
chảy
Độ tan trong nước
m/z có cường độ
cao
1-Naphthylacetic acid
2-(Naphthalen-1-yl)Acetic
Acid
1-Naphthalene acetic acid
α-Naphthalene acetic acid
186,21g/mol
1-Naphthylacetamide
2-(1-Naphthyl)acetamide
Naphthaleneacetamide
α -Naphthylacetamide
185,22g/mol
135oC
184oC
420mg/L tại 20°C
0,039mg/mL tại 40°C
141, 185
141, 185
Theo công thức cấu tạo của 2 chất tăng trưởng này, có thể nhận định hai chất
có tính chất tương đối giống nhau về độ hịa tan trong dung mơi như acetonitril
(ACN) hay methanol hoặc nước do có cùng vịng naphthalen và 1 nhóm chức
tương đối phân cực, phù hợp cho q trình xử lý mẫu để có được độ thu hồi gần
giống nhau.
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
4
1.1.2. Nghiên cứu độc tính của NAA và NAAm
NAA có hại cho chuột sau khi uống, liều gây chết 50% cá thể (LD50) là
1750mg/kg trọng lượng cơ thể, có hại nếu nuốt phải. NAA có độc tính thấp sau
khi tiếp xúc cấp tính với da và đường hơ hấp, liều gây chết 50% cá thể là trên
2000mg/kg trọng lượng cơ thể. NAA khơng có bằng chứng về kích ứng da,
nhưng có kích ứng mắt (Authority, 2011a).
Độc tính của NAA được đánh giá dựa trên nghiên cứu liều lặp lại trên chuột
và trên chó ở mức từ 10 đến 500mg/kg trọng lượng cơ thể. Ở chuột, mức nồng
độ 10mg/kg là mức ảnh hưởng không quan sát được. Mức ảnh hưởng không
quan sát được ở chó là 60mg/kg/ngày. Tuy nhiên dùng NAA trong 6 tháng có
bằng chứng nhẹ về gây viêm màng ngồi tim ở nhóm thấp. NAA gây độc sinh
sản trong ống nghiệm. Khi thực hiện trên động vật sống thì không chứng minh
được khả năng gây độc gen của NAA (Authority, 2011a).
NAAm có một số độc tính khác, nhưng có thể kết luận nó có mối liên quan
đến độc tính của NAA. NAAm có khả năng gây hại nếu nuốt phải. Liều gây
chết 50% cá thể lên đến 1655mg/kg trọng lượng cơ thể, khơng gây kích ứng da
nhưng gây kích ứng mắt. Mức ảnh hưởng không quan sát được lên đến 5mg/kg
trọng lượng cơ thể/ngày. NAAm không gây độc gen cũng như ung thư. Giống
như NAA, nó cũng gây tăng trọng gan và thận của chuột. Giá trị tham chiếu cho
sự ảnh hưởng không quan sát được thiết lập ở mức 15mg/kg trọng lượng cơ
thể/ngày ở chuột, được nghiên cứu qua 90 ngày. Mức tiêu thụ hàng ngày có thể
chấp nhận được là 0,1mg/kg trọng lượng/ngày (Authority, 2011b).
1.2. Các phương pháp phân tích NAA và NAAm
1.2.1. Các phương pháp phân tích NAA và NAAm
1.2.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò quang phổ mảng diod (DAD)
Sắc ký là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa vào sự khác
biệt về tính chất hóa học và vật lý của chúng đối với pha tĩnh và pha động.
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
5
Pha động là pha mang chất phân tích di chuyển qua hệ thống. Pha tĩnh là
pha được gắn cố định trong cột phân tích bới chất nền. Khi chất phân tích
đi qua pha tĩnh, các chất có tương tác mạnh với pha động và có ít tương
tác với pha tĩnh thì sẽ di chuyển nhanh hơn, ngược lại chất trong mẫu sẽ di
chuyển chậm hơn. Hệ sắc ký bao gồm một cột chứa pha tĩnh và chất nền,
trong khi chất phân tích và pha động di chuyển qua cột. Đây là cách tiếp
cận của Mikhail Tswett được mô tả lần đầu tiên vào năm 1903 (Hage,
2018).
Hình 1.1: Tách hai chất hóa học bằng cách sử dụng cơt sắc ký (Hage, 2018)
Sắc ký được phân ra làm hai loại là sắc ký lỏng và sắc ký khí. Trong
sắc ký lỏng được chia làm 5 loại dựa vào cơ chế phân tách là sắc ký hấp
phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử và sắc ký ái lực. Trong
đó sắc ký phân bố là loại được sử dụng nhiều và cũng là loại dùng cho
phân tích các chất đang nghiên cứu. Sự tách các chất trong sắc ký phân bố
là do sự tương tác của chất phân tích với lớp pha tĩnh. Pha thuận và pha
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
6
đảo là hai loại của sắc ký phân bố. Pha thuận sử dụng pha tĩnh là chất
phân cực, pha đảo sử dụng pha tĩnh không phân cực.
Hệ thống sắc ký lỏng bao gồm 5 bộ phận chính: Dung mơi (hay còn gọi
là pha động), bơm nhu động, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dị (ghi
nhận tín hiệu), bộ phận xử lý tín hiệu và điều khiển (hình 1.2).
Có nhiều loại đầu dò dùng cho phát hiện chất phân tích sau khi đã phân
tách bằng ký lỏng như đầu dò tử ngoại khả kiến (UV-Vis), đầu dò quang
phổ mảng diod (DAD), đầu dò khúc xạ kế, đầu dò huỳnh quang, đầu dị
khối phổ (1 lần hoặc 2 lần).
Hình 1.2: Hệ thống sắc ký lỏng điển hình (Hage, 2018)
Năm 2004, hãng Waters đã cho ra đời máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng
(UPLC), kỹ thuật này là làm tăng hiệu năng tách các chất phân tích và rút
ngắn thời gian phân tích bằng cách sử dụng các cột sắc ký có đường kính
nhỏ hơn như 2,1mm và hạt 1,7µm (HPLC sử dụng cột có đường kính
4,6mm và kích cỡ hạt 5µm) (Nováková et al., 2017). Điều này đồng nghĩa
hệ thống mới phải có khả năng hoạt động ở áp suất rất cao mới có thể đưa
pha động qua hệ thống, áp suất của UPLC lên đến 1500bar, các hệ HPLC
thường có áp suất khoảng 300bar.
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
7
Đầu dò quang phổ tử ngoại (UV-Vis) thường được sử dụng trong sắc
ký lỏng. Vùng tử ngoại có bước sóng 190 – 380nm, trong khi vùng ánh
sáng nhìn thấy (Vis) có bước sóng từ 370 – 900nm. Các chất phân tích có
nhóm vịng thơm, nối đơi, nói ba thường hấp thu trong khoảng 250 –
300nm. Rất nhiều hợp chất khác có khả năng hấp thu bước sóng từ 190 –
220nm như amid, acid carboxylic (Hage, 2018). Sơ đồ cấu tạo đèn UVVis như sau:
Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo đầu dò UV-Vis (Jones, 1985)
Đầu dò DAD cũng tương tự như đầu dị UV-Vis, nhưng có khả năng
ghi nhận nhiều bước sóng cùng lúc. Ngày nay đầu dị DAD được sử dụng
rất nhiều do có thể phân tích nhiều chất có khả năng hấp thu nhiều bước
sóng khác nhau trong cùng 1 lần phân tích. Trong đề tài này cần phải xác
bước sóng hấp thu cực đại vì mỗi chất phân tích trong mỗi loại mơi trường
khác nhau (acid, baz, trung tính) sẽ có tính chất khác nhau dẫn đến khả
năng hấp thu bước sóng ở vùng tử ngoại khả kiến sẽ khác nhau.
Cột phân tích Chiralpak IG: Trong mỗi cột phân tích, pha tĩnh là vật
liệu tương tác với chất phân tích, quyết định đến khả năng tách chất phân
tích ra khỏi nền mẫu và các cùng phân tích khác. Tuy nhiên pha tĩnh này
muốn gắn lên cột cần phải có chất nền, chất nền của cột chiralpak IG này
là amylose. Đây là cột thế hệ mới, thay thế nhóm methyl (CH3-) bằng
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
8
nhóm clorin (Cl) trong pha tĩnh của cột chiralpak IA (Ghanem and Wang,
2018).
Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo chất
Hình 1.5: Công thức cấu tạo
nền cột Chiralpak IG
pha tĩnh cột Chiralpak IG
Cột này có khả năng phân tích chất phân cực như NAA và NAAm rất
tốt, trong khi cột C18 thì khơng có khả năng tách hai chất này. Cột này
chưa được dùng để phân tích NAA và NAAm trước đó nên cần phải xác
định lại khả năng hòa tan trong từng dung mơi và pha động tối ưu cho q
trình tách hai chất phân tích.
1.2.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ
Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ hai lần là một kỹ thuật
mới, kỹ thuật này có độ nhạy và có độ chọn lọc rất cao, được sử dụng để
định danh các hợp chất mà không cần xác nhận bằng phương pháp khác
(Communities, 2002). Kỹ thuật này sử dụng các nguồn ion hóa để phân
mảnh phân tử của hợp chất phân tích thành ion con, sau đó khối phổ con
được ion hóa thêm 1 lần nữa để tạo thành ion cháu. Các ion này được ghi
nhận bởi đầu dò (Banerjee and Mazumdar, 2012). Các ion có thể tạo ra
bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton
hóa,... Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số khối lượng/ điện tích
(m/z) và được phát hiện, từ đó có thể cho thơng tin về khối lượng hoặc
cấu trúc phân tử của hợp chất.
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion,
thiết bị phân tích và bộ phận phát hiện. Trước hết, các mẫu được ion hóa
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
9
trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion
theo tỉ số m/z. Sau đó các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), chúng
sẽ được khuếch đại và chuyển thành tín hiệu. Các tín hiệu thu được sẽ
chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ.
Tránh ion phân tích va chạm
với ion trong khơng khí
Chân khơng cao
Nguồn ion
Phân tích
khối
Detector
Phổ khối
Xử lý và lưu
giữ dữ liệu
Hình 1.6: Cấu trúc của máy khối phổ MS
Nguồn ion
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để
chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử. Một số kĩ thuật ion hóa
thường được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa đầu phun
điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí
quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI). Tuy nhiên kỹ
thuật APCI ít được sử dụng.
Kĩ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) bao gồm ba quá trình cơ bản sau:
Tạo thành các giọt mang điện tích.
Làm giảm kích thước của các hạt, và phân nhỏ các hạt.
Quá trình hình thành pha hơi các ion.
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
10
Khi dung dịch mẫu ra khỏi cột sắc ký, được đưa vào ống mao quản
bằng kim loại. Đầu mao quản này được áp điện thế cao (4-6 kV). Khi điện
tích dư trên đầu mao quản vượt qua sức căng bề mặt của dung dịch mẫu
thì sẽ tạo thành các giọt mang điện tích. Tiếp đó các giọt mang điện này
được làm giảm kích thước nhờ hai q trình liên tục xảy ra, đó là sự hóa
hơi dung mơi nhờ dịng khí nitrogen (N2) được liên tục thổi vào và sự bắn
phá của các giọt tích điện cùng dấu. Cuối cùng dẫn đến sự hình thành pha
hơi của các ion. Nhờ lực hút tĩnh điện mà các ion này được dẫn vào bộ
phân tích khối phổ qua một cửa sổ rất nhỏ. Dung mơi và khí trơ N2 được
hút ra ngồi do một dịng khí (Curtain Gas).
Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm.
Loại hình thành ion dương.
o
Phù hợp nhất cho phân tích các loại chất có tính baz.
o
Thường hình thành nên ion [M+H]+.
o
Cũng có thể hình thành ion [M+nH]n+ , [M+Na+]+
Loại hình thành ion âm.
o
Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại chất có tính acid.
o
[M-H]- , [M-nH]n-
Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng
phân tích các chất khơng phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat,
nucleotit, polyetilen glycocol,... và các chất phân cực có khối lượng phân
tử nhỏ.
Bộ phận phân tích khối
Là trái tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số
m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt, có nhiều bộ phân tích khối khác
nhau như: Bộ phân tích tứ cực, phân tích tứ cực chặp ba, phân tích bẫy
ion, phân tích thời gian bay... Hiện nay, có ba loại phân tích khối thường
được sử dụng nhất, đó là:
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
11
Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser) - phân giải bằng tổ hợp
điện.
Máy tứ cực dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽ dao
động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào
mơi trường di chuyển của nó.
Máy gồm 4 thanh cực ghép song song nối với nhau từng đôi một đối
diện nhau, tạo thành hai cặp, sau đó chúng nối với điện áp một chiều tạo
thành 2 cặp dương và âm. Ngoài điện áp một chiều, hai cặp điện cực còn
được nối với điện áp xoay chiều. Tổ hợp điện áp này đặc biệt là điện áp
xoay chiều sẽ thay đổi theo chu kỳ để quét khối lượng các ion:
o Ion cộng hưởng
o Ion không cộng hưởng.
Một số ion có tỷ số m/z xác định cộng hưởng với thế xoay chiều xác
định có thể đi thẳng qua khoảng khơng đến đầu dị. Trong khi đó các ion
khác khơng sẽ có quỹ đạo khơng ổn định, va chạm với các cực và bị giữ
lại ở đó. Tuy nhiên để thu được tất cả các ion, cần phải quét điện áp theo
chu kỳ từ 0 đến một điện áp nhất định tăng dần sau đó lại trở lại 0, lần lượt
các ion sẽ vượt qua được tứ cực có khối lượng từ nhỏ đến lớn để đến đầu
dị.
Bộ phân tích tứ cực bẫy ion (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
Bẫy tứ cực hoạt động theo nguyên lý bộ phân tích khối tứ cực, chỉ có
một điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy. Bằng cách
thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có
thể vượt qua khoảng khơng để đến đầu dị. Các ion này cũng có thể bị bắn
phá trong bẫy để thu được các ion con. Về ngun tắc loại phân tích khối
phổ bẫy ion có thể làm đến MS nhiều lần. Loại thiết bị này bao gồm một
điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện
cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới. Trái với lại thiết bị tứ
cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường cong ổn định
HVTH: Phạm Minh Tiến
GVHD: TS. Lâm Văn Mân
