Ví dụ phương pháp sanger

Ví dụ phương pháp Sanger
Giải trình tự DNA theo Sanger thực hiện các bước giống kỹ thuật PCR, trong đó
thành phần của phản ứng bao gồm những chất cần thiết để nhân bản DNA:
+ Một enzyme DNA polymerase xúc tác phản ứng kéo dài mạch
+ Một primer: là một đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, là trình tự khởi đầu
cho polymerase
+ trình tự DNA
+ 4 loại deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCPP, dGPP)
+ 4 loại dideoxy nucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu đồng vị
phóng xạ.
Qui trình:
1. Chuẩn bị DNA đích (PCR)
+ đoạn DNA đích có thể nằm trong DNA bộ gen
+ đoạn DNA đích có thể được gắn vào một vector plasmid hoặc vector thể thực
khuẩn
+ đoạn DNA đích được khuếch đại nhờ PCR
2. Tinh sạch DNA đích
3. Chạy phản ứng giải trình tự
4. Tinh sạch sản phẩm của phản ứng giải trình tự
5. Điện di để đọc kết quả
Phản ứng giải trình tự 1978 (sanger cổ điển):
+ Thời đó dùng chất đánh dấu, dùng chất phóng xạ là những đồng vị phóng xạ gắn
vào những ddNTP
+ Phản ứng chạy trong 4 ống (mỗi ống gần như giống nhau về thành phần gồm DNA
đích là sợi đơn tức là đã biến tính tách ra 2 sợi đơn và giải trình tự trên từng mạch 1
sau đó so trình tự lại xem có khớp hay khơng, nếu khơng khớp và khơng giống trình
tự người bình thường nghĩa là đột biến, có 1 primer vì chạy trên sợi đơn nên chỉ cần
1 primer, có dNTP, ddNTP, enzyme DNA polymerase )


Lưu ý: trong mỗi ống dNTP cho đủ 4 loại, nhưng ddNTP mỗi ống chỉ cho 1 loại và loại

đó được đánh dấu phóng xạ, vì vậy sẽ có 4 ống khác nhau, cho chạy phản ứng từng
ống

+ Cuối cùng cho điện di trên gel, thời đó chưa có máy xịn, thì người ta sẽ dùng đồng
vị phóng xạ và đi chụp hình trên 1 phim x-quang, điện di mỗi ống trên 1 hàng rồi lấy
thước dò rồi ghép thành 1 trình tự rồi đọc trình tự


Phim x-quang và để lấy thước đo


+ thời đó dùng chất đánh dấu, dùng chất phóng xạ là những đồng vị phóng xạ gắn
vào những ddNTP
+ phản ứng chạy trong 4 ống (mỗi ống gần như giống nhau về thành phần gồm DNA
đích là sợi đơn tức là đã biến tính tách ra 2 sợi đơn và giải trình tự trên từng mạch 1
sau đó so trình tự lại xem có khớp hay khơng, nếu khơng khớp và khơng giống trình
tự người bình thường nghĩa là đột biến. có 1 primer vì chạy trên sợi đơn nên chỉ cần
1 primer, có dNTP, ddNTP, enzyme DNA polymerase )
Lưu ý: trong mỗi ống dNTP cho đủ 4 loại, nhưng ddNTP mỗi ống chỉ cho 1 loại và loại
đó được đánh dấu phóng xạ, vì vậy sẽ có 4 ống khác nhau, cho chạy phản ứng từng
ống
Hình A có sợi đơn DNA cần giải trình tự là màu đen, cái prime sẽ bắt vơ, nó là phần
màu đỏ và chiều mũi tên qua bên phải là chiều tổng hợp, nghĩa là enzyme
polymerase sẽ bắt vào phần này của primer và kéo dài chuỗi ra. Như vậy khi mà kéo
dài chuỗi ra thì phần B là đã thả vào 2 loại nucleotide triphosphat, 1 loại là binh
thường và 1 loại là ddNTP. Loại ddNTP này có đánh dấu sao nghĩa là bị mất đi oxy và
nó được đánh dấu phóng xạ trên ddNTP. Hình C thì ví dụ ban đầu trong ống giải trình
tự ta có 3 phân tử DNA đích (chứ thật ra là có rất nhiều vì trước đó đã nhân lên rất
nhiều lần bằng PCR, thì nó có rất nhiều), phân tử đầu tiên, ống này ví dụ là có chứa
ddA, đoạn này đã được tổng hợp 1 đoạn, nghĩa là trình tự ở đây có thể là C,G,A,T thì

khơng quan trọng, vì trong này có 4 loại nucleotide bình thường nên nó cứ thế tổng
hợp. vì đây là ống chứa ddA (vì ddA bổ sung T) nên chỉ quan tâm những vị trí có phân
tử DNA mẫu. chỗ nào ngẫu nhiên bắt trúng ddA (khơng có oxy) thì ngừng chuỗi. sản
phẩm ra là 3 cái ở 3 vị trí khác nhau, chiều dài khác nhau nằm trong 1 ống
Cuối cùng cho điện di trên gel, thời đó chưa có máy xịn, thì người ta sẽ dùng đồng vị
phóng xạ và đi chụp hình trên 1 phim x-quang, điện di mỗi ống trên 1 hàng rồi lấy
thước dị rồi ghép thành 1 trình tự rồi đọc trình tự



Phản ứng giải trình tự Sanger cải tiến
+ Nguyên tắc giống Sanger cổ điển, nhưng thay vì đánh dấu đồng vị phóng xạ, bây
giờ người ta gắn chất có khả năng phát huỳnh quang khi chiếu laser, huỳnh quang có
nhiều màu, mỗi ddNTP là 1 màu.
+ Nên tất cả để cùng 1 ống, sau đó vẫn phải điện di để phân tách sản phẩm từ dài
đến ngắn, điện di trong ống vi mạch rất nhỏ gọi là điện di mao quãng
+ Sau đó cho lần lược mao quãng điện di đi qua cửa sổ rồi bắn laser vào đó, sẽ
chuyển tín hiệu foton thành tín hiệu điện, máy sẽ nhận được và máy đã qui ước
thành tín hiệu điện sẽ biểu hiện trên màn hình là màu gì, vì vậy ta có những đỉnh
màu, máy sẽ đọc vì đã qui ước phần mềm, máy đọc trình tự, gọi là biểu đồ sắc kí

Một số hình ảnh khác


biểu đồ sắc kí khác

+ Đây là 1 đoạn mẫu ngắn, trên người lành bộ 3 là CTG nhưng trên bệnh nhân là
CGG, vị trsi T biến thành G, thay vì đỉnh có tín hiệu màu đó thì lại là màu đen
+ khi biến đổi 1 nu thì nguyên bộ 3 biến đổi, bộ 3 bị biến đổi lẽ ra bộ 3 CTG mã hóa
axit amin Lơxin (L) thì bây giờ biến thành CGG sẽ mã hóa axit amin Arginine (R)

 Chỉ cần trên nguyên gen, nguyên protein đó 1 nu bị biến đổi dẫn đến biển đổi 1 axit
amin đã gây bệnh