Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử trong tạo dòng phục hồi phục vô công tác chọn tạo giống lúa lai 3 dòng ppt

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
TẠO DÒNG PHỤC HỒI PHỤC VÔ CÔNG TÁC CHỌN TẠO
GIỐNG LÚA LAI 3 DÒNG
Lê Hùng Lĩnh
1
, guyễn Trí Hoàn
2
, guyễn Thị
Hằng
2
, Hồ Hữu hị
2
, Lê Duy Đức
1

SUMMARY
Validation of molecular markers linked to fertility restorer gens and aplication
marker-assisted selection to create restorer lines
The present study was carried out with the objective to validate the molecular markers,
which have been previously reported to be linked to fertility restorer gene for WA-CMS
lines of rice. An advanced segregating F
2
population derived from a cross between
IR58025A as a WA-CMS parent and R100 as a restorer line. The 40 F
2
plants were
evaluated for fertility restorer trait and the genotypes of the 40 F
2
plants were determined
using SSR markers. Using the marker-trait segregation data derived from analysis of the
mapping population, a local linkage map of the genomic region around fertility restorer

gene, a major fertility restoration locus on Chromosome 10 was constructed interval
between SSR marker RM258 and RM171.
Using marker-assisted selection for fertility restoration in segregating populations and
identification of restorer, 12 restorer lines was bred including: BB13/R838, R7, IR35, RV114,
BB4/4492, CC/R838, BB11/R23, IR78, BB14/R242, BB15/TR64, BC15, BB11/R23. Through
the present study, we have established the usefulness of the marker-assisted selection method
to create new rice varieties.
Keywords: Hybrid rice, molecular markers and restorer gen.
I. §ÆT VÊN §Ò
Lúa lai có thể cho năng suất tăng hơn
20-30% so với lúa thường trong điều kiện
trồng thâm canh ở Trung Quốc Dòng bất
dục đực tế bào chất CMS kết hợp với dòng
phục hồi R là công cụ di truyền quý giá để
khai thác tiềm năng ưu thế lai. Đến nay,
hơn 90% lúa lai vẫn sử dụng dòng bất dục
đực tế bào chất kiểu WA (wild abortive)
(Yao et al., 1997). Các nhà khoa học
Trung Quốc, IRRI và các nước khác đã
tạo ra hàng trăm dòng CMS và hàng ngàn
dòng R có đặc điểm di truyền khác nhau
với nền di truyền đa dạng và phong phú,
trên cơ sở đó tạo ra được nhiều các tổ hợp
1
Ph
òng

Sinh h
ọc

p
h
â
n t
ử
, Vi
ện

Di truy
ền

N
ô
ng nghi
ệp.


2
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Lúa lai, Viện Cây lương thực và Cây thực phNm.
lai thớch ng cho nhiu vựng sinh thỏi
khỏc nhau.
Gn õy, cụng ngh sinh hc c coi
nh l phng tin hu hiu gii quyt
nhng vn khú khn m cụng tỏc chn
ging c truyn khụng th thc hin c.
Thnh tu ca k thut ch th phõn t
DN A v k thut lp bn gen l nhng
cụng c mi gúp phn tr giỳp c lc cho
cụng tỏc chn to cỏc ging cõy trng. Vi
s h tr ca ch th Marker phõn t, hng

nghỡn QTLs liờn kt vi tớnh trng nụng
sinh hc, gen phc hi, bt dc c mn
cm nhit , chng chu sõu bnh, chu
hn ó c phỏt hin.
Gen phc hi bt dc t bo cht ó
c xỏc nh, lp bn cho cỏc loi bt
dc t bo cht ti cỏc locus/gen khỏc nhau
trờn cỏc nhim sc th khỏc nhau
(Gramene website). Trờn trang Gramene
website nhng gen phc hi bt dc c t
bo cht Rf ó c cụng b vi v trớ trờn
nhim sc th v c kớ hiu t Rf1 n
Rf17. Bharaj et al., (1995) xỏc nh c
genes viz. Rf4 (Rf-WA-1) and Rf6 (Rf-WA-
2) trờn nhim sc th 7 v 10. Zhang et al.,
(1997) xỏc nh gen Rf3 gene liờn kt ch
th RFLP markers trờn nhim sc th 1.
Yao et al., (1997) xỏc nh hai gen phc
hi bt dc c t bo cht kiu WA CMS
trờn nhim sc th 1 (Rf3) v 10 (Rf6)
Vic chn to ra cỏc dũng phc hi s
dng trong cụng tỏc chn ging lỳa lai 3
dũng l vụ cựng quan trng, xut phỏt t
c s ú chỳng tụi ó thc hin ti
"ghiờn cu ng dng ch th phõn t
trong vic to dũng phc hi phc v cụng
tỏc chn ging lỳa lai 3 dũng" .
II. VậT LIệU V PHƯƠN G PHáP N GHIÊN
CứU
1. Vt liu nghiờn cu

- Dũng m IR58025A l dũng bt dc
c t bo cht c chn to ti IRRI.
Dũng b R100, dũng phc hi c nghiờn
cu chn lc ti Trung tõm N ghiờn cu Lỳa
lai v 34 dũng trin vng th h F5 gia
dũng phc hi v dũng mang gen chng
chu sõu bnh.
2. Phng phỏp nghiờn cu
- B trớ thớ nghim v ỏnh giỏ cỏc ch
tiờu theo phng phỏp nghiờn cu lỳa lai
ca Vin N ghiờn cu Lỳa Quc t (IRRI).
- Tỏch chit DN A tng s t mu lỏ
theo phng phỏp CTAB ci tin. K thut
in di trờn gel polyacrylamide. K thut
lm phn ng PCR vi cỏc loi mi SSR.
K thut thu thp d liu v phõn tớch d
liu theo cỏc phn mm POPGEN E,
MAPMAKER v cỏc phng phỏp phõn
tớch thng kờ khỏc.
III. KếT QUả V THảO LUậN
1. Kt qu phõn tớch di truyn ca tớnh
trng phc hi hu dc
S di truyn tớnh trng phc hi bt dc
c t bo cht c ỏnh giỏ thụng qua s
phõn ly kiu hỡnh (bt dc/hu dc) ca cỏc
cỏ th trong qun th phõn ly. Trong thớ
nghim ny, 100 cỏ th F2 ó c s dng
phõn tớch di truyn. Hai bụng ca mi cỏ
th c bao cỏch ly bng giy búng kớnh
ngn chn phn l bay vo nhm ỏnh

giỏ kh nng t u ht. N goi s ỏnh giỏ
t l u ht, cỏc cỏ th ó c ỏnh giỏ
ht phn thụng qua nhum IKI 1% v quan
sỏt di kớnh hin vi quang hc. Bng 1 l
kt qu nhn c trong thớ nghim ỏnh
giá di truyn tính trng phc hi bt dc c t bào cht.
Bảng 1. Kết quả phân tích sự di truyền của tính trạng phục hồi
Đối tượng theo dõi Số cây hữu dục Số cây bất dục
IR58025A 0 30
R100 30 0
Quần thể F2 của tổ hợp lai
IR58025A/R100
Phân ly thực tÕ
72 28
Phân ly lý thuyết 75 25
X
2
X
2
= 0,48

Kt qu bng 1 cho thy s phân ly các
cá th hu dc và bt dc trong qun th F2
tuân theo quy lut ca Menden vi t l 3
hu dc : 1 bt dc, vi ch s X
2
= 0,48.
Như vậy, tính trạng phục hồi bất dục đực tế
bào chất là tính trạng đơn gen.
2. Kết quả xác định chỉ thị phân tử liên

kết gen phục hồi hữu dục đực tế bào chất
Trong thí nghiệm này, đã thu ngẫu
nhiên mẫu lá của 40 cá thể thuộc quần thể
F2 cùng với dòng mẹ IR58025A và dòng bố
R100. Những chỉ thị phân tử cho đa hình
giữa dòng mẹ IR58025A và dòng bố R100
được sử dụng chạy kiểm tra di truyền các cá
thể trong quần thể F2 để xác định liên kết
của chỉ thị phân tử với gen phục hồi bất dục
đực tế bào chất. Kết quả phân tích sự đồng
phân ly giữa kiểu hình và kiểu gen của các
chỉ thị SSR cho gen phục phục hồi bất dục
đực tế bào chất trong quần thể F2 cho thấy
40 cá thể F2 chia thành hai nhóm rõ rệt 29
cá thể hữu dục và 11 cá thể bất dục. Hai
nhóm kiểu hình này đồng phân ly kiểu gen
tại chỉ thị phân tử SSR RM258 và RM171.
Tỷ lệ 3:1 (29:11) cho tính trạng hữu dục và
bất dục đã khẳng định gen phục hồi bất dục
đực tế bào chất là một gen trội. Từ kết quả
này cho ta thấy chỉ thị phân tử SSR RM258
và RM171 liên kết với gen phục hồi bất dục
đực. Dựa vào kết quả trên chúng tôi đã xác
định vị trí locus mang gen phục hồi bất dục
đực tế bào chất nằm trên nhiễm sắc thể số
10, với hai chỉ thị phân tử lµ RM258 và
RM171 (www.gramene.org) (hình số 4).

1: Dòng IR58025A 2: Dòng R100
Hình 1. Kt qu chy a hình ca các ch th vi b m

Hình 2. Kt qu chy a hình ca các ch th vi b m

1=IR58025A, 2= Dị hợp tử, 3=R100
Hình 3. Kt qu kim tra di truyn vi marker RM258

Hình 4. Bn  ch th phân t SSR liên kt vi gen phc hi trên nhim sc th s 10
3. Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc các
dòng phục hồi triển vọng
 xác nh nhng dòng phc hi trin
vng, ã ã thu thp ưc 34 dòng  th h
F
5
t t hp lai gia dòng phc hi và
dòng có các c tính mong mun  kim
tra bng các ch th phân t. Các mu lá
non, khe mnh, không có sâu bnh ưc
thu t 34 dòng khác nhau ngoài ng
rung. S dng các ch th RM258 và
RM171 liên kt gen phc hi kim tra các
dòng trin vng mang gen phc hi. Kt
qu chúng tôi ã chn lc ưc 12 dòng
mang gen phc hi (bng 4).
Bảng 4. Các dòng mang gen phục hồi được chọn lọc bằng chỉ thị phân tử
STT Tên dòng Stt Tên dòng
1 BB13/R838 7 BB11/R23
2 R7 8 IR78
3 IR35 9 BB14/R242
4 RV114 10 BB15/TR64
5 BB4/4492 11 BC15

6 CC/R838 12 BB11/R23

Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam
6
IV. KếT LUậN
- Kết quả nghiên cứu cho thấy gen phục hồi là gen tri và có hai ch th phõn t
SSR: RM258 v RM171 liờn kt cht vi locus mang gen này trờn nhim sc th s 10.
- Với việc sử dng các ch th phõn t đấ xác định ở trên ó ó sàng lọc c cỏc
dũng lúa: BB13/R838, R7, IR35, RV114, BB4/4492, CC/R838, BB11/R23, IR78,
BB14/R242, BB15/TR64, BC15, BB11/R23 mang gen phục hồi
- Kết hợp với các đặc tính nông học trong s 12 dòng trên kết quả cho thấy có 4 dòng:
BC15, BB13/R838, RV114 và BB4/4492 là tốt nhất có độ thuần, u thế lai cao, và chống
chịu bênh tốt
TI LIU THAM KHO
Bharaj TS, Virmani SS, Khush GS, 1995. Chromosomal location of fertility restoring
genes for wild abortive cytoplasmic male sterility using primary trisomics in rice.
Euphytica 83:169-173.
Linh L.H, Hang . T., Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S.., 2008. Introgression of a
quantitative trait locus for spikelets per panicle from Oryza minuta to the O. sativa
cultivar Hwaseongbyeo. Plant Breeding doi:10.1111/j.1439-0523.2007.01462.x.
Linh L.H, Jin F.X, Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S.., 2006. Mapping quantitative
trait loci for heading date and awn length using an advanced backcross line from a
cross between Oryza sativa and O. minuta. Breeding Science 56: 341-349.
Virmani S.S., 2003. Advances in hybrid rice research and development in the tropics. In:
Virmani SS, Mao CX, Hardy B (eds) Hybrid rice for food security, poverty
alleviation, and environmental protection. Proceedings of the 4
th
International
Symposium on Hybrid Rice, 14-17 May 2002, Hanoi, Vietnam. International Rice
Research Institute, Manila, Philippines, pp 7-20.

Yao F. Y., Xu C. G., Yu S. B., Li J. X., Gao Y. J., Li X. H. and Zhang Q., 1997. Mapping
and genetic analysis of two fertility restorer loci in the wild abourtive cytoplasmic
male sterility system of rice (O. sativa L.); Euphytica 98, 183 - 187.
Zhang G.; Bharaj T.S.; Virmani S.S. and Huang ., 1997. Mapping of the RFLP - 3
nuclear fertility restoring gene for WA cytoplasmic male sterility in rice using RAPD
and RFLP markers; Theor. Appl. Genet. 83, 495 - 499.
gi phn bin
PGS. TS. Nguyn Vn Vit