Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen quy định hàm lượng amylose ở lúa

PHẦN I. MỞ ĐẦU
Hiện nay một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng của một giống lúa đó là
hàm lượng amylose (AC) cao, thấp hay trung bình. Với những giống lúa cho gạo có
hàm lượng amylose cao thường lâu chín, cơm khô và cứng khi để nguội, gạo có hàm
lượng amylose thấp hoặc rất thấp thường dính không tơi cơm, trong khi đó gạo có hàm
lượng amylose trung bình thường tơi cơm ăn không ráp và không cứng khi để nguội
nên được người tiêu dùng ưa chuộng. Do đó chọn tạo các giống hàm lượng amylose
trung bình là vấn đề cấp thiết.
Cùng với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học và tin học đã cho
phép chúng ta tiếp cận các yếu tố liên quan quyết định chất lượng lúa gạo ở mức phân
tử, đặc biệt hàm lượng amylose. Hiểu rõ bản chất cấu trúc chức năng của các yếu tố
quy định sự hình thành và biến đổi của amylose trong hạt gạo ở cấp độ phân tử sẽ cho
phép chúng ta, các nhà khoa học, nhà chọn giống ứng dụng vào nghiên cứu và chọn tạo
các giống mới có năng suất, chất lượng với hàm lượng amylose hợp lý. Dựa trên cơ sở
đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử phát
hiện gen quy định hàm lượng amylose ở lúa”
Mục đích và yêu cầu
- Khảo sát đánh giá một số chỉ tiêu cơ bản liên quan đến hàm lượng amylose của các
giống địa phương.
- Xác định gen waxy quy định hàm lượng amylase ở hạt gạo bằng maker phân tử.
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Các nghiên cứu đã chỉ ra một số enzyme chủ yếu tham gia tổng hợp tinh bột:
ADP glucophosphate synthetase (AGPase) hoạt hoá glucose 1 phosphate thành ADP
glucose (Pressis et al 1991). Granule – bound starch synthase (GBSS) gắn các ADP –
glucose vào đoạn mồi bắt đầu từ đầu không khử bằng liên kết 1-4 glycozid. Enzym
SBE cắt chuỗi liên kết 1-4 glucan và tạo liên kết α – (1-6)glucan tạo nên các phân tử
amylopectin. Enzyme Ganule bound starch synthase GBSS được mã hoá bởi gene Wx ở
nhiễm sắc thể số 6 (Okagaki wessler 1988). Soluble starch synthase (SSS) cũng có tác
động đến sự tạo mạch nhánh. Tuy nhiên SBE có vai trò chủ yếu tới sự tổng hợp
amylopectin
Trình tự của gene Wx trên giống O. Sativa (Japonica Heng-feng) dài 5499 bp

gồm 14 Exon, 13 Intron (Wang, et al 1990); Trên cơ sở hàm lượng GBSS trong các loài
non-Waxy, đã tìm thấy 2 alen Waxy là Wx
a
, Wx
b
lần lượt trên loài phụ Indica và
Japonica, còn ở lúa nếp là alen lặn wx (Sano 1980). Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra
1
rằng trên locus Wx có ít nhất 3 alen có chức năng khác nhau Wx
a
, Wx
b
, wx lần lượt
trong các loài Indica, Japonica và lúa nếp (Sano, 1984).
Khi so sánh giữa 2 alen Wx
a
và Wx
b
Y. Sano, M.Kasumata (1986)

thấy rằng Wx
a
tăng cường hoạt động của GBSS, do đó làm tăng hàm lượng amylose trong nội nhũ hạt
hơn so với Wx
b
. So sánh trình tự Wx
b
và Wx
a
cho thấy có sự thay thế một nu G bởi T

tại vị trí cắt nối intron 1 (trình tự cắt nối từ đầu 5’ của intron 1 của Wx
a
là AGGTATA,
của Wx
b
là AGTTATA). Kết quả làm giảm hàm lượng mRNA thành thục dẫn đến giảm
GBSS tạo thành, từ đó giảm hàm lượng amylose (Sano 1984, Hirano 1998).
Hiro- Yuki Hirano và cs (1998) sử dụng tế bào trần
để nghiên cứu chức năng gen waxy thông qua sự biểu hiện
của gen gus, kết hợp phân tích Nothern blot. Kết quả cho
thấy với loài mang gen Wx
a
có quá trình sao mã cao và gen
GUS hoạt động mạnh, với loài mang gene Wx
b
thì cho mức
hoàn thành quá trình sao mã giảm và gene GUS hoạt động
yếu. Trên cơ sở đó tác giả đã phân các loài lúa theo mức tiến
hoá được thể hiện ở hình 9. Hai loài O. barthii và O.
Rufipogon đều có kiểu gene Wx
a
, hàm lượng amylose cao,
được hình thành từ tổ tiên hoang dại của chúng cũng mang
gene Wx
a
và cho hàm lượng amylase cao. Loài phụ O.
glaberrima mang gene Wa
a
được tiến hóa từ O. barthii. Hai
loài phụ O. sativa indica và O. sativa japonica có tổ tiên là O.

Rufipogon, nhưng indica mang gene Wx
a
với hàm lượng
amylose cao còn loài japonica mang kiểu gen có chứa đột
biến Wx
b
cho hàm lượng amylase trung bình.
Khi xác định trình tự lặp TC (TC repeats) Hirano và cs sử dụng SSR và nhân lên
trình tự microsatellite DNA có chứa trình vùng nu đột biến ở đầu 5
’
intron 1. Hình 6
2
Tại Việt Nam, các nhà chọn giống ở đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng MAS
trong chọn giống lúa có hàm lượng amylose thấp và trung bình trên cơ sở ứng dụng
microsatellite marker liên kết rất chặt với gen Waxy (Nguyễn Thị Lang, 2004 )
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Vật liệu nghiên cứu: Sử dụng 40 giống lúa địa phương được lưu giữ trong tập đoàn
giống của khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Nghiệp –Hà Nội.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng gạo của một số giống lúa địa phương:
nhiệt hoá hồ, độ bền gel, và hàm lượng amylose.
3.2.2.Sử dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen quy định hàm lượng amylose của một
số giống địa phương.
3.3. phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng gạo
Nhiệt hoá hồ
Lấy 6 hạt gạo đã xát trắng, không có vết nứt, gãy, sắp vào đĩa petri. Cho vào mỗi
đĩa 10 ml dung dịch KOH 1.7%, đậy nắp và để trong 23 giờ ở nhiệt độ 30
o
C. Nhiệt trở hồ

được xác định bằng mức lan rộng và độ trong suốt của gạo sau khi xử lý (theo phương
pháp của Little và cs). Đánh giá nhiệt hoá hồ và độ phân huỷ theo thang điểm IRRI.
(1996)
Phân tích độ bên gel (gel cosistency)
Lấy 100 mg bột cho vào ống nghiệm, cho vào 0.2 ml Ethanol 95% có chứa
0.025% thymol blue, 2ml KOH 0.2N và lắc đều. Đậy ống nghiệm và đem chưng cách
thuỷ trong 8 phút rồi lấy ra, để yên 5 phút, sau đó làm lạnh bằng nước đá trong 20 phút.
Để ống nghiệm nằm ngang cho gel chảy ra từ từ và để 1giờ đến khi gel đặc lại, đo chiều
dài gel (theo phương pháp của N. Dela Cruz và G.S. Khush). Phân cấp độ bền gel theo
thang điểm của IRRI (1996)
Phân tích hàm lượng amylose
3
Định lượng amylose theo phương pháp của H. Seko, 2003: hạt lúa được bóc vỏ,
xát trắng, nghiền nhỏ. Lấy 100 mg bột đã nghiền, bổ sung vào 1ml Ethanol 95%, 9 ml
NaOH 1N. Đun sôi ở 100
o
C trong 10 phút và định mức cho đủ 100 ml. Lấy 5 ml dung
dịch hoà tan, cho thêm 1 ml CH
3
COOH 1M, 2 ml dung dịch iodine. Định mức cho đủ
100 ml, giữ ấm ở 30
o
C trong thời gian 20 phút rồi đo OD ở bước sóng 620 nm trên máy
đo quang phổ và đọc giá trị. Đối chiếu bảng quy đổi tìm ra hàm lượng amylose. Phân
nhóm hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn IRRI (1988)
3.3.2. Tách chiết ADN tổng số
2 cm mẫu lá non thu vào buổi sáng được cắt nhỏ và nghiền với 400 µl dịch chiết
(50mM Tris-HCl pH8.0, 25mM EDTA, 300mM NaCl và 1%SDS) cho tới khi thành dịch
màu xanh lá cây. Bổ sung 400µl dịch chiết vào cối rồi chuyển sang ống eppendorf. Thêm
700 µl dung dịch phenol: chloroform: Isoamyalcohol (25:24:1), ly tâm và thu dịch nổi.

Tủa ADN bằng ethanol 99,9%. Thu tủa và hoà trong TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM
EDTA pH 8.0).
3.3.3. Phương pháp xác định gen Wx bằng kỹ thuật PCR
Chúng tôi sử dụng cặp mồi PCR-AccI CAPS marker được thiết kế bởi Cai và cs (
2002), mồi sẽ được gắn và nhân lên một đoạn 530bp có chứa trình tự vùng xảy ra đột
biến thay nu G bởi nu T ở vị trí cắt 5
’
intron1 .
Trình tự primer PCR-AccI CAPS marker (Cai et al, 2002)
Tên mồi Trình tự
Forward primer(Wx-F) 5’-gcttcacttctctgcttgtg-3’
Reverse primer(Wx-R) 5’-atgatttaacgagttgaa-3’
Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR với thể tích 25μl gồm: Thành phần phản ứng PCR
với thể tích 25μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X,
2.5 μl MgCl
2
25mM, 0.5 μldNTP 10mM, 1μl Wx-F, 1μl Wx-R, 15.3μl nuclerase free
water và 1μl DNA tổng số. Mỗi mẫu được cho vào ống eppendorf có tên tương ứng, đưa
lên máy chạy PCR, kiểm tra và thiết lập chu kỳ hoạt động: 95
o
C trong 3’; 35 chu kỳ:
94
o
C – 45’’, 58
o
C

– 45” ,72
o
C- 45” và 72

o
C trong 10 phút. Sau khi chạy phản ứng PCR
đem điện di trên gel agarose 1% phát hiện gene.
PHẦN IV. KẾT QUẢ
4
4.1. Đánh giá nhiệt hoá hồ
Nhiệt độ hoá hồ là khoảng nhiệt độ mà hạt tinh bột bắt đầu trương phồng lên
không thuận nghịch trong nước nóng. Trên cơ sở phương pháp của Little và cs, chúng tôi
đã tiến hành đánh giá và tìm được khoảng nhiệt độ hoá hồ của các giống theo tiêu chuẩn
của IRRI. Gạo của những giống có nhiệt độ hoá hồ cao sẽ không bị phân huỷ trong dd
KOH, gạo của những giống có nhiệt độ hoá hồ trung bình sẽ bị phân hủy một phần. Kết
quả được trình bày ở bảng 1.1(lúa tẻ) và bảng 1.2(lúa nếp)
Bảng 1.1. Bảng kết quả đánh giá nhiệt hoá hồ
TT
Tên
giống
Độ phân huỷ
trong kiềm Nhiệt hoá hồ TT
Tên
giống
Độ phân huỷ
trong kiềm Nhiệt hoá hồ
1 645 Thấp Cao (>75
o
C) 14 10172 Thấp Cao (>75
o
C)
2 10059 Cao Thấp (<69
o
C) 15 10175 Thấp Cao (>75

o
C)
3 10063 Thấp Cao (>75
o
C) 16 10243 Thấp Cao (>75
oC
)
4 10067 Cao Thấp (<69
o
C) 17 10244 Thấp Cao (>75
o
C)
5 10069 Thấp Cao (>75
o
C) 18 10246 Thấp Cao (>75
oC
)
6 10091 Cao Thấp (<69
o
C) 19 10247 Thấp Cao (>75
o
C)
7 10101 Cao Thấp (<69
o
C) 20 10248 Thấp Cao (>75
o
C)
8 10111 Thấp Cao (>75
o
C) 21 10259 Thấp Cao (>75

o
C)
9 10115 Thấp Cao (>75
o
C) 22 10279 TB TB (70-74
o
C)
10 10119 Cao Thấp (<69
o
C) 23 10715 Cao Thấp (<69
o
C)
11 10120 Cao Thấp (<69
o
C) 24 10716 Cao Thấp (<69
o
C)
12 10122 Cao Thấp (<69
o
C) 25 CL645 Cao Thấp (<69
o
C)
13 10164 Thấp Cao (>75
o
C) 26 Kim32B Thấp Cao (>75
o
C)
Bảng 1.2. Kết quả đánh giá nhiệt hoá hồ của các giống nếp địa phương
TT
Tên

giống
Độ phân huỷ
trong kiềm Nhiệt hoá hồ TT
Tên
giống
Độ phân huỷ
trong kiềm Nhiệt hoá hồ
1 10057 TB TB (70-74
o
C) 8 10637 TB TB (70-74
o
C)
2 10103 Cao Thấp (<69
o
C) 9 10640 Cao Thấp (<69
o
C)
3 10118 TB TB (70-74
o
C) 10 10641 Cao Thấp (<69
o
C)
4 10167 Cao Thấp (<69
o
C) 11 10668 Cao Thấp (<69
o
C)
5 10169 TB TB (70-74
o
C) 12 10675 TB TB (70-74

o
C)
6 10171 Cao Thấp (<69
o
C) 13 10685 TB TB (70-74
o
C)
7 10173 TB TB (70-74
o
C) 14 10698 TB TB (70-74
o
C)
Kết quả đánh giá trên 26 giống lúa tẻ địa phương cho thấy có 15 giống có độ phân
huỷ trong kiềm thấp và nhiệt độ hoá hồ cao đó là: 10063; 10069; 10164;… , và 10 giống
5