Công nghệ protein tái tổ hợp

Recombinant
Recombinant human
human follicle
follicle stimulating
stimulating hormone
hormone -- rhFSH
rhFSH


Nội dung

I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
VII.

Giới thiệu và phân lập gen mã hóa rhFSH
Lựa chọn dòng tế bào biểu hiện
Lựa chọn vector biểu hiện
Đưa gen đặc tính vào vector biểu hiện
Chuyển vector vào tế bào CHO-44 và nuôi cấy
Tách và tinh chế rhFSH
Bảo quản rhFSH


Giới thiệu và PL gen mã hóa rhFSH



Follicle-stimulating hormone (FSH): Ở người, được tổng hợp và tiết ra ở tuyến yên trước




Ở nữ, Kích thích sự phát triển của nang nỗn




In vitro fertilization

Ở nam, Đóng vai trị quan trọng trong q trình sinh tinh

Có trong thành phần quan trọng của thuốc kích trứng ở nữ và kích thích sự sinh tinh ở nam


Giới thiệu và PL gen mã hóa rhFSH


Giới thiệu và PL gen mã hóa rhFSH



Những gen mã hóa cho 2 tiểu đơn vị α và β của rhFSH được lấy từ thư viện
DNA của tế bào gan thai nhi người




Gen mã hóa cho tiểu đơn vị α nằm ở  6q14.3
Gen mã hóa cho tiểu đơn vị β nằm ở  11p13


Lựa chọn dòng tế bào biểu hiện


Lựa chọn dòng tế bào biểu hiện







Chinese Hamster Ovary (CHO) cell lines
Dễ nuôi cấy & năng suất cao
Promoter mạnh
HT biến đổi sau dịch mã tương đồng như với người
Các công cụ kỹ thuật gen đã được tối ưu cho CHO cell lines
Được sự chấp nhận của FDA


Lựa chọn vector biểu hiện


Lựa chọn vector biểu hiện



α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4



β-FSH cDNA vào pCMV6-XL5


Lựa chọn vector biểu hiện


Đưa α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4


Đưa α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4

Trình tự alpha

ATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTATCTTTCTGGTCACATTGTCGGTGTTTCTGCATGTTCTCCATTCCGCTCCTGATGTGCAGGATTGCCCAGAATGCACGCTACAGGAAAACCCATTCTTCTCCC
AGCCGGGTGCCCCAATACTTCAGTGCATGGGCTGCTGCTTCTCTAGAGCATATCCCACTCCACTAAGGTCCAAGAAGACGATGTTGGTCCAAAAGAACGTCACCTCAGAGTCCACTTGCTGTGTAGCT
AAATCATATAACAGGGTCACAGTAATGGGGGGTTTCAAAGTGGAGAACCACACGGCGTGCCACTGCAGTACTTGTTATTATCACAAATCTTAA


Đưa α-FSH cDNA vào pCMV6-XL4
OLIGO

start len

tm

gc% any_th 3'_th hairpin seq

LEFT PRIMER

1 29 59.22 31.03

RIGHT PRIMER

351 30 58.45 26.67

Not I

0.00 0.00

0.00 ATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTAT

0.00 0.00 38.67 TTAAGATTTGTGATAATAACAAGTACTGCA

FW: AATATAGCGGCCGCATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTAT

Hind III RV: TTATATAAGCTTTTAAGATTTGTGATAATAACAAGTACTGCA

GGCCGCATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTATXXXXTGCAGTACTTGTTATTATCACAAATCTTAAA
CGTACCTAATGATGTCTTTTATACGTCGATAXXXXACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTTTCGA

CGACTCACTATAGGGC

AGCTTGTCGACTCTAGA

GCTGAGTGATATCCCGCCGG

ACAGCTGAGATCT


Đưa β-FSH cDNA vào pCMV6-XL5


Đưa β-FSH cDNA vào pCMV6-XL5

Trình tự Beta

ATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTCCTTTTCTGTTGCTGGAAAGCAATCTGCTGCAATAGCTGTGAGCTGAC
CAACATCACCATTGCAATAGAGAAAGAAGAATGTCGTTTCTGCATAAGCATCAACACCACTTGGTGTGCT
GGCTACTGCTACACCAGGGATCTGGTGTATAAGGACCCAGCCAGGCCCAAAATCCAGAAAACATGTACCT
TCAAGGAACTGGTATACGAAACAGTGAGAGTGCCCGGCTGTGCTCACCATGCAGATTCCTTGTATACATA
CCCAGTGGCCACCCAGTGTCACTGTGGCAAGTGTGACAGCGACAGCACTGATTGTACTGTGCGAGGCCTG
GGGCCCAGCTACTGCTCCTTTGGTGAAATGAAAGAATAA


Đưa β-FSH cDNA vào pCMV6-XL5
OLIGO

start len

LEFT PRIMER
RIGHT PRIMER

tm

gc% any

3' seq

1

25

61.19

40.00

6.00

4.00 ATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTCC

390

26

62.83

34.62

4.00

2.00 TTATTCTTTCATTTCACCAAAGGAGC

PRODUCT SIZE: 390, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

Not1-FW: GCATATGCGGCCGCATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTCC

Xba1-RV: TTGCATTCTAGATTATTCTTTCATTTCACCAAAGGAGC

GGCCGCATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTCCxxxxxGCTCCTTTGGTGAAATGAAAGAATAAT
CGTACTTCTGTGAGGTCAAAAAGAAGGxxxxxCGAGGAAACCACTTTACTTTCTTATTAGATC

CTCACTATAGGGC
GAGTGATATCCCGCCGG

CTAGATTGCGGCCGCGGT
TAACGCCGGCGCCA


Khuếch đại vector
Sử dụng E.coli DH5α


Khuếch đại vector

2 µl pOptivec TOPO + Chemically Competent E. coli

Ủ vector/E.coli trên đá 5-30 phút

Thêm 250 µL vào dd S.O.C. ở nhiệt độ phòng

Giữ chặt và lắc tube theo chiều ngang ở 200 rpm trong 37℃
trong 1 h

Sốc nhiệt E.coli 30 giây tại 42℃

Trải 50 µL dd lên đĩa LB được làm ấm và ủ qua đêm ở

37℃

Chuyển ngay tube lên đá


Khuếch đại vector
Tách vector khỏi E.coli

Giải trình tự : CMV forward + EMCV IRES reverse primers

CB vector: làm sạch, tiệt trùng, loại bỏ chất gây nhiễm

Tạo vector dạng thẳng: Pvu l


Chuyển vector vào tế bào CHO-DG44


Chuyển vector vào tế bào CHO-DG44

Cytogenetic appearance of FSH expression vector in metaphase spread of CHO/dhfr- genome. White arrows indicate the integration site of recombinant construct at transfected cells


Nuôi cấy tế bào CHO – DG44

 Điều kiện nuôi cấy









Môi trường nuôi cấy huyền phù với 0,18% Pluronic F-68 + 4mM L- Glutamine + 250 mM MTX
Nhiệt độ: 37 ℃, độ ẩm: 80%, CO2: 8%
Tốc độ quay 130 rpm, thể tích bình 123 mL
Thay đổi mơi trường sau 3-4 ngày
Thu hoạch sau 23-32 ngày
Chu kỳ nuôi cấy: 6 tháng
Xác định mật độ và tỷ lệ tế bào sống bằng công cụ Vi-Cell XR (Beckman Coulter, Fullerton, CA), mật độ phù hợp cho ni cấy : 2.5 – 4.0 × 10^6
cells/ml


Nuôi cấy tế bào CHO – DG44


Nuôi cấy tế bào CHO – DG44


Năng suất



Năng suất tạo ra rh FSH từ ni cấy các dịng tế bào động vật khác và sử dụng các hệ thống vector biểu hiện khác là: 0.5–1.5 pg/cell/day ( Sản xuất
thương mại )



Ngay cả khi sử dụng ni cấy dịng tế bào CHO + HT vector khác cũng cho kết quả hạn chế: khoảng 0.32 pg/cell/day ( được cho có khả năng biểu hiện

cao)

CHO-DG44/dhfr- + Bicistronic vector : có thể lên tới 12.3±1.7 pg/cell/day


Tách và tinh chế rhFSH
Loại bỏ tế bào
(Ly tâm)

Xử lý dịch mơi trường ni cấy
(Lọc với màng có cut off 10kDa)
Loại bỏ hầu hết các tạp chất
Sắc ký trao đổi Anion
(Capture step)

Sắc ký kỵ nước 1

Loại bỏ tạp chất phân tử nhỏ, cô đặc,
Sắc ký kỵ nước 2

Nanofiltration và ultrafiltration & thay đổi buffer

polishing