PPCR TRONG CHUẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT CÁC SUBTYPE AIV TYPE A docx

LOGO
PCR TRONG CHUN ĐON PHÂN
BIT CC SUBTYPE AIV TYPE A
Phm Thnh Thi
Ni dung
1. Gii thiu về AIV type A
2. Phương php chun đon
LOGO
Gii thiu về
Avian Influenza Virus Type A
 AIV thuộc họ Orthomyxoviridae. C đường kính vỏ
0,08-0,12 μm; nhân l chui RNA đơn. Họ
Orthomyxoviridae gồm c 4 nhm virus l:
 Nhm virus type A: gây bệnh cho mọi loi chim, 1
số động vật c vú v cả con người.
 Nhm virus cúm type B: chỉ gây bệnh cho người.
 Nhm virus cúm type C: gây bệnh cho người, lợn.
 Nhm Thogotovirus.
Tên gi
Cu to AIV
Các kháng nguyên bên trong (proreins M1 v NP) l các proteins đặc hiệu nhm
được dùng để xác định xem virus thuộc type A, B hay C.
Các kháng nguyên bên ngoi (HA v NA) đa dạng hơn v l các kháng nguyên
c tính đặc hiệu subtype.
Jorge Duitama et al, 2009
Phân loi AIV
 Cúm gia cm độc lc thp (LPAI) xảy ra tự nhiên  các loi
chim. Bệnh không biểu hiện triệu chng hoặc rt nhỏ. Nhng
dng virus ny ít gây nguy hiểm cho sc khe con người.
Dng LPAI H5 và H7 c khả năng bin chng thnh HPAI.

 Cúm gia cm độc lc cao (HPAI): sau 10 ngy tiêm nhim
cho g, AIV phải lm cht 75-100% phôi g thc nghiệm.
Sau khi phân lập từ g bệnh, AIV phát triển tốt v gây bệnh
tích tế bo trong môi trường nuôi cy không c trypsin. Đối
với chng H5 v H7 nu mọc tốt trên môi trường không c
trypsin, trnh t acidamine trùng với trnh t acidamine ca
chng độc lc cao th được xác định l chng độc lc cao.
Ti tổ hp gene  AIV
Y. Guan, 2002
Nu 2 chng virus cúm đồng thời xâm
nhim cùng 1 t bo thì c thể xảy ra
hiện tượng tái tổ hợp gene (genetic
recombination); khi đ sẽ tạo ra các
virus mới c các kháng nguyên kt hợp
Sự thay đi genotype ca H5N1 từ khi phát
hiện vo năm 1997 đn năm 2001. Tám đoạn
gene ca AIV được xp theo thứ tự từ trên
xuống PB2, PB1, PA, HA, NP, M, và NS.
Các chng virus: H9N2; H6N1; H5N1;
H9N2/ Y280; và H5N11/97. (?) l genotype
AIV chưa từng được phân lập từ gia cm 
Hong Kong.
Subtype AIV type A
 H1N1
 H5N1
 H2N2
 H3N2
 H7N2
 H7N3
 H7N7

 H9N2
LOGO
Phương php chun đon
subtype AIV type A
Dennis A. Senne
LOGO
RT-PCR
• Cơ quan hoặc mô (no, khí quản, phi,…)
• Các loại dịch (phi, họng, mi,…)
• Huyt thanh
Thu mu bệnh
phm
• Sử dng các Kit như: NucleoSpin RNA II,
Rneasy MiniKit,…
Tách chit RNA
• PCR buffer, MgCl2, dNTP, Primer, Rtase,…
Chun bị mu
chạy RT-PCR
• Tùy theo primer sử dng m c chu trnh
nhiệt khác nhau
Chạy RT-PCR
• Trên gel agrose, hoặc real time,…
Đọc kt quả
Chun đon H5N1
WHO, 2007
rRT-PCR
Đây l phương pháp rt nhanh, 28 mu bệnh phm đã được kiểm tra trong
khoảng 3h.
Giới hạn phát hiện ca cặp M primer l 10

3
gene copies. Cả hai cặp primer H5
và H7 đu c giới hạn phát hiện l 10
3
đn 10
4
gene copies
Erica Spackman et al, 2002
Một nghiên cu nhm xác định subtype H5 và H7, tác giả đã sử dng các
cặp primer và probe sau
rRT-PCR
Một nghiên cu khác trên subtype H5, H7 và H9
G. Cattoli, I. Monne. 2008
rRT-PCR
G. Cattoli, I. Monne. 2008
mRT-PCR
 Trong nghiên cu ny, Pitirat Boonsuk v cs (2008) đ phát triển
kỹ thuật Multiplex RT-PCR trong việc phát hiện các subtype H1,
H3 và H5 ca AIV type A.
mRT-PCR
 A.Kt quả điện di trên gel agarose với mu H1, H3 v H5; Mix
v chng âm (N)
 B.Kt quả kiểm tra độ nhạy phương pháp.
mRT-PCR
 Kt quả kiểm tra độ chuyên biệt.
Multiplex RT – nested PCR
 Phương pháp ny được nghiên cu để phát hiện AIV type
A subtype H1N1 v subtype H3N2 v AIV type B.
Multiplex RT – nested PCR
 Độ nhạy ca phương pháp: đối với H1N1 th giới hạn phát hiện l

200pfu/ml, H3N2 l 14 pfu/ml v AIV type B l 4,5 pfu/ml. Trong
khi đ độ nhạy ca phương pháp one-step PCR l 1,1-2,1x10
3.