Công nghệ chế tạo sinh phẩm khuếch đại nucleic acid

CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM chẩn đốn
Cơng nghệ chế tạo Sinh phẩm khuếch đại Axit nucleic


NỘI DUNG
I.
II.

TỔNG QUAN VỀ AXIT NUCLEIC VÀ KHUẾCH ĐẠI AXITNUCLEIC
CÁC CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM KHUẾCH ĐẠI AXITLUCLEIC

2.1. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR
2.2. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM RT – PCR
2.3. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM MULTIPLEX – PCR
2.4 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM LAMP
III. SINH PHẨM Real time-PCR VÀ KIT XÉT NGHIỆM
TaqPath™ COVID-19 RNase P Combo Kit 2.0


I. tổng quan
Axit nucleic là một đại phân tử lưu trữ thông tin di
truyền của sinh vật sống. Các phân tử này được cấu
tạo bởi một chuỗi nucleotide dài được liên kết với nhau
bằng liên kết cộng hóa trị. Nucleotide bao gồm một
bazơ nitơ, một đường năm cacbon và một nhóm
phốt phát.
Hai

ví

dụ

về

axit

nucleic

bao

gồm

axit

deoxyribonucleic (hay được gọi là DNA ) và axit
ribonucleic (hay được gọi là RNA ). được tổ chức với
nhau bằng liên kết cộng hóa trị. Axit nucleic có thể
được tìm thấy trong nhân và tế bào chất của tế bào
.


Khuếch đại axit nucleic
Các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic lấy một lượng DNA hoặc RNA rất nhỏ, nhân chúng lên nhiều lần, và do đó có thể phát hiện dấu vết của một vi sinh
vật trong mẫu, tránh được sự cần thiết phải nuôi cấy. Những kỹ thuật này đặc biệt hữu ích cho các sinh vật khó ni cấy hoặc khó xác định bằng các
phương pháp khác (ví dụ như virus, vi khuẩn nội bào, nấm, mycobacteria, một số vi khuẩn khác) hoặc vi sinh vật có số lượng ít.

Phương pháp khuếch đại

Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation.

II. CÁC CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM KHUẾCH ĐẠI AXIT NUCLEIC


2.1 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR



Khái niệm: PCR là quá trình tổng hợp sợi DNA mới dựa trên DNA khuôn nhờ hoạt động xúc tác của enzyme DNA polymerase. Đến mức số lượng bản sao
của mục tiêu rất dễ phát hiện hoặc định lượng.


2.1 CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR

Mạch khn DNA

Ion Mg ++

o
72 C

DNA polymerase

4 loại nucleotide
5p

30s

30s

5p

2 đoạn mồi

dd đệm và nước


2.2 CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR

Mạch khn DNA

Ion Mg ++

Chứa vùng cần nhân bản, bất cứ loại DNA, không cần tinh sạch, không chưa chất ức chế DNA polmerase

Cofactor quan trọng của DNA polymerase, ổn định cấu trúc xoắn kép của DNA. Quá ít ezyme hoạt động yếu hoặc
không hoạt động, quá nhiều phản ứng không đặc hiệu : từ 0.5 to 3.5 mM

DNA polymerase

Kéo dài mạch DNA, thường là taq hoặc enzyme tương tự, chịu nhiệt, nồng độ 1 Unit/phản ứng

4 lại nucleotide

Thành phần cấu trúc lên mạch DNA A, T, G, C

2 đoạn mồi

Đặc hiệu cho 2 đầu đoạn gen (mồi ngược và mồi xuôi). Cần biết nhiệt độ nóng chảy ( phụ thuộc chiều dài, thành phần
GC… Chiều dài 15-30 nucleotide, nồng độ 0.1 – 1 uM

Dd đệm và nước

Môi trường hoạt động cho các thành phần còn lại, ổn định các thành phần. 500 mM KCl, 100 mL Tris-HCL, pH 8,3 .
Triton -x100 / Tween


2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR


Taq DNA polymersae





Thu nhận từ thermus aquaticus
Chịu nhiệt
Nhiệt độ tối ưu 72 độ
Chiều tổng hợp: 5’ to 3’


2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR

Hỗn hợp phản ứng được mix trong ống
eppendorf

Mẫu được đưa vào máy PCR

Sản phẩm PCR thu được sẽ
được điện di cùng mẫu đối
chứng

2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR

Vấn đề ngoại nhiễm

Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức đối với các phịng thí nghiệm sinh học phân tử. Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học đã có thể giải quyết vấn đề này một cách
khá hữu hiệu, đó là trong thành phần dNTP có bổ sung thêm một ít dUTP. Các sản phẩm PCR tạo ra sẽ luôn tồn tại một số vị trí là U thay vì T, các vị trí U này sẽ có thể xử
lý phân hủy bằng enzyme UNG. Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật (template) sẽ khơng chứa U, vì vậy ủ PCR mix với enzyme UNG trước khi PCR sẽ giúp phân cắt tồn bộ
các DNA ngoại nhiễm mà khơng ảnh hưởng đến template.


2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR



PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dịng hố gen, giải mã trình tự ADN…



Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus, các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum...).



Phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường tình dục (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia, Legionella,).



Phát hiện các tác nhân ni cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó



Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như S.aureus – MRSA, các vi khuẩn sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase...)



Xác định độc tố của vi sinh vật:



Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết.



Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư



Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)...

Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation.


2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM RT - PCR



Khái niệm: (RT-PCR) sử dụng mRNA thay vì DNA làm khn mẫu ban đầu. Đầu tiên,
enzyme phiên mã ngược sử dụng khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi DNA mạch đơn bổ
sung được gọi là cDNA trong một quá trình được gọi là phiên mã ngược . Tiếp theo, DNA

polymerase được sử dụng để chuyển cDNA sợi đơn thành DNA sợi kép . Các phân tử DNA
này hiện có thể được sử dụng làm khn mẫu cho phản ứng PCR  như bình thường

Xét nghiệm, phát hiện các sinh vật có vật chất di truyền không phải DNA


2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM RT - PCR


2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM RT - PCR
Thành phần phản ứng tương tự PCR, khác biệt ở sự bổ sung enzyme phiên mã ngược

Reverse transcriptase


2.2 CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM RT - PCR

Khn của RT-PCR là ARN, ARN này có thể nằm trong hỗn hợp ARN tổng số hoặc chỉ riêng
mARN.

Mồi (Primer) phổ biến hay dùng trong RT-PCR là oligo dT và mồi ngẫu nhiên, nó sẽ liên kết
bổ sung với khuôn ARN và làm điểm bắt đầu cho phản ứng tổng hợp ADN.

Anchored Oligo (dT)  20 Primer


2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM RT - PCR

Đây cũng là một trong những phương pháp được áp dụng nhiều nhất song song với test kháng thể (antibodies) để phục vụ cho truy vết và
xét nghiệm một sô loại virus như Zika, HIV, sởi,... nói chung cũng như SARS-CoV-2 đang hồnh hành gần đây nói riêng.

Measles morbillivirus (MeV)

Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation.


2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM multiplex - PCR



Khái niệm: Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm
khuếch đại nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCR. Nhiều trình tự sẽ
được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được
bổ sung vào cùng một ống phản ứng. Như một phương pháp cải tiến của phản
ứng PCR thơng thường. Phản ứng multiplex PCR có thể chia thành 2 loại:

•

 Phản ứng multiplex PCR dùng một khn
Phương pháp này sử dụng một loại khuôn khuếch đại các vùng gen cụ thể có
chứa trong sợi khn.

•

Phản ứng multiplex PCR dùng nhiều khn
Có thể thực hiện duy nhất một phản ứng với nhiều loại khn và nhiều cặp
mồi. Tuy nhiên có thể dẫn đến việc liên kết chéo giữa các mồi với nhau và có
thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này và khuôn kia.

2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM multiplex - PCR
Thành phần phản ứng

Nồng độ mồi
Nồng độ từ 0.1 µM đến 0.5 µM. Có thể điều chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện
phản ứng
Nồng độ dNTP và MgCl2
Nồng độ MgCl2 nên giữ cố định ở mức 2 mM. Nồng độ thích hợp nhất của từng loại dNTP là
từ 0.2 mM đến 0.4 mM.
Sự cân bằng dNTP/ MgCl2
Để làm việc hiệu quả, 0.2 mM dNTP kết hợp với 1.5 đến 2 mM MgCl2 là hợp lí.

Nồng độ dung dịch đệm (buffer)
Dùng đệm nồng độ 2X sẽ cải thiện hiệu quả của phản ứng multiplex PCR

Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase
nồng độ tối ưu đối với enzyme này 2.5U/ 50µl dịch phản ứng


2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM multiplex - PCR
Các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA
Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều phải được hỗ trợ bởi các chất phụ gia như DMSO (Dimethyl sulfoxit), glycerol, formamide và betaine(Trimethyl
glycine). Những phụ gia này giúp làm lỏng chuỗi ADN, do đó ADN dễ dàng bị biến tính bằng nhiệt nhanh hơn. Tuy nhiên, trong các phản ứng multiplex PCR, DMSO và
glycerol lại gây ra sự cạnh tranh. Vì vậy, nồng độ của các chất này cũng nên được xem xét kiểm tra chặt chẽ. Nồng độ BSA (Bovine serum albumin )đạt tới 0.8 µg/µl sẽ làm
tăng hiệu quả phản ứng hơn nhiều so với việc bổ sung DMSO và glycerol.


2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM multiplex - PCR
Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố chính quyết định đến sự thành cơng của phản ứng multiplex PCR

Mồi cho multiplex PCR
Công thức đơn giản:
Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T)
Công thức chứa nồng độ muối:

Chiều dài mồi

Tm = 81.5 +16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%(G+C)) – 675/n
Trong đó: [Na+] là nồng độ phân tử muối, n là số base của mồi.

Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm)

Nhiệt độ gắn mồi

Ta = 0.3 x Tm(Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9

Độ đặc hiệu

Tránh hình thành dimer primer

Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation.


2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM multiplex - PCR

Thiết kế mồi
Phần mền PrimerPlex
PrimerPlex là 1 cơng cụ hữu ích cho quá trình thiết kế mồi đối với phản ứng multiplex PCR. Chương trình này giúp kiểm tra các oligo xem chúng có phản ứng chéo với nhau hay khơng, đồng thời
tăng sự thích ứng giữa các mồi. Q trình này phân tích hàng triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, sau đó chương trình đưa ra danh sách các mồi để người thiết kế lựa chọn.

T
DNA Primersae

A
G

Rửa

A

T

A

T

C

Rửa

G
A

Rửa

A

T

G

C

A

T

G

C

Rửa

A


2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM multiplex - PCR
Nghiên cứu pháp y, xác định kiểu gen SNP (Single nucleotide polymorphisms)
Phát hiện mầm bệnh
Phát hiện GMO (sinh vật biến đổi gen)
Phân tích thực phẩm
Phân tích đột biến và đa hình

b
Agents
HPV (consensus)

Target

Amplicon size (bp)

L1

145

Phân tích xóa gen
Định lượng mẫu

Primers

Sequence (5′ to 3′)

(GP5)

TTTGTTACTGTGGTAGATAC

(GP6)

TGATTTACAGTTTATTTTTC

(GP11)

TTTATCACAGTGGTAGACAA

(GP12)

TGAAATTTCTTTTATATTAC

(SK38)

ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT

(SK39)

TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC

(SN01)

TCAATGCCGTGGCCTACTAC

(SN04)

TTCCCTGTCAGGTATGATTG

(SN02)

TTGGAATTCAGGCAATACGGGGCCAAAGCA

(SN03)

TTGTCTTAGATCGATTTCAGCCTTGA

Reference
Snijders et al. (1990)

Phân tích liên kết
Phát hiện RNA
HIV-I

HCV

gag

C-100

114

660

Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation.

Nedjar et al. (1991)


2.4 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM LAMP

Khái niệm: Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) được giới thiệu lần đầu bởi
Notomi vào năm 2000. LAMP sử dụng 2 bộ mồi được thiết kế đặc biệt được gọi là mồi bên
trong và mồi bên ngồi và một enzyme DNA polymerase với hoạt tính tách mạch.

Phản ứng LAMP khơng u cầu chu trình nhiệt vì sự khuếch đại được thực hiện đẳng
o
nhiệt ở giữa 60 và 65 C.